（分析化学专业论文）基于核酸的荧光生物传感器研究.pdf

蛳 x ， s t u d yo nf l u o r e s c e n c eb i o s e n s o rb a s e do n f b y g u ol e i b s ( x i n y a n gn o r m a lu n i v e r s i t y ) 2 0 0 8 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t o ro fs c i e n c e a n a l y t i c a lc h e m i s t r y 1 n t h eg r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o rc h ux i a m a y , 2 0 1 1 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：熏p 磊 e im ：刀i 年么月乡日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密回。 ( 请在以上相应方框内打“、”) 作者签名： 导师签名： 日期：矽年石月；日 日期：劫1 年名月3 日 摘要 生物传感器的研究已经成为分析化学和生物化学领域中一个非常重要和令人感兴 趣的课题，人们对此作出了深入广泛的研究。荧光化学传感器是依靠荧光信号为检测手 段，通常有荧光的增强、淬灭或者发射波长的移动，具有方便快捷、较高的灵敏度与选 择性、可以利用光纤技术实现距离实时检测等优点，已成为光化学传感器技术研究者们 倍感兴趣的研究领域。 蛋白质是一类重要的生物标志物，许多肿瘤生物标志物就属于酶类、抗原类物质及 微球蛋白、铁蛋白等蛋白类物质。在食品中非法加入三聚氰胺引起的危害已经引起了社 会的关注。因为三聚氰胺的含氮量达到6 6 ，所以关于非法在食品中添加三聚氰胺增加 食品含氮量的报道常常见于报端，发展快速简单的检测实际样品中三聚氰胺含量的方法 是比较有用的。环境中的重金属离子难以被微生物降解，可通过各种途径进入人体并在 体内长期积累，对身体造成危害，严重的将会危及生命。因此，建立简单、快捷、灵敏、 实用的检测方法具有重要的意义。在本研究论文中，主要发展了几种荧光生物传感器。 具体内容如下： ( 1 ) 在本章中我们报道了一种基于小分子d n a 复合物末端保护原理检测蛋白的方 法。首先小分子修饰d n a 链，通过小分子和相应结合蛋白的特异性识别和r c a 反应和 e x o i i i 的放大实现对叶酸结合蛋白的检测。反应过程均在均相中进行，d n a 链上的小分 子和蛋白结合后，在溶液中加入具有消化d n a 单链的e x oi ，得到保护的d n a 就不能被 水解；接下来引入环形探针，模板链和环形探针进行杂交反应后，加入大肠杆菌连结酶 和连接缓冲液进行连结；加入引物，d n t p s 和b s t 聚合酶，r c a 反应开始启动，生成了一 条具有重复序列的单链；最后加入一条和r c a 产物其中一段序列互补的t a q m a n 探针( 荧 光基团和淬灭基团比较靠近，单独存在时没有荧光) 和e x o l i i ，r c a 产物和t a q m a n 探针杂 交后，e x o i i 开始水解杂交上去的t a q m a n 探针，从而使得荧光基团和淬灭基团分离开来， 溶液产生荧光。可以根据荧光强度定量叶酸结合蛋白的浓度。 ( 2 ) 在本章中建立了一种利用核酸染料s y b rg r e e nl 快速检测三聚氰胺( m e l a m i n e ) 的传 感器技术。传感器构建的基础是三聚氰胺诱使单链改变构型变成双链，在双链核酸染料 的存在下引起荧光的差异到达检测分析物的目的。s y b rg r e e ni 是一种双链核酸染料，和 单链的结合力很弱，所以如果缓冲液只含有s y b rg r e e ni f f l p o l y t 2 4 时，溶液的荧光强度是 很弱的。在加入目标物的情况下，三聚氰胺和胸腺嘧啶之间由于氢键的形成，从而可以 形成t - m e l a m i e n t 的构象，导致聚t 链从单链构型改变其形态形成发夹的结构，染料可 以很好的嵌入双链中，溶液可产生强荧光。检测下限低于国际标准的食品中三聚氰胺含 量。这种检测方法简单，快速。 ( 3 ) 因为银离子对水中生物有毒害作用，而且其广泛应用于电解工业、摄影、成像工 业和医药。研究工作者已经利用有机荧光物质和量子点发展了快速、简易的化学传感器 基于核酸的荧光生物传感器研究 检测水中的银离子，但是这些传感器有些限制，比如比较低的水溶性、不够灵敏。在第 四章中报道了一种基于银离子( a 幽和胞嘧啶( c ) 之间的特异性识别的无标记的荧光检测 方法，用来检测银离子。c - a g + c 结构的形成诱使富c 的d n a 链折叠，引入s y b rg r e e ni 后，即可得到明显增强的荧光信号。该方法简单、快速、成本低。 关键词：荧光生物传感器：滚环扩增；三聚氰胺；s y b rg r e e ni ；银离子 i i i a b s t r a c t t h ed e s i g no fb i o s e n s o r si sa ni m p o r t a n ta n di n t e r e s t i n gs u b j e c ti na n a l y t i c a lc h e m i s t r y a n db i o c h e m i s t r ya n dh a sb e e ne x t e n s i v e l ys t u d i e d f l u o r e s c e n tc h e m i c a ls e n s o rr e l y so n f l u o r e s c e n c es i g n a l sa st h ed e t e c t i o nm e t h o d s ，i n c l u d i n gf l u o s c e n c ee n h a n c e m e n t ，q u e n c h i n g o rm i g r a t i o no fe m i s s i o nw a v e l e n g t h w i t hc o n v e n t i o n ，h i g hs e n s i t i v i t y ，s e l e c t i v i t ya n d r e a l - t i m ed e t e c t i o nm a k i n gu s eo fo p t i c a lf i b e rt e c h n o l o g y , t h i sk i n do fb i o s e n s o rh a sb e c o m e af i e l do fi n t e r e s to fp h o t o c h e m i c a ls e n s o rr e s e a r c h e r s p r o t e i ni sat y p eo f i m p o r t a n tb i o m a r k e r s f o re x a m p l e ，m a n yt u m o rm a r k e r sa r ee n z y m e ， a n t i g e n , g l o b a lp r o t e i n ，f e r r i t i na n dp r o t e i nl i k e t h eh a z a r d sc a u s e db yi l l e g a l l ya d d i n g m e l a m i n ei n t of o o dh a v eb e e nt h ec o n c e r no ft h ec o m m u n i t yi nr e c e n ty e a r s b e c a u s e m e l a m i n ec o n t a i n s6 6 n i t r o g e nb ym a s s t h e r ea r ef r e q u e n tr e p o r t st h a tm e l a m i n eh a sb e e n i l l e g a l l ya d d e di n t om i l kp r o d u c t sa n df e e d si no r d e rt oi n c r e a s ea p p a r e n tp r o t e i nc o n t e n t t h e r e f o r e ，i ti sv e r yu s e f u lt od e v e l o ps i m p l e ，r a p i da n ds e n s i t i v em e t h o d sf o rt h ed e t e c t i o no f m e l a m i n ei n r e a ls a m p l e s ，h e a v ym e t a l si no u re n v i r o n m e n tc a nh a r d l yb ed e g r a d a t e d ， a c c u m u l a t i n gi nh u m a n sb o d yv i av a r i o u s a p p r o a c h e s ，d o i n gh a r mt oh u m a n ，e v e n e n d a n g e r i n gw h e ns e r i o u s l y t h e r e f o r e ，i ti so fg r e a ts i g n i f i c a n c et oe s t a b l i s hs i m p l e ，f a s t ， s e n s i t i v ed e t e c t i o nm e t h o d s i nt h i sr e s e a r c hp a p e r ，w ed e v e l o pf o rt h ed e t e c t i o no fs e v e r a l f l u o r e s c e n tc h e m i c a ls e n s o ru s i n gf l u o r e s c e n c es i g n a la sd e t e c t i o ns i g n a l d e t a i l sa r ea s f o l l o w s ： ( 1 ) h e r ew er e p o r tt h ep r i n c i p l eo fat e r m i n a lp r o t e c t i o na s s a yo fs m a l l m o l e c u l e 1 i n k e d d n af o rp r o t e i n f i r s t ，w eu s es m a l lm o l e c u l e st om o d i f yd n a c h a i n s ，t h r o u g ht h es p e c i a l r e c o g n i t i o nb e t w e e ns m a l lm o l e c u l e sa n dt h ec o r r e s p o n d i n gc o m b i n a t i o np r o t e i n s ，r o l l i n g c i r c l ea m p l i f i c a t i o nr e a c t i o na n de x o l l ia m p l i f i c a t i o nt oa c h i e v et h ed e t e c t i o no ff o l a t e b i n d i n gp r o t e i n r e a c t i o n sa r ec a r r i e do u ti nh o m o g e n e o u s a f t e rr e a c t i o nb e t w e e ns m a l l m o l e c u l e sa n dp r o t e i n s ，w ea d de x o1w h i c hc a nd i g e s tas i n g l es t r a n d e dd n ai n t ot h e s o l u t i o n ，t h e np r o t e c t i o no ft h ed n ac a nn o tb eh y d r o l y z e d ；s e c o n d ，i n t r o d u c t i o no ft h er i n g p r o b e ( 1 i g a t i o np r o b e ) i n t ot h es o l u t i o n ，a f t e rt e m p l a t ec h a i na n dr i n gp r o b eh a v eh y b r i d i z a t e d ， w ea d de c o l id n a l i g a t i o na n dl i g a t i o nb u f f e rt oi n d u c el i n kr e a c t i o n ；w i t hp r i m e r , b s td n a p o l y m e r a s e ，d e o x y r i b o n u c l e i ea c i da n dc i r c l e t e m p l a t e ，r o l l i n gc i r c l ea m p l i f i c a t i o n c a l l p e r f o r m ，w h i c hp r o d u c eal o n gs i n g l ec h a i nd n aw h i c h r e p e t i t i v es e q u e n c e i s c o m p l e m e n t a r yw i t hc i r c l et e m p l a t ed n as e q u e n c e f i n a l l y , w ea d dat a q m a np r o b e ( f l u o r o p h o r ea n dq u e n c h e rg r o u p sa r ec l o s ee n o u g h ，s ot h e r ei sn of l u o r e s c e n c es i g n a lw h e n t h ep r o b ee x i t sl o n e l y ) w h i c hc a nh y b r i dw i t hr c a p r o d u c ta n de x o l lt ot h es y s t e m - n l e r c a p r o d u c th y b r i d i z ew i t ht a q m a np r o b ea n dt h e ne x o i i is t r a t st od i g e s tt h ep r o b e ，s ot h a t t h ef l u o r o p h o r ea n dq u e n c h e rg r o u p sa r es e p a r a t e d f l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nw a sp e r f o r m e d f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yc a l lb eu s e df o rq u a n t i t a t i v et h ec o n c e n t r a t i o no ff o l a t eb i n d i n gp r o t e i n ( 2 ) ah i g h l ys e n s i t i v ea n ds e l e c t i v ef l u o r e s c e n c es e n s o rf o rt h ed e t e c t i o no fm e l a m i n e u s i n gs y b rg r e e ni ( s g ) i sp r e s e n t e di nt h i sp a p e r i t i sb a s e do nt h em e l a m i n e i n d u c e d c o n f o r m a t i o n a lc h a n g eo fap o l y t h y m i n es i n g l es t r a n d e dd n a ( s s d n a ) a n dt h ed i f f e r e n c e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yb e t w e e ns s d n aa n dd o u b l es t r a n d e dd n a ( d s d n a ) w i t l ls g a sw e k n o w ，s gi sad o u b l e s t r a n d c h e l a t i n gd y ea n dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns ga n ds s d n ai s w e a k ，s ot h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi sv e r yl o ww h e nt h er a n d o m - c o i lp o l y t 2 4s t r a n dw a s m i x e d 州mo n l ys g i nt h ep r e s e n c eo fm e l a m i n e ，h o w e v e r ，t - m e l a m i n e - tb o n d i n g ，b e c a u s e o ft h ef o r m a t i o no ft r i p l e h y d r o g e n b o n d i n gb e t w e e nm e l a m i n ea n dt h y m i n e ，r e s u l t si n p o l y t 2 4s t r a n dc o n f o r m a t i o n a ls w i t c h i n gf r o mar a n d o mc o i lt oah a i r p i ns t r u c t u r e ，t h e ns g p e r f e c t l yb i n d st ot h ed o u b l es t r a n d e dh a i r p i n t h u s ，w ec a no b s e r v ear e m a r k a b l ei n c r e a s ei n t h ef l u o r e s c e n ti n t e n s i t y t h ed e t e c t i o nl i m i ti sl o w e rt h a nt h ei n t e r n a t i o n a ls t a n d a r dm e l a m i n e c o n t e n ti nf o o d t h i sm e t h o di ss i m p l ea n df a s t ( 3 ) m o n i t o r i n gt h el e v e lo fa 矿i na na q u a t i ce c o s y s t e mc o n t i n u e st ob eo fi n t e r e s t b e c a u s ea g 十i sh i g h l yt o x i ct oa q u a t i co r g a n i s m sa n di sw i d e l yu s e di nt h ee l e c t r i c a li n d u s t r y ， p h o t o g r a p h ya n di m a g i n gi n d u s t r y ，a n dp h a r m a c y n u m e r o u sc h e m o s e n s o r sh a v eb e e n d e v e l o p e df o rt h es e n s i t i v e ，s i m p l e ，a n dr a p i dd e t e c t i o no fa 矿i n a l la q u e o u ss o l u t i o n ，b a s e d o no r g a n i cf l u o r o p h o r e sa n ds e m i c o n d u c t o rq u a n t u md o t s h o w e v e r , t h e s ec h e m o s e n s o r s h a v es o m el i m i t a t i o n ss u c ha sl o ww a t e rs o l u b i l i t y ，p o o rs e l e c t i v i t yt o w a r da g + i nt h ef o u r t h c h a p t e r , w er e p o r t e dam a k e r - f r e ef l u o r e s c e n c em e t h o df o rs i l v e ri o n sw h i c hi sb a s e do n s p e c i f i cr e c o g n i t i o nb e t w e e ns i l v e ri o n sa n dc y t o s i n e t h ec - r i c hd n a w o u l db ef o l dw h e n c y t o s i n ea n ds i l v e ri o n sf o r mt h ec o n f o r m a t i o no fc a 矿- c w ec a no b t a i n e dt h es i g n i f i c a n t l y e n h a n c e df l u o r e s c e n c es i g n a lw h e na d d i n gt h es y b rg r e e ni t h em e t h o di ss i m p l e ，f a s ta n d l o wc o s t k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n tb i o s e n s o r ；r o l l i n gc i r c l ea m p l i f i c a t i o n ；m e l a m i n e ；s y b rg r e e ni ； s i i v e ri o n s v 目录 学位论文原创- 陛声明与学位论文版权使用授权书i 摘要i i a b s t r a c t i v 第l 章绪论1 1 1 生物传感器1 1 1 1 生物传感器的基本组成和工作原理1 1 。1 2 生物传感器的分类2 1 1 - 3 生物传感器的特点2 1 1 4 生物传感器的应用和展望3 1 2 荧光生物传感器一4 1 2 1 荧光产生原理4 1 2 2 荧光传感器的应用5 1 3 滚环扩增( r c a ) 技术6 l - 3 1 滚环扩增的原理7 1 3 2 滚环扩增的分类8 1 3 3 滚环扩增的优势和不足9 1 3 4 滚环扩增的应用一1o 1 4 本研究工作的构思1 1 第2 章基于d n a 末端保护检测蛋白质的荧光分析方法1 2 2 1 前言1 2 2 2 实验部分1 3 2 2 1 试剂与仪器1 3 2 2 2 叶酸的标记和连接探针的末端保护1 4 2 2 3r c a 反应过程15 2 2 4e x o i i i 的循环放大过程15 2 3 结果与讨论1 5 2 3 1 传感器的设计原理1 5 2 3 2 传感器的光谱图和凝胶电泳图表征1 6 2 3 3r c a 反应时间对传感器性能的影响1 8 2 3 4e x o l i i 浓度对传感器性能的影响一1 9 2 3 5 传感器的分析性能1 9 2 3 6 传感器的特异性评价2 0 基于核酸的荧光生物传感器研究 2 4 小结2 1 第3 章基于单链d n a 构型转变用于三聚氰胺的检测2 2 3 1 前言2 2 3 2 实验部分2 3 3 2 1 试剂和仪器2 3 3 2 2 三聚氰胺的检测过程2 3 3 3 1 三聚氰胺传感器的检测原理2 3 3 3 2 传感器的荧光发射光谱表征2 4 3 3 3 传感器的紫外可见光谱表征2 5 3 3 4 实验条件的优化一2 6 3 3 5 传感器的分析性能2 7 3 3 6 实际样品的检测2 8 3 4 小结2 8 第4 章基于寡核苷酸为荧光探针用于银离子的超灵敏检测2 9 4 1 前言2 9 4 2 实验部分3 0 4 2 1 试剂和仪器一3 0 4 2 2 银离子的检测j 3 0 4 3 结果和讨论3 0 4 3 1 传感器的设计原理。3 0 4 3 2 荧光发射光谱表征。31 4 3 3 实验条件的优化一3 2 4 3 4 传感器的分析性能3 3 4 3 5 其他离子的干扰试验3 4 4 3 6 水样中银离子的检测3 4 4 4 j 、结一3 4 结论3 6 参考文献3 7 附录攻读学位期间发表的学术论文4 8 致 射4 9 v 1 1 生物传感器 第1 章绪论 当今社会的发展，是信息化的发展。在信息时代，人们的社会活动将主要依靠对信 息资源的开发及获取、传输与处理。作为信息技术三大基础之一的传感器技术，是当前 各发达国家竞相发展的高新技术，是进入2 1 世纪以来优先发展的十大顶尖技术之一。它 所涉及的知识领域非常广泛，其研究和发展也越来越多地和其他学科技术的发展紧密联 系。传感器是信息科学的组成部分，是获取自然信息的一个重要工具，在真实反映客观 事物的过程中扮演关键环节，其性能直接影响人们的判断结果l l j 。各种各样的物理和化 学传感器已广泛应用于各种自动控制和检测过程，如检测温度、p h 值、溶解氧、二氧化 碳、压力、流量和粘度等【2 j 。 生物传感器的发展起步于2 0 世纪六七十年代。酶传感器是生物传感器的先驱。1 9 6 2 年，美国纽约科学院学术会议上l e l a n dcc l a r kj n r 首次阐述了酶传感器( e n z y m e t r a n s d u c e r ) t 3 1 。1 9 6 7 年，sju p d i k e 和gph i c k s 采用了更加有效的固定化酶方法，研制成 了酶传感器【4 】。随着生物技术、生物电子学和微电子学不断地渗透、融合，致使生物传 感器不再局限于生物反应的电化学过程，研究家们根据生物学反应中产生的各种信息来 设计各种精密的探测装置【5 1 。1 9 7 4 年，热生物传感器【6 1 、酶光极( 酶光纤传感器) 【1 7 】和压电 晶体酶传感器【8 】相继被报道。在2 0 世纪8 0 年代，被誉为生物传感器“圣经 的生物传 感器：基础与应用( b i o s e n s o r s ：f u n d a m e n t a la n da p p l i c a t i o n s ) t 9 j 由牛津出版社出版发行。 1 9 9 0 年五月，“首届世界生物传感器学术大会 ( t h ef i r s tw o r l dc o n g r e s so nb i o s e n s o r s ) 在新加坡召开，此次大会标志着生物传感器已形成一个新兴的科学领域。在2 0 世纪9 0 年 代以后，传感器的技术有了突飞猛进的发展并取得显著成绩。 生物传感器是生物技术群的一个领域，涉及到生命科学、物理、化学、信息科学等 众多学科和技术，也是典型的多学科交叉生长点。生物传感器是一类特殊的传感器，它 由具有生物活性的材料( 如组织、微生物细胞、细胞器、细胞受体、酶、微生物、抗体、 核酸等) 构成的生物敏感元件与适当的信号转换器( 如氧电极、气敏电极、离子选择电极 等) 【l0 】相连接而组成的一种精致的分析器件。 1 1 1 生物传感器的基本组成和工作原理 生物传感器通常由敏感膜、换能器和信号处理器三部分组成【1 1 1 。比较重要的是敏感 膜和换能器。敏感膜为生物传感器的生物分子识别元件，是将生命关联物质( 酶、微生 物、抗原、抗体、d n a 等) 附着于膜上或包含于膜中( 成为固定化技术) 制成的生物敏感膜， 在测试中与被测物质直接接触。敏感膜是生物传感器的关键元件，它直接决定传感器的 功能与质量。依所选材料的不同，可以有酶膜、全细胞膜、组织膜、细胞器膜、微生物 基于核酸的荧光生物传感器研究 膜、免疫功能膜和杂合膜等；换能器是将分子识别元件进行识别时所产生的化学的或物 理的变化转换成可用信号的装置。到目前为止使用的最多并且比较成熟的是电化学电 极，用它组成的生物传感器成为电化学生物传感器，其他的换能器还包括离子敏场效应 晶体管、热敏电阻、压电晶体等。 传感器的敏感层与复杂样品中的特定目标分析物之间( 如酶与底物、抗体与抗原、外 凝集素与糖蛋白、核酸与其互补片段之间) 的识别反应会产生一些物理信号( 如光、热、 声、质量、颜色、电化学等) 的变化，经特定仪器放大后加以显示或记录。其原理如图 1 1 所示：被测物通过扩散进入生物敏感膜层，经分子识别，发生生化反应后，所产生 的信息被相应的转换器转换成与被测物浓度相关的信号。 生物识别貘换麓嚣 匿 图1 - 1 生物传感器原理示恿图 1 1 2 生物传感器的分类 ( 1 ) 按照其感受器中所采用的生命物质分类，可分为：免疫传感器【1 2 1 、微生物传感器 【1 3 1 、组织传感器【1 4 】、细胞传感器【1 5 】、d n a 传感器【1 6 】、酶传感器【1 7 】等等。 ( 2 ) 按照传感器器件检测的原理分类，可分为：热敏生物传感器、场效应管生物传感 器、压电生物传感器【18 1 、光生物传感器f 1 9 , 2 0 l 、声波道生物传感器、酶电极生物传感器、 介体生物传感器等。 ( 3 ) 按照生物敏感物质相互作用的类型分类，可分为：亲和型【2 1 】和代谢型 2 2 , 2 3 】两种。 1 1 3 生物传感器的特点 生物传感器这种新的检测手段具有如下特点： ( 1 ) 测定范围比较宽泛。在生物界，生物反应具有特异性和多样性，所以理论上可以 根据反应的特点制成所有需要的生物传感器。 ( 2 ) 在进行相关实验之前，一般不需进行样品的预处理。制成的相应的生物传感器一 般本身具有优异的选择性，它能够把样品中被测目标物的分离和检测统一起来。通常情 况下，无需添加其他试剂，实现测定过程简便迅速，自动分析。 ( 3 ) 能够实现连续在位检测。体积小、响应快、样品用量少。 ( 4 ) 传感器选用的敏感材料通常是固定化生物元件，在进行相关处理后，可以重复 ( 6 ) 可以实现对活体的分析。 ( 7 ) 传感器一般是小型的分析器件，和测定仪联用的成本也要远远低于大型的分析 仪，在分析领域更容易普及。 ( 8 ) 微生物培养系统内的供养状况和副产物的产生的相关信息依靠复杂的物理化学 传感器，但是有的微生物传感器能够较好系统的指示。 1 1 4 生物传感器的应用和展望 现代生物传感器技术具有巨大的应用潜力，在食品工业、医学等领域有广泛的应用。 ( 1 ) 食品工业：食品分析包括食品成分、食品添加剂、有害毒物和食品鲜度的测定分 析都能够利用生物传感器得到可靠结果。 食品成分中蛋白质和氨基酸的检测：1 9 9 3 年r a d ugl 等【2 4 】制备了一个基于过氧化氢 的电流型酶电极用于测定蛋白质。该传感器能在0 1 4 0m g 范围内测定酪蛋白，测定时 间为5 9m i n ；g r o o m l 2 5 用导电介体四氰基对醌二甲烷、四硫富瓦烯( t t f ) 和亚硫酸盐氧 化顺序沉积在玻璃百炼成碳电极表面上，结合荧光免疫分析法( f i a ) 带j j 成测定亚硫酸盐 的传感器；此外，生物传感器还用于食品防腐剂亚硝酸盐等的测定：用于酸味剂如磷酸和 乳酸的测定；用于鲜味剂l 谷氨酸以及色素抗氧化剂的测定；用酶联电流型免疫传感器， 可检测食品中存在的少量沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。美国佐治亚科技大学 科学家哈特文m i l eh a r t m a n ) 发明了一种新的生物传感器，可同时检i 9 l j j l 2 种不同的病原体 ( p a t h o g e n ) ，包括沙门氏菌属、大肠杆菌等1 2 6 1 。关于生物传感器对食品中的生物毒素和残 留农药的检测也有广泛的报道；在畜禽肉、鱼肉和牛乳新鲜度的评定上，k r e s s 等【2 7 】发 展了一种匕首型用于实现对肉类鲜度的快速检测的生物传感器，这种方法用于肉类食品 的新鲜度评价的基础是葡萄糖浓度的大小。以黄嘌呤氧化酶为生物敏感材料，v o l p e 等t 2 8 j 发展的生物传感器结合过氧化氢电极，通过测定肌酐、磷酸肌酐和次黄嘌呤的浓度评价 鱼的鲜度。 ( 2 ) 在医学领域的应用：准确、快速的检测报告对给予及时和正确的诊断与治疗是十 分重要的，生物传感器凭借其显著优势，在越来越多的检测项目中逐步替代大型检测仪 器，实现对多种疾病的诊断。人体液中的微量蛋白、小分子有机物、核酸等多种生化指 标检测都可以借助于生物传感器。k r e u z e rmp 等人1 2 9 】利用丝网印刷电极构建了用于检测 血清中总i 班水平的置换式安培型免疫传感器，最低检出浓度为9 0n g l ，线性范围为 1 0 1 5 0 0 “g l ，反应时间为3 0m i n 。血糖传感器和尿酸传感器使糖尿病和痛风患者能在家 中对病情进行自我监j ! 贝l j 3 0 1 。目前，我国已开发了多种用于临床诊断的生物芯片【3 1 1 。 此外，生物传感器还在生物工程和环境污染物检测等领域展示了十分广阔的应用前 景。借助于人类基因组计划的实施，与生物学、医学、信息学等学科相关的新型生物传 感器得到了迅猛的发展，使得当前对于各种生物传感器的研究得到了前所未有的机遇。 基于核酸的荧光生物传感器研究 生物传感器自诞生以来，经过约四十年的发展，借助其快速、准确、特异的优势，已被 广泛应用到各个领域中，成为一种不可缺少的分析工具。有理由相信，随着对生物分子 选择性识别的深入研究和电子学进一步发展，生物传感器会在分析领域内产生新的突 破。 1 2 荧光生物传感器 长期以来，分析科学领域中的分支一光学分析法具有举足轻重的地位，比色法和光 度法是光学分析法的重要组成部分，它们一直被广泛地用于对化学物质和生物物质的定 性分析和定量分析。随着各种光学分析法的不断发展，光学传感器随之出现，它是实现 分析物质实时、在线分析的重要途径。光学传感器检测原理是通过对分析物质的化学、 生物信息的信号转换为光学信号的传感装置。光学的化学和生物传感技术是典型的学科 交叉和渗透产物。在近几年，它一直是非常活跃的研究领域。随着相关技术的完善，光 学传感器已经能够成功的用于新型环境自动监测网络的建立，生产过程和化学反应的自 动化控制，炸药和化学战争制剂的遥测分析。生命科学和临床化学中多种有机物、酶、 蛋白质、核酸、无机物和其他生物大分子和生物活性物质的分析也能够借助于生物传感 器实现快速检测，并得到满意的结果。正处于高速发展的光学分析方法已成为现代科学 的前沿领域之一。 目前生物传感器使用的探测机制有电、光、热、量4 种，其中以光信号作为探测机 制的称为光学生物传感器【3 2 1 。光学生物传感器的原理是利用被测物质与探测试剂反应后 引发的光信号作为探测基础。由于光学生物传感器具有非破坏性的操作模式，对信号的 产生和读取具有快速的优点，再加上近年来光纤技术的发展和在光学分析法中的应用， 这些优势促使光学生物传感器在测试方式和应用领域都得到极大的扩展，所以光学生物 传感器逐渐成为应用最为普遍的生物传感器，具有广阔的发展前景 3 3 】。发展至今，光学 生物传感器具有丰富的种类，按生物功能物质的不同进行分类，可以分为酶传感器、免 疫传感器、核酸传感器、组织传感器和微生物传感器；按是否使用标记物进行分类，分 为无标记的直接测试和有标记的间接测试；根据传感层光信号的产生方式，分为无激发 源、以光信号作为激发源和以电信号作为激发源。 根据获取的光学信息的性质，光学传感器可以分为吸收、反射、散射、折射和发光 等多种类型。其中基于发光的传感器已成为光学传感器中最庞大的分支。发光传感器又 可细分为荧光传感器、磷光传感器、化学发光传感器等不同类型。荧光传感器由于灵敏 度较高，选择性好，在光学传感器中占绝大多数。 1 2 1 荧光产生原理 实现对荧光物质的检测通常借助于荧光的增强、淬灭或者发射波长的移动，从而能 够得出荧光信号的转变，荧光传感器是把和分析物质浓度具有的信号转换为荧光信号， 实现对目标物的分析。由于荧光检测方法操作简单、方便、快捷，还能够实现在线实时 4 重要物质都具有荧光性质，使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以 及生命科学研究领域具有重要意义，已成为光化学传感器技术研究者倍感兴趣的研究领 域。 荧光物质的荧光产生过程：大多数分子含有偶极电子，根据保里不相容原理，基态 分子的每一个轨道中两个电子的自旋方向总是相反的，因而大