（动物学专业论文）hl52基因的功能研究.pdf

h l 5 2 基因的功能研究唐芊芊摘要：在寻找新型造血调控基因时，从小鼠骨髓造血基质细胞中通过抑制性差减杂交( s s h ) 技术筛选获得的一条新基因，即m l 5 2 号基因，由于m l 5 2 基因与人的基因具有1 0 0 的同源性，因此人的该同源基因命名为h l 5 2 基因。本研究是以前期的基因序列及蛋白质结构等研究为基础，主要目的是揭示该基因的功能，研究h l 5 2 基因表达产物的生物学作用。根据d n a s t 缸软件对其蛋白质序列进行的结构分析推测其可能为一种抗菌肽。但h l 5 2 是否是抗菌肽基因。还未得到证明，本实验通过h l 5 2 特异蛋白表达、抑菌实验、转基因等方法对其功能进行研究。王通过s d s p a g e 试图获得h l 5 2 的特异性表达蛋白。将h l 5 2 基因连接在p e t 2 2 b ( + ) 的载体上，并将连接好的载体转化到大肠杆菌b l 2 1 中，同时用空载体p e t 2 2 b ( + ) 做阴性对照。将p e t 2 2 b ( + ) 一l l l 5 2 ( n or a g ) 转化后的b l 2 1涂于含有氮苄的琼脂板，进行筛选，挑长出的克隆进行培养，提质粒并进行酶切鉴定，选一个阳性克隆和一个阴性克隆，再选一个转入空载的克隆，每个克隆再分成两部分，一部分在摇菌过程中加入i p t g 诱导，一部分不加i p t g ，段时间后将菌液离心，弃上清收沉淀，加细胞裂解液将菌裂解，将裂解液做s d s p a g e ，结果没有发现诱导后的b l 2 1 有特异条带的产生。说明h l 5 2 基因的表达产物在产生后可能立即发挥其生物学作用从而被迅速降解，故无法在p a g e 胶上看到特异的蛋白表达条带。2 验证h l 5 2 蛋白是否具有抑菌作用。将p e t 2 2 b ( + ) 一h l 5 2 ( n o t a g ) 转化后的b l 2 1 阳性克隆进行液体培养，在培养过程中加i p t g 诱导该基因的表达，实验通过多组对照以大肠杆菌的生长是否受到抑制，证明h l 5 2 基因的表达产物的抗菌活性。实验结果显示，p e t 2 2 b ( + ) 一h l 5 2 ( n ot a g ) 转化后的b l 2 1 经i p t g诱导后，大肠杆菌b l 2 1 的生长明显地受到抑制，证明h l 5 2 基因的表达产物确具有抗菌活性。弓h l 5 2 基因的表达产物对真核细胞的作用。在胞外即细胞培养液中加入含有h l 5 2 蛋白的酵母上清。选用毕赤酵母( p f c h i a ) 构建了酵母生物反应器，将p p i c9 k - - h l 5 2 转入毕赤酵母中，向培养液中加入甲醇，可诱导产生外源基因h l 5 2 的表达蛋白。离心取培养液上清，将该上清加到生长状态良好的真核细胞h e p g 2 的培养液中，并以h e p g 2 细胞培养液中不加酵母上清，和h e p g 2 细胞培养液中加不表达外源基因h l 5 2 的酵母上清作为两组对照。结果加用甲醛诱导后的上清的细胞存活时问最长。辛向细胞内k n o c k i n 该基因的实验。构建载体p c d n a 3 1 - h l 5 2 ( n ot a g ) ，转染进h e p g 2 细胞中，构建稳定表达株，同步做一组阴性对照，即转入空载的稳定表达株。待稳定表达株建好后，回收两组细胞测f a c s ，结果显示细胞的停留在g 0 g 1期的细胞较多。综合以上实验结果我们可以得出以下结论：h l 5 2 基因的表达产物确实为抗菌肽，且具有明显的抑菌效果：对真核细胞还具有延长细胞周期的作用，具体表现为使细胞停留在g 0 g 1 期的时间延长，细胞的增殖就会相应减慢，从而对培养液中营养成分的消耗也变慢，所以加入用甲醛诱导后的酵母上清的细胞存活时间最长。但有关h l 5 2 基因的表达产物是通过何种作用机制使得真核细胞的细胞周期延长，这个将有待于进一步的研究。关键词：h l 5 2 基因h l 5 2 蛋白原核表达抗菌肽真核表达i lt h es t u d yo ft h ef u n c t i o no fh l 5 2t a n gq i a n q i a na b s t r a c t ：f o rs e a r c h i n gn e wh e m a t o p o i e t i cc o n t r o lg e n e s ，w eu s e dm i c eb o n em a r r o ws t r o m a lc e l l sa n ds u p p r e s s i o ns u b s t r i c t i v eh y b r i d i z a t i o nt oc h o s ef o rt h es c r e e n i n gd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e s ee x p r e s s e db yl t cc u l t u r e ds t r o m a lc e l l sb u tn o tb yt h eu n c u l t u r e db o n em a r r o wc e l l s w ec h o s e do n eo fn o v e lg e n e sw h i c hw a sm l 5 2 t h eh o m o l o g o u sg e n eo fh u m a nw a sh l 5 2g e n e i nt h ef o r m e rw o r kw em a i n l ys t u d i e dt h es e q u e n c ea n dt h es t r u c t u r eo ft h i sg e n e ，n o wi nt h i sp a p e rw ew i l le x p l o r et h ef u n c t i o no ft h i sg e n ea n dt h eb i o l o g i ce f f e c to ft h ep r o d u c to fg e n e t i ce x p r e s s i o n w eu s e ds o f t w a r e ，d n a s t a r , t oa n a l y s et h es t r u c t u r eo ft h ep r o d u c to fg e n e t i ce x p r e s s i o na n da c c o r d i n gt ot h er e s u l tw es p e c u l a t et h a ti tm a yb eo n ek i n do fa n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s t ov e i l f yt h es p e c u l a t i o n ，w ec a t t yo u tt h ef o l l o w i n ge x p e r i m e n t s 1 t r yt og a i nt h eh l 5 2t h r o u g hs d s - p a g e e c o l ib l 2 1w h i c hw e r et r a n s f o r m e di n t ov e c t o rp e t 2 2 b ( + ) - - h l 5 2 ( n ot a g ) a n dt h e np i c kt h ea m p + t r a n s f o r m a n t s p u r i f i e dt h ev e c t o r sf r o mt h ea m p + t r a n s f o r m a n t sa n dc l e a v e db ye n z y m e st ov e r i f y s e l e c tt h r e eg r o u p si n c l u d i n gp o s i t i v e s ，n e g a t i v e sa n de m p t yv e c t o rt r a n s f o r m a n t sa n de a c hg r o u pw a ss e p a r a t e dt ot w op a r t si nw h i c ho n ep a r tw r si n d u c e db yi p t ga n da n o t h e rw a sn o ti n d u c e db yi p t gi nt h ep r o c e s so fg r o w t h s o m e t i m e sl a t e rc e n t r i f u g a t e dt h ec u l t u r ea n dc o l l e c t e dt h ed e p o s i t i o n t h e nu s ec e l ll y s i ss o l u t i o nt ol y s ee c o l ib l 2 1 a n du s et h el y s i sp r o d u c t st on l a k es d s - p a g e i nt h er e s u l tw ed i dn o tf i n ds p e c i a lb a n d sw h i c hs h o wt h ep r o d u c to fh l 5 2g e n e t i ce x p r e s s i o nw o u l dm a k ee f f e c ta ss o o na se x p r e s s e d ，s oi tw a sd e c o m p o s e di m m e d i a t e l ya n dw ec a nn o ts e ei ti nt h es d s ，p a g e i fi ti sa n t i m i c r o b i a lp e p t i d ei tw i l lm a k ee f f e c to ne c o l ib l 2 1 s ow ea l s oc a l ln o tf i n di t w h e t h e rt h eh y p o t h e s i si st r u e ，w ew i l ld ot h ef o l l o w i n ge x p e r i m e n t st ov e r i f yi t 2 v e r i f yw h e t h e rt h eh l 5 2i sa n t i m i c r o b i a lp e p t i d eo rn o t w cc u l t i v a t e dt h ee c o l ib l 2 1w h i c hw e r et r a n s f o r m e di n t ov e c t o rp e t 2 2 b ( + ) - - h l 5 2 ( n ot a g ) i nl i q u i dm e d i aa n di n d u c e db yi p t ；( 2 i f t h eg r o w t ho r e c o l ib l 2 1w a si n h i b i t e d ，i tw a ss h o w nt h ep r o d u c to fh l 5 2g e n e t i ce x p r e s s i o ni sa n t i m i c r o b i a lp e p t i d e t h e r ew e r es e v e r a lc o n t r o l si ne x p e r i m e n t s t h er e s u l to fe x p e r i m e n ts h o w e dt h eg r o w t ho fe c o l ii i ib l 2 1w a si n h i b i t e do b v i o u s l y s oi tw a sv e r i f i e dt h ep r o d u c to f h l 5 2g e n e t i ce x p r e s s i o ni sa n t i m i c r o b i a lp e p t i d e 3 t r yt or e v e a lt h ee f f e c to ft h eh l 5 2o nt h ee u k a r y o t e w ea d d e dt h ep r o d u c to fg e n e t i ce x p r e s s i o no u t s i d et h ec e l l t or e a l i z et h i s ，w eh a dt og a i nt h ep r o d u c to fg e n e t i ce x p r e s s i o ni nt h ee u k a r y o t e s ow et r a n s f o r m e dr e c o m b i n a n tp l a s m i dp p i c9 k - - h l 5 2i n t op i c h i a u s em e t h a n o lt oi n d u c et h ee x p r e s s i o no fh l 5 2 t h e nc o l l e c t e dc u l t u r e dm e d i u m a d d e dt h ec u l t u r e dm e d i u mo fp i c h i ai n t ot h ec u l t u r e dm e d i u mo fe u k a r y o t e t h e r ew e r et w oc o n t r o l s ，o n ew a sn o tt oa d da n yc u l t u r e dm e d i u m ，a n o t h e rw a st oa d dc u l t u r e dm e d i u mw h i c hn o ti n c l u d et h ep r o d u c to fh l 5 2g e n e t i ce x p r e s s i o n i nt h ee n dt h ee u k a r y o t ew h o s em e d i u mw a sa d d e di n t oc u l t u r e dm e d i u l lo fp i c h i ai n c l u d i n gt h ep r o d u c to fh l 5 2g e n e t i ce x p r e s s i o n w es p e c u l a t e dt h a tt h ep r o d u c to fh l 5 2g e n e t i ce x p r e s s i o nm a y b ep r o l o n gt h ee e l lc y c l e 4 w ec o n s t i t u t e dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp c d n a 3 1 - h l 5 2 ( n ot a g ) a n dk n o c k e dt h eh l 5 2i n t ot h ee u k a r y o t eh e p g 2 s e l e c t e di ng 4 18 ，c e l ll i n es t a b l ye x p r e s s i n gw a sc o n s t i t u t e d 1 1 1 ee e l ll i n et r a n s f o r m e de m p t yv e c t o rw a sc o n t r 0 1 s o m e t i m e sl a t e rw ec o l l e c t e dt h et w og r o u p so fc e l ll i n e sa n du s e df a c st oa n a l y s e f a c sa n a l y s i sr e s u l t ss h o w e dg 0 g 1p h a s ec e l l sw e r em u c hm o r e c o m b i n i n gt h ef o r m e rr e s u l t ，w em a d eac o n c l u s i o nt h a tt h ep r o d u c to fh l 5 2g e n e t i ce x p r e s s i o ni sa n t i m i c r o b i a lp e p t i d ea n dc o u l da f f e c te u k a r y o t et op r o l o n gi t sc e l lc y c l ew h i c hc a r ll e a dt og 0 g ip h a s et i m ew a sp r o l o n g e da n dp r o l i f e r a t i o no fc e l l sw a si n h i b i t e d c o n s e q u e n t l yt h ec o n s u m p t i o no fn u t r i t i o na l s od i m i n i s h e d s ot h ec e l l sa d d e dt h ec u l t u r e dm e d i u mo fp i e h i aw h i c hi n c l u d e dt h ep r o d u c to fh l 5 2g e n e t i ce x p r e s s i o nh a dl o n g e s tl i v e i tn e e d sf u r t h e rs t u d yt or e v e a lt h r o u g hw h i c hw a yt h ep r o d u c to fg e n e t i ce x p r e s s i o np r o l o n gt h ec e l lc y c l e k e yw o r d s ：h l 5 2h l 5 2a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e si vp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ne u k a r y o t i ce x p r e s s i o n学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中作了明确说明并表示谢意。储馘盟e t i i ：塑! ：! ：学位论文使用授权声明本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电子版和纸质版：有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。作者签名：盟日期：堕坦一、h l 5 2 基因第一部分前言造血基质细胞( h e m a t o p o i e t i cs tr o m a lc e l l s ) 通常包括成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、上皮细胞和脂肪细胞等，是组成造血微环境的重要成分。在体外培养过程中，造血基质细胞呈贴壁生长，其在造血调控中具有重要作用【。经典的w w v 和s i is l d 小鼠造血细胞移植实验结果证实，来自正常供体的造血干细胞( h e m a t o p o i e r i cs t e mc e l l s ，g s c ) 可以重建h s c 缺陷w w v 小鼠的造血功能，但不能重建环境缺陷s 1 s l d 小鼠的造血功能1 2j 。这一实验结果充分证实，h s c 维系正常造血功能密切依赖于造血微环境的正常。造血微环境在体外调控造血的作用可由体外长期培养体系( 1 0 n g - t e r mc u l t u r e ，lt c ) 的研究结果得到证实。d e x t e r 等发现，造血干祖细胞可在lt c 体系中不断增殖分化达数月之久，在理想条件下甚至达1 年以上 4 1 。l1 体系是如何维系体外造血的? 其物质基础是什么? 对lt c 培养体系的上清分析的结果表明，其中无明显可测出的已知造血生长因子( h e m a t o p o i e t i cg r o w t hf a c t o r s ，h g f s ) ，据此推论，其中的造血基质细胞可能起关键作用，因而不同造血组织来源的造血基质细胞株相继被建立，各自对造血的调控作用也分别进行了研究1 5 1 。结果发现，任一单独细胞株均不能支持长期造4 ( 8 周以上) 。对细胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ，e c m ) 的分析研究发现，其中的一些糖蛋白具有较好的造血支持作用，但仍不能达到维持长期造血的效果【61 。即便不同种类、不同浓度h g f s 之间的排列组合，也远不能达到lt c 支持造血的效果。总之，lt c 支持体外造血的物质基础及其作用机制，至今仍是一个许多科学家极为关注而没有阐明的问题。随着分子生物学技术的发展，尤其是高通量筛选差异表达基因技术的建立和发展，为较系统、大量分析lt c 体系支持体外造衄的分子基础带来了契机。在诸多的方法中，本研究选择了抑制性扣除杂交( s u p p r e s s i o ns u b tr a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，s s h ) 技术，对长期培养造血基质细胞( l1 s t ) 差异表达的基因进行了筛选，通过生物信息学的分析，建立了差异表达序列标志( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，e s t ) 库。进行相关系列研究【7 。经检测，所构建文库的滴度高达1 0 6 x1 0 1 0 m l 。随机挑取1 3 1 个克隆，p c r检测其中阳性克隆数为1 0 6 个阳性率为8 0 9 ，在此1 0 6 个阳性克隆中p c r扩增片段大小分布于1 5 0 10 0 0 b p 的范围内，主要集中于4 0 0 6 0 0b p 之间。共；9 j 0 序获得e s t1 0 6 条，进行同源性分析后发现其中9 9 个e s t 代表2 6 个已知基因，未知序列7 条，进而分别对已知序列、未知序列进行分类( 表1 ) 。未知基因序列经过电子延伸后，证明其中3 个e s t 代表1 个全长的新基因：其5 ，端g c 比例达8 0 ，3 端有p o l y a 尾，且a 、t 比例很高。有编码7 9 个氨基酸的完整o r b ，在e s t 数据库的同源性比较结果中显示我们测出的e s t 是对e s t 库中已有e s t 的扩展，且扩展部分为我们测序出的e s t 部分，证实了电子延伸的合理性。2 条e s t 延伸后证明为已知e s t ，全长已测出，有l 的碱基差异，功能尚不明确。2 条e s t 经与e s t 数据库同源性比较表明是全新的序列，它们所代表的基因的功能还有待进步分析。表l 差异表达基因测序及序列比对结果t a b l e lg e n e sd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e di nl t cb ys i m i l a r i t ys e a r c ha g a i n s tg e n b a n k同源基因出现频率基因序号功能线索m u sm u s c u l u sgp r o t e i ng a m m a8s u b u n i tm u sm u s c uj u sc a t h e p s i nd ( c t s d ) ，m r n am u sm u s c u l u sc y s t a t i n3 ( c s t 3 ) ，m r n am u sm u s c u l u se r 0 1 - l i k em 砌q am o u s et y r op r o t e i nt y r o s i n ek i n a s eb i n d i n gp r o t e i nh u m d n as e q u e n c ef r o mc l o n er p i 3 5 3 c i 8m o u s eg e n ef o ra c r o g r a n i np r e c u r s o rm o u s el y s o z y m emg e n e ，o x o n4 ”m o u s em r n am h ca n t i g e nm u sm u s c u j u sa p o l i p o p r o t e i ne ( a p o e ) ，m r n am u sm u s c u l u sc a t h e p s i nb ( c t s b ) , m r n am u sm u s c u l u sp r o t e i nn q m 2 3 b )m u sm u s c u l u sf e r r i t i nh e a v yc h a i n ( f t h )m u sm u s c u l u sm a c r o s i a l i ng e n e 。m u sm u s c u l u sr i b o s o m a lp r o t e i nl 1 3 ( r o l l 3 )m u sm u s c u l u sr i b o s o m a lp r o t e i nl 2 1 ( l 2 1 )m u sm u s c u l u sr i b o s o m a lp r o t e i nl 8 ( r p l 8 )m o u s em r n af o re l o n g a t i o nf a c t o r1 - a l p h ar n o r v e g i c u sm r n af o rr i b o s o m a lp r o t e i ns 2 lp o e c i l i ar e t i c u l a t ac l o n eb s r 4k e r a t i nt u r n an o v e lg e n e s2m m u 3 8 5 0 0n m0 0 9 9 8 3 1n m0 0 9 9 7 6 1n m0 1 5 7 7 4 1n m0 1 1 6 6 2 1a l 3 5 7 3 7 4 1 ld 1 6 1 9 5 1m 2 1 0 5 0 1x 0 0 2 4 6 1n m0 0 9 6 9 6 1x 5 4 9 6 6 1n m0 0 8 7 0 5 1n m0 1 0 2 3 9 1a f 0 2 2 6 5 1 1信号转导信号转导信号转导信号转导信号转导基因组d n h上皮素前体巨噬细胞标忠免疫标志脂类代谢相关细胞分化相关肿瘸转移抑伟4 基因细胞防御和体内平衡造血相关( c d 6 8 )a j 2 4 9 8 9 5 i细胞因子a j 2 5 1 6 8 5 1n m 们6 7 3 8 1n m0 1 9 6 4 7 1n m0 1 2 0 5 3 1x 1 3 6 6 1 1x 7 9 0 s 9 1分泌蛋白或造血基因蛋白表达基因蛋白表达基因蛋白表达基因蛋白表达基因，蛋白表达a f 0 9 6 2 8 8 1常规代谢a f l 7 2 6 4 4 1细胞骨架蛋白，424332 地2323 均373l1222l17这三个全新的基因已在g e n b a n k 中注册：a y 0 2 8 4 2 5 ，a f 3 6 2 5 7 3 ，a f 3 6 2 5 7 4 。选a y 0 2 8 4 2 5 即m l 5 2 进行研究，根据m l 5 2 设计了p c r 引物，通过r t - p c r 获得了人的同源序列。其氨基酸序列与鼠源序列完全相同并命名为h l 5 2 基因。h l 5 2基因定位于入染色体2 0 q 1 1 2 1 区域，该基因e d n a 全长为6 0 2 b d ，o r f 长为2 4 0 b p ，可编码7 9 个氨基酸，具有两个外显子和三个内含子。该基因在h e p g 2 ，h e l a ，j u r k e t ，h e k 2 9 3 细胞中的表达见图1 ，该基因表达产物在体外的翻译见图2 。h l 基因作为一个全新的、功能未知的基因本身就具有重要的研究价值，所以对其功能展开深入的研究也同样具有及其重要且深远的意义。h e p g 2h e l aj u r k e ! h i ( 2 9 3h l 5 2u b fl u e i f e r a s e图l二、分析h i 5 2 蛋白的结构并预测其功能匿2h l 5 2 蛋白的氨基酸水平同源性比较显示该基因在进化上十分保守，人和鼠的同源性达到了1 0 0 。从基因序列上的保守可以推测该基因在生命有机体中发挥着重要的作用，所以对其功能的探索便更具有价值。我们从h l 5 2 蛋白的一级、二级结构及其构像入手再结合其分子量、氨基酸的组成、p h 值等对该蛋白质的功能进行初步的预测。具体条件如下：该蛋白质仅有7 9 个氨基酸组成，是一个小分子蛋白质：蛋白质由偏性氨基酸组成；在p h 为7 , 0 时该蛋白质带正电荷；等电点 7 ；蛋白质所表现出的二级结构和己知抗菌肽的结构相似；蛋白质的结构中具有两性区域即疏水区和亲水区：含有半胱氮酸，可形成二硫键。根据以上几点初步推测h l 5 2 蛋白可能是抗菌肽。三、抗菌肽的研究进展1 抗菌肽的特点与分类抗菌肽( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s ) 是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽，是两亲分子，常带正电荷。过去人们认为宿主天然防御系统的主要参与者是吞噬细胞( 如巨噬细胞) 、白细胞( 如肥大细胞) 、血清蛋白( 如补体) 。1 9 8 0 年，瑞典科学家b o m a n等从天蚕蛹的血淋巴中分离得到天蚕素( e e c r o p i n ) 抗菌肽，使人们对抗菌肽的作用机理和应用有了一个崭新的认识。这类生物活性小肽是非专一性的免疫应答产物，具有广谱抗菌作用。它不仅能抗多种细菌或真菌，而且还抗原虫、病毒或肿瘤细胞。对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌均有抑杀作用，最重要的是可以杀伤动物体内的肿瘤细胞，却又不破坏动物体内的正常细胞。因此，抗菌肽的开发和应用研究已成为国内外昆虫学、生理学、药理学研究热点，在动植物转基因工程及药物开发领域具有广阔的应用前景。当微生物侵入机体时，固有性免疫系统是它必须通过的第一道屏障。这个屏障有很多组成部分，例如连续的上皮、黏液腺的分泌物、纤毛的运动、胃肠道和皮肤表面的低p h 值、吞噬细胞的存在、无特异性的体液因子、选择性的补体激活等等。抗菌肽是固有性免疫系统中最为重要的成员之一。这些肽广泛的存在于所有的真核细胞中，包括哺乳动物、两栖动物、昆虫、植物和原生动物 1 q 。至多几十个氨基酸的组成，能够迅速的产生和扩散，这些都被认为是能够快而有效地防御微生物入侵最理想的特点【l2 1 。在连续的进化过程中，它们的功能依然是明显的。在哺乳动物中，呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道的上皮细胞都大量的表达抗菌肽。而且在吞噬细胞和粘液腺的特定细胞中也有表达i 】3 】。至今为止，被分离和介绍的抗菌肽已有大约8 0 0 种之多 1 4 - 3 1 。所有这些抗菌肽都共同拥有以下特征：( 1 ) 它们的分子量小( 7 0 0 0 k d a ) ；( 2 ) 都带正电荷：( 3 ) 都是两性分予，除n i s i n z 外，其他分子中极性和非极性氨基酸的比例在0 5 到1 2 之间：( 4 ) 可以形成特定的二级结构：如m a g a i n i n s ，m e l i t t i n 和n 1 y s i n 等呈线形：有些为两性d - 螺旋；还有些如d e f e n s i n s ，c a r d i o t o x i n s 和n i s i n s 拥有若干二硫键来稳定多肽链的二级结构哪i 。目前。公认的分类方法( 表2 ) 是从以下一些特征对抗菌肽进行区分的【”】，如肽中一种氨基酸的含量较高，通常是脯氨酸、色氨酸、精氨酸和组氨酸的含量较高( 这类抗菌肽包括p r o p h e n i n s ，i n d o l i c i d i n s , h i s t a t i n s ) ；或者是肽具有一个优势的b 折叠结构和分子内的二硫键( 包括d e f e n s i n s 和p r o t e g r i n s ) ：或肽具有一个含两性区的螺旋( 包括m a g a i n i n s ，c e c r o p i n s ) 等【1 3 】。g a l l o 又对其他类型的肽进行了区分1 3 ”，即仅有一个二硫键的环状肽、片段肽和带负电荷的肽、可以和表面活性剂结合的肽。抗菌肽主要类群中的成员已经根据它们的生化( 静电荷) 和( 或) 结构特征( 线形、环形、氨基酸组成) 分类。寻找相同的结构可以用来帮助区分这些抗菌肽【3 4 蚓。t a b l e 2 s u m m a r yo fp s p t i d ea n t i b i o t i c sd e v e l o p m e n tf o rs t r u c t u r es p e c i e sa n dt i s s u ea c t l v l t yi r e p o r t e d )i n d u s t r i a iu s er e p r e s e n t a t i v ea n t l m i c r o b l a ip e p t i d e sg e n e t i ci n t r o d u c t i o n4 d i s u l f i d ep l a n td e f e n s i n sp l a n t sf u n g ii n t op l a n t st oi n c r e a s eh e l i x + 8a n t i f u n g a lr e s i s t a n c es h e e ta r t h r o p o dd r e s o m y c i ne m o | v m d h3 d i s u m d e0 一d e f e n s i n sv e r t e b r a t en e u t m p h i l sa n db a c t e r i a ，f u n g i b s h e e t r i c hm a m m a l i a ne n v e l o p e dv i r u s e s1 3 - d e f e n s i n se p i t h e l i a3 - d i s u l f i d ea r t h r o p o dg r a m - p o s i t i v enh e l i x +l n s e c td e f o n s i n sh e m o l y m p h b a c t e r i abs h e e tm o l l u s c s3 - o r4 d i s u l f i d es o m et h i o n i n sp l a n t sb a c t e d a f u n g i 2 nh e l i c e s lc r e m b i n )m a m m a l i a nc e l l s日s h e e tb a c t e r i a f u n g i 。2 一d i s u l f i d e1 3p r o t e g r i n sp i gn e u t r o p h i l st o p i c a la n t i m i c m b i a l se n v e l o p e dv i r u s e ss h e e tt a c h y p l e s i n s h o r s e s h o ec r a bp o l y p h e m u s i n sh e m o c y t e s1 一d i s u l f i d ec y c l i cr u m i n a n ib a d e f i ac y d i cd o d e c a p e p t i d el e u k o o y t ( b a c t e n e c i n - 1 )o rp a r h yc y c l i cr a n a l e x i n ，b r e v i n i na m p h i b i a ns k i nc e c r o p i n si n s e c th e m o l y m p hb a c t e r i at o p i c a la n t i m i c r o b i a i snh a l | xm a g a i n i n p g l aa m p h i b i a ns k i nb a c t e r i am a m m a l i a nl l 3 7l e u k o c y t e sb a c t e n e c i n s5a n dm a m m a l i a nl i n e a rw i t h7 ，p r - 3 9 p r o p h e -b a c t e r i ar e p e a t i n gn i n i n d 0 1 c t d i nl e u k o c y t e sm o 啊f so rp r e d o m i n a n td i p t e r i c i n a p i d a e c i ni n s e c th e m o l y m p hb a c t e d aa m i n oa c i d st o p i c a lf o rp e r i o d o n t ah i s t a t i n sh u m a ns a l i v ao r a lb a c t e r i a ，f u n g id i s e a s e2 抗菌肽的作用机制几乎所有的抗菌肽都带有正电荷或具有两亲性。这些结构决定了它们抗菌活性的机$ 1 3 6 , 3 7 1 。带正电荷的肽表现出对脂多糖的强亲和性，脂多糖是革兰氏阴性菌外层膜的主要成分。带正电的抗菌肤能完全取代与脂多糖结合的能够稳定膜结构的二价正离子【3 8 1 。与经典抗生素相比抗菌肽与脂多糖的结合能力使其具有了巨大的临床优势，因为它可以防止内毒素血症的产生【3 9 】。当抗生素使大量的细菌裂解后，会导致l p s 的释放，l p s 的释放又可致前炎性因子的产生，最终会导致败血病休克( s e p t i cs h o c k ) 通常是一种灾难性的后果。抗菌肽的选择性取决于高等真核细胞与微生物细胞膜的组成不同。高等真核细胞的外层膜是由电中性的磷脂如卵磷脂和鞘磷脂，然而细菌膜则是由带负电荷的磷脂酰甘油和双磷脂酰甘油组成 4 0 t 。另外的不同在于，细菌的胞膜上缺少胆固醇。这些参数的确立对于抗菌肽的选择性是非常重要的j 。有些肽表现出它们的最终效应，不是通过膜打孔的方式来杀灭细菌。它们进入细胞荠参与其生理过程。例如，a t t a c i n 能够阻止膜上特殊蛋白的合成1 4 2 1 。p r - 3 9 抑制d n a 的合成【4 3 1 。d e f e n s i n s 能破坏单链d n a l 4 ”。抗菌肽也可抗真菌感染，这点在c a n d i d a 种中表现的由为突出1 4 5 1 。d e f e n s i n s 和h i s t a t i m s 是通过非裂解性的释放细胞a t p ，a t p 随后和p u t a t i v ep u r i n o e r g i e 受体结合并激活细胞毒性通路 4 6 1 。d e f e n s i n s 和m a g a i n i n 的合成类似物都能表现出对一些病毒感染的抑制作用 4 7 , 4 8 1 。它的作用机理是因为它可与病毒的包装蛋白结合，因为作用机理相似所以它不能影响非包装蛋白的感染能力。抗菌肽以上的这些特点在进化上的保守性，在固有性免疫系统中抗菌肽是一个普遍存在、简单又非常有效的因子，而且由于它的特异性和安全性，它被认为最合适于药用。有些肽和它们的衍生物已经成功地通过了临床检验【4 9 ，5 们，还有一些被认为具有药用的潜力【5 “。而且出人意料的是，抗菌肽除了可以抗细菌、真菌和病毒外还被证明具有其它一些生物活性。3 抗菌肽的其他生物学活性3 1 抗肿瘤活性如上所述，抗菌肽的活性基于它可与靶细胞膜上的负电荷相作用。肿瘤细胞与正常细胞在膜的组成上有所不同。1 9 9 1 年u t s u g i 等人报道在黑色素瘤与癌细胞的胞膜中磷脂酰丝氨酸的量是正常人角质化细胞膜上磷脂酰丝氨酸量的3 7 倍，这些不同导致了肿瘤细胞对于膜打孔肽具有更高的敏感性。m a g a i n i n s 是一类从两栖动物皮肤中分离出的带正电荷的肽，它们裂解肿瘤细胞时的浓度比裂解正常细胞所需的浓度低5 l o 倍1 5 2 l 。b a k e r 【5 j 等人( 1 9 9 3 ) 指出m a g a i n i n s 2 和m a g a i n i n s的合成类似物无论在体内还是体外都表现出对鼠腹水瘤细胞、白血病细胞和自发性卵巢瘤细胞的抗肿瘤活性。m a g a i n i n 的全d 型氨基酸类似物