（环境工程专业论文）五氯苯酚的微生物厌氧降解及其机制.pdf

摘要 摘要 研究了不同外加碳源( 葡萄糖、丙酮酸、酵母膏) 作为共代谢基质及h 2 作为电子供体 条件下五氯苯酚( p c p ) 的厌氧降解特性，并对p c p 共代谢降解的中间产物进行了分析。 同时，借助末端限制性片段长度多态性技术( t r f l p ) 分析了p c p 降解茵群的微生物群落 结构，并通过构建1 6 sr r n a 克隆文库方法研究p c p 降解体系中脱氯微生物的具体组成 及多样性，对p c p 厌氧降解体系中微生物群落组成及系统发育多样性进行分析。研究了 p c p 废水的厌氧反应器的启动策略、运行条件和运行方式，为应用生产规模的e g s b 反 应器处理含p c p 废水打下了基础。全文主要研究结果如下： 1 外加碳源及以氢气作为电子供体均对p c p 降解有显著促进作用。添加葡萄糖、丙酮 酸、酵母膏和氢气时的去除率分别为7 1 、5 6 、5 1 和7 4 。不同葡萄糖添加浓度对 p c p 的降解影响不同，添加2g l 葡萄糖时p c p 的降解最佳。 2 g c m s 分析结果表明，p c p 在厌氧反应过程中存在多种脱氯途径，主要通过邻位脱 氯产生2 ，3 ，4 ，5 四氯酚( 2 ，3 ，4 ，5 t e c p ) ，再脱氯产生2 ，3 ，5 三氯酚( 2 ，3 ，5 - t c p ) ，部分p c p 首先 间位脱氯产生2 ，3 ，4 ，6 四氯酚( 2 ，3 ，4 ，6 - t e c p ) 。 3 微生物群落结构分析表明，不同处理条件下p c p 降解菌群微生物的群落结构不同。 其中占优势的微生物主要为f i r m i c u t e s ，b a c t e r o i d e t e s 门和d e l a p r o t e o b a c t e r i a ， g a m m a p r o t e o b a c t e r i a 纲的微生物。p c p 降解菌群中可能存在c l o s t r i d i u m ，f r a n k i a 和 d e s u l f i t o b a c t e r i u m 等属的微生物。 4 在p c p 厌氧降解体系克隆文库中的1 1 个序列型分布在b e t a p r o t e o b a c t e r i a 、 f i r m i c u t e s 、b a c t e r o i d e t e s 、p l a n c t o m y c e t e s 、v e r r u c o m i c r o b i a 、t m 7 和o p ll 几个类群。 其中，丰度最高的一类微生物在系统发育上归为候选门t m 7 ，推测该类群微生物可能对 p c p 的降解起着关键作用。 5 进水有机容积负荷、水力停留时间和出水回流比等对e g s b 反应器出水p c p 和c o d 浓度有显著影响，在进水p c p 浓度8 0m g l ，c o d 浓度4 5 0 0m g l ，出水回流比1 0 ，水 力停留时间1 8h 的条件下，可以使p c p 和c o d 得到较好的去除。 关键词：五氯苯酚，厌氧降解，共代谢，t r f l p 技术，1 6 sr r n a 克隆文库，e g s b 反应器 a b s t r a c t a b s t r a c t e 彘c to fc a r b o ns o u r c e ( g l u c o s e ，p y r u v a t e ，y e a s te x t r a c t ) a n de l e c t r o nd o n o r ( h 2 ) o n a n a e r o b i c d e g r a d a t i o n o f p e n t a c h l o r o p h e n o l ( p c p ) w a s i n v e s t i g a t e d g a s c h r o m a t o g r a p h - m a s s ( g c m s ) a n a l y s i so ft h ei n t e r m e d i a t ep r o d u c t si np c pc a t a b o l i s mw a s c a r r i e do u t d i f f e r e n c e so fb a c t e r i a lc o m m u n i t yi nt h ea n a e r o b i cs y s t e m sw e r ed e t e c t e db y t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s mt e c h n i q u e ( t r f l p ) mb a c t e r i a l d i v e r s i t yi nt h ea n a e r o b i cs l u d g eo fp c pw a ss t u d i e db yt h e 16 sr r n ac l o n i n ga n d s e q u e n c i n gm e t h o d t h eo p e r a t i o nc o n d i t i o n s o fa p p l y i n ge x p a n d e dg r a n u l a rs l u d g eb e d ( e g s b ) r e a c t o r f o rt h et r e a t m e n tt h ep c pw a s t e w a t e rw a sa l s os t u d i e d r e s u l t sa r es h o w na s f o l l o w s ： 1 c o m p a r e d 丽mc a r b o n f r e es y s t e m ，t h es u p p l e m e n t a t i o no fd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e sa n d h 2m a yg r e a t l ye n h a n c et h ed e g r a d a t i o no fp c p w h e ng l u c o s e ，p y r u v a t e ，y e a s te x t r a c ta n d h 2w e r ea d d e d ，t h er e m o v a le f f i c i e n c i e so f p c pw e r e7 1 ，7 4 ，5 1 a n d5 6 ，r e s p e c t i v e l y ， i nc o n t r a s t w i t h o u tc a r b o na d d i t i o n , o n l y17 6 4 o fp c pw a sr e m o v e d d i f f e r e n tg l u c o s e c o n c e n t r a t i o n sc o u l da f f e c tt h ed e g r a d a t i o no fp c p a m o n gt h e m ，t h ea d d i t i o no f2g l g l u c o s es h o w e da no b v i o u sp r o m o t i o n 2 g c m sa n a l y s i ss h o w e dt h a t ，t h ei n t e r m e d i a t ep r o d u c t so fp c pd e g r a d a t i o n ， 2 ，3 ，4 ，5 t e c p , 2 , 3 ，4 ，6 - t e c p , 2 , 3 ，5 - t c p , 3 , 5 一d c pa n d2 , 4 - d c pc o u l db ed e t e c t e d i ti s i n d i c a t e dt h a tu n d e rt h ec o n d i t i o no fa n a e r o b i cb i o d e g r a d a t i o n ，t h ed e c h l o r i n a t i o nr e a c t i o n g r a d u a l l yh a p p e n e da n dt h ep c p w a sm i n e r a l i z e d 3 t h ea n a l y s i so ft r f l ps h o w e dt h a tb a c t e r i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r e sw e r cd i f f e r e n tu n d e r d i f f e r e n tt r e a t m e n tc o n d i t i o n s i tw a ss p e c u l a t e dt h a ts o m em i c r o o r g a n i s m sp h y l o g e n e t i c a l l y a f f i l i a t e d 谢t 1 1t h eg e n u sc l o s t r i d i u m ，f r a n k i aa n dd e s u l f i t o b a c t e r i u me x i s t e di n t h e p c p d e g r a d a t i n gs y s t e m s 4 16 sr d n as e q u e n c i n gm e t h o dw a su s e dt oi n v e a i g a t et h e b a c t e r i a ld i v e r s i t yi nt h e a n a e r o b i cs l u d g eo fp c p i ti si n d i c a t e dt h a t3 8c l o n e sc o u l db ed i v i d e di n t o1 1p h y l o t y p e s t m 7w a st h ed o m i n a n tc o m p o n e n to ft h eb i o d e g r a d a t i o nb a c t e r i a lc o m m u n i t y ，f o l l o w e db y b e t a p r o t e o b a c t e r i a ，f i r m i c u t e s ，b a c t e r o i d e t e s ，p l a n c t o m y c e t e s ，v e r r u c o m i c r o b i aa n do p 11 t m 7i n f e r r e da sp c p - d e g r a d a t i n gm i c r o o r g a n i s m sb yt h ep h y l o g e n e t i ca n a l y s i sr e s u l t s 5 u n d e rt h ec o n d i t i o n so f8 0m e , lp c pa n d4 5 0 0 m g lc o di ni n f l u e n t , e m u e n tr e c y c l e r a t i o10 ，a n dh y d r a u l i cr e t e n t i o nt i m e18kp c pa n dc o dc o u l db ed e g r a d e de f f i c i e n t l y k e y w o r d s ：p e n t a c h l o r o p h e n o l ，a n a e r o b i cb i o d e g r a d a t i o n , c o m e t a b o l i s m ，t r f l p ， 16 sr l 讯ac l o n el i b r a r y ，e g s br e a c t o r - 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是拳人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含拳人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 邀鍪 e t 期鲨业亟旦 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并耳苯人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 迷鏊导师签名：笪洫 日 期：护p 孑牟目 第一章绪论 第一章绪论 1 1 五氯苯酚( p c p ) 及其对环境微生物的毒性效应 五氯苯酚( p e n t a c h l o r o p h e n o l ，p c p ) 是氯代烃类杀虫剂和杀菌剂，最初被用于木材防 腐和防虫蛀，其作用机理是将生物代谢过程中的氧化磷酸化解偶联，具有广谱生物杀伤 性【l 】。除防腐之外，亦被广泛用作落叶剂、除草剂和生物杀伤剂，由于p c p 能阻止真菌 的生长、抑制细菌的腐蚀作用，因此主要用于纺织品和皮革制品，其钠盐形式五氯 酚钠( p c p - n a ) , l j 作为防治血吸虫病的灭钉螺药被大量使用 2 1 。在获得广泛应用的同时， 其所造成的环境问题也受到人们的高度重视。p c p 在所有酚类中毒性最大，具有很强的 “三致 ( 致癌、致畸、致突变) 效应，美国环境保护局2 0 世纪7 0 年代已将其纳入优先污 染物名单【3 】。在我国p c p 也被列为水环境优先控制的6 8 种污染物名单 4 1 。对五氯苯酚的 毒性、降解性及其污染的生物修复等研究，一直是国际环境学、医学等学科的研究热点 之一。 五氯苯酚在通常条件下，不被氧化，也难于水解，有蓄积作用，它在生物中富集浓 度远远超过它在水中的浓度【5 1 。在高有机质含量的酸性土壤或沉积物上具有很高的吸附 性。能通过生物富集而进入食物链，能强烈地吸附在土壤中，同时被植物吸收。五氯苯 酚挥发性很低，难以通过空气迁移。在碱性介质和高温条件下，易生成八氯二苯并对二 恶英，它对动物的毒性虽不高，但相当稳定。其生物危害性和在自然环境中的迁移、转 化与降解等规律也一直是全世界研究和关注的热点。近年来，我国在五氯苯酚降解研究 方面做了很多工作，取得了一定进展，但还存在着一些不足。尤其在水处理过程中，五 氯苯酚的毒性会造成污泥活性降低，出水水质恶化【6 1 。因此，研究五氯苯酚的生物降解 具有重要意义。 1 2p c p 的生物降解及其厌氧脱氯机制 氯酚类化合物降解过程的限制性步骤是苯环上氯取代基的去除。不同种类的微生物 由于其降解污染物的生化机制不同，使得p c p 的降解途径多样化，但降解过程均为先脱 氯转化为低氯代化合物后再开环得到降解或矿化，因此脱氯就成为p c p 降解的关键步骤。 根据生物过程对氧气的需要与否，脱氯过程可以分为好氧和厌氧途径。在好氧系统 中，氯取代程度低的氯酚容易生物降解，速率较快，而氯取代程度高的氯酚类化合物如 p c p 等难以降解【7 1 。厌氧状态下的还原脱氯是氯代芳香族化合物生物降解的重要途径之 一。p c p 中多个氯原子的较强的吸电子作用使苯环上电子云密度降低，在好氧条件下， 氧化酶很难从苯环上获取电子；相反，在厌氧条件下，环境氧化还原电位较低，五氯苯 酚在酶作用下易受到还原剂的亲核进攻，氯原子很容易被亲核基团取代，显示出较好的 厌氧生物降解性j 。 在厌氧或缺氧条件下p c p 生物降解方面的研究表明，在适宜的条件下，厌氧环境中 存在大量潜在的降解氯酚的微生物。不过至今仅发现几个属的微生物( 如 江南大学硕士学位论文 d p s “历t o b a c t e r i u m 9 , 1 0 f f d e s u l f o m o n i l e 1 1 1 ) 能对p c p 进行严格地厌氧脱氯降解。这是因为 大多数还原脱氯需要多种微生物的参与，首先多种微生物共存易于创造厌氧环境；其次， 一种微生物要靠其他微生物作为电子受体和供体；另外一种微生物可以借助其他微生物 消除抑制性的中间代谢产物，从而使降解进一步完成。 1 3 基于1 6 sr r n a 的微生物分子生态学研究方法 培养微生物时，因改变原初生长环境造成部分微生物死亡，部分微生物进入孢子休 眠期停止增殖【1 2 1 ，即微生物不可培养性。由于环境中9 9 的未培养微生物无法用传统方 法分离【1 3 1 ，造成从环境中筛选新活性物质的几率逐步减少，同时对微生物的变异和多样 性认识存在着很大偏差。克服因微生物培养技术造成的缺陷，阐明微生物种群结构、遗 传多样性及其与环境间的相互关系，必须依靠以分子生物学方法为基础的分子生态学。 微生物分子生态学方法弥补了传统的微生物生态学方法的不足，使人们可以避开传 统的分离培养过程而直接探讨自然界中微生物的种群结构及其与环境的关系。目前，要 确定一个分离物为一个分类单元，或证明属于一个新的分类单元，最可靠的方法是进行 r r n a 分析。因为r r n a 在所有微生物中功能和进化上是同源的，已成为一个分子指标 【1 4 1 ，广泛地用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究，加上大量已知微生物的d n a 都已被测定并输入了国际基因数据库，成为对微生物鉴定分类非常有用的参照系统，可 以通过对未知微生物d n a 序列的测定和比较分析，达到对其进行快速、有效的鉴定分 类的目的，从而精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性。 真核生物的r r n a 包括5 sr r n a 、1 6 sr r n a 和2 3 sr r n a 三种类型。5 sr r n a 所含核苷 酸数太少，包含的遗传信息不具有代表性；而2 3 sr r n a 所含核苷酸( 2 9 0 0b p ) 太多，测序 分析困难；1 6 sr r n a 的全长约为1 5 4 0b p ，片段长度适中，信息量较大且易于分析。因 此1 6 sr r n a 测序分析在实际应用中最广泛，1 6 sr r n a 分析使微生物学家对原核生物系 统发育有了新的认识，并导致三界系统理论的出现。其分子大小适中，存在于所有的生 物中，特别是其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，既能体 现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术来较容易地得到其序歹u t l s , 1 6 】。 1 6 sr r n a 分子生物技术的基本方法有：d n a 指纹技术、1 6 sr r n a 文库的建立、d n a 测序及微生物分类鉴定( 即系统发育树分析) 、基因探针设计和测试、荧光原位杂交和核 酸印迹杂交等【1 4 】( 图1 1 ) 。其中，d n a 指纹技术，又称为多态性分析，可以用于上述 d n a 片段的分离，它们包括如变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e mg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) ，温度梯度凝胶电泳( t e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ， t g g e ) ，单链构象多态性分析( s i n g l es t r a i nc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ，s s c p ) ，限制性 片段长度多态性分析( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) ，末端限制性片 段长度多态性分析( t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e ml e n g t hp o l y m o r p h i s m ，t - r f l p ) 等。 2 第一章绪论 斑 富集和纯种分离 - ， i 协i6 攥由fn - r n a 、 t i 氍】 乞、i a l l l i # u v i ， i ”口己i 翰谘斗 ，暖同 臌= 篓 细菌细胞睹 - 定隆 l 1 6 5r d n a 测序 序列比较- 系统发育树分析 图1 - 1 以1 6 sr r n a 为基础的微生物分子生态技术 f i g 1 - 1t h em o l e c u l a rt e c h n i q u e sb a s e do n1 6 sr r n a 1 3 1 末端限制性片段长度多态性 t r f l p 是是一种新的微生物分子生态学技术【1 7 1 ，融合p c r 技术、r f l p 技术和d n a 测序技术所产生的一种全新、快速、有效的微生物群落结构分析方法。主要操作方法( 图 1 2 ) ：首先选取一段具有系统进化标记特征的d n a 序列作为目的分析序列，根据序列 的保守区设计引物，引物的57 用荧光物质标记，然后提取待分析样品的总d n a ( 步骤1 ) ， 以它为模板进行p c r 扩增，所得到的p c r 产物一端就带有这种荧光标记( 步骤2 ) 。将 p c r 产物用合适的四碱基的限制性内切酶消化，由于酶切位点会存在差异，酶切后就产 生许多不同长度的限制性片段( 步骤3 ) 。酶切产物用d n a 自动测序仪进行检测获得峰 值图，末端限制性片段( t r f ) 或者称作操纵分类单元( o t u ) 被检测到，而其它没带 荧光标记的片段则检测不到( 步骤4 ) 。因为一种茵的t r f 长度是唯一的，所以峰值图 上的每一个峰至少代表了一种菌。在峰值图上，每个峰面积所占总面积的百分数就代表 了这种t r f 的相对数量 1 引。 t r f l p 技术能够提供微生物种群结构和数量动态变化的信息，可降低图谱的复杂 性，使结果易于分析，且重复性好，为人们分析和比较环境样品微生物群落结构提供新 的手段。目前该技术已被广泛地应用到了菌种的鉴定【1 9 】、各种微生物群落的比较分析、 研究微生物群落多样性及结构特征【2 0 】等方面，该方法结合克隆、测序，不仅可对已知菌 进行鉴定，还有助于发现新的未知菌。 3 江南大学硕士学位论文 图l - 2t - r f l p 技术原理 f i g i - 2s c h e m eo ft - r f l pp r o t o c o l 1 3 21 6 sr r n a 基因克隆丈库 研究中一般采用t - r f l p 等技术进行微生物群落的初步分析，而用建立细菌1 6 sr r n a 基因克隆文库的方法进行更为深入的分析。构建1 6 sr r n a 克隆文库是微生物分子生态学 中用来调查环境中原核微生物组成的常用方法之一【2 1 1 。1 9 9 0 年，g i o v a n n o n i 等阱】首先用 这一方法分析马尾藻海海面浮游微生物的多样性，因为这一方法不需要得到环境中微生 物的纯培养，突破了用传统的微生物分离纯化的方法调查环境中微生物多样性时很多微 生物无法得到纯培养的限制【2 1 1 ，因此这一方法目前已经广泛运用于土壤、海洋、湖泊、 肠道等多种生态系统中微生物多样性的调查，并且揭示了环境中前所未知的微生物多样 性【2 3 1 。 t a m a k i 等【2 4 】通过构建1 6 sr r n a 文库分析t k a s u m i g a u r a 湖底细菌群落多样性，实验 显示该湖底细菌群落具有明显的多样性，并发现了一些未知菌种。k a t h l e e n 等【2 5 】将c r a t e r 湖分离出的浮游细菌1 6 sr r n a 序列与构建的文库比对，发现高通量培养方法是传统分离 培养方法的改进。它可以分离出环境中的优势菌和与文库中序列不一致的菌种，同时也 证实光合作用是新鲜水源中重要的生理过程。t i my a n g j i e 等 2 6 】利用1 6 sr r n a 文库构建 法分析了由垃圾填埋引起污染的地下水中微生物群落，实验显示微生物群落中9 5 9 为 细菌，其中优势菌为变形细菌，占细菌总量的6 3 5 。 构建1 6 sr r n a 克隆文库的一般步骤：1 ) 环境中总d n a 的提取和纯化。2 ) 1 6 sr r n a 的p c r 扩增。p c r 扩增引物的选择是依据所要研究的细菌类别以及所需扩增的片段，根 据1 6 sr r n a 的结构特征，设计合成了一系列可用于所有细菌1 6 sr r n a 全长或某些高变 区扩增的通用引物，其中引物2 7 f - 1 4 9 2 r 可以扩增获得所有细菌的1 6 sr r n a 全基因。p c r 扩增获得产物中，包含了样品中所有目的微生物的1 6 s rr n a ，因而需要将这些混合的 1 6 sr r n a 分开，并对其中的序列进行进一步的分析。目前最常用的手段是将p c r 扩增产 4 第一章绪论 物与适当的载体连接、转化大肠杆菌来构建样品的1 6 sr r n a 克隆文库，并通过测定克隆 片段的序列来进一步判断环境中细菌的系统类群，确定所含类群的数引2 7 】。3 ) r r n a 基 因序列的比较分析。1 6 sr r n a 之间序列的差异可以反映不同生物之间的进化关系，在 g e n e b a n k ( h t t p ：l l w w w n c b i n l m n i h g o v ) 和r d pi i ( r i b o s o m a ld a t a b a s ep r o j e c ti i ， h t t p ：r d p c m e r o s a e d u h t m l ) 数据库中已经登录了大量不同生物的1 6 sr r n a 序列，因此 知道了1 6 sr r n a 的序列信息以后，就可以在上述数据库中进行序列比对，找到这些序列 相应微生物的系统发育地位。 1 4p c p 的厌氧处理技术 上流式厌氧污泥床反应器( u p f l o wa n a e r o b i cs l u d g eb l a n k e t ，简称u a s b ) 在运行过程 中出现一种具有优良理化和生物学特性、产甲烷活性很高的颗粒状厌氧污泥。颗粒污泥 具有极好沉降性能，因而能在很高的产气量和液体上流速度下存留在厌氧反应器内，使 u a s b 反应器内维持高浓度的生物量。用u a s b 反应器处理氯酚废水的研究并不多见， 尽管这种反应器具有很好的潜能。首先，颗粒污泥提供了复杂的微生物环境，这些微生 物具有不同代谢微环境和活性。其次，u a s b 是一个连续系统，有固定化的生物量，与 间歇培养相比，给微生物提供了非常不同的环境条件。 一些采用u a s b 反应器处理氯酚化合物的研究结果如下：h e n d r i s k s e n 等用来源于含 糖废水的颗粒污泥处理p c p , 进水中的p c p 和苯酚浓度分别4 5m g l 和2 3m g l ，再加入1 g ，l 的葡萄糖作为补充碳源，在稳态条件下p c p 的脱氯为9 9 t 2 8 】。w u 采用具有p c p 降解 能力的富集培养物和用v f a 培养的颗粒污泥共同作为接种物，进水p c p 浓度4 0 6 0m g l ， 以甲醇、乙酸、丁酸和丙酸为补充碳源，发现p c p 去除率为9 8 9 9 ( 2 9 1 。w o o d s 用城市污 水消化池污泥接种，p c p 被立即脱氯，形成低位氯取代化合物【3 0 1 。 因为直接应用颗粒污泥可能并不具备最佳脱氯活性，富集培养和纯培养可以用来增 加u a s b 反应器的处理效果，将可以催化专一降解步骤或代谢途径的培养物固定在复杂 的颗粒污泥中。如w u 和c h r i s f i a n s e n & a h r i n g 在u a s b 反应器中分别将d e s u l f o m o n i l e t i e d j e f 和d e c h l o r o s p o r i u mh a f n i e n s e 成功的引进颗粒污泥，获得了对p c p 的脱氯能力【j o 3 i l j 。 在第三代厌氧反应器中，e g s b 反应器虽然在结构形式、污泥形态等方面与u a s b 非常相似，但其工作运行方式与u a s b 显然不同，其显著特征为具有较高的上升流速( 最 高可达10mh 1 ) ，高的液体表面上升流速使颗粒污泥床层处于膨胀状态，不仅实现了水 力停留时间和污泥停留时间的分离，而且使进水和污泥之间保持充分的接触，有利于基 质和代谢产物在颗粒污泥内外的扩散、传送，保证了反应器在较高的容积负荷条件下正 常运行。其特点包括：( 1 ) 液体表面上升流速大，从而使反应器中传质效果好；( 2 ) 采用 颗粒污泥接种，并且颗粒污泥结构良好，抗冲击负荷能力强；( 3 ) c o d 去除负荷高，特 别是在低温条件下处理中低浓度废水时，优势明显；( 4 ) 高径比( h d ) 较大，占地面积小 等特点，被认为是最有前途的第三代厌氧反应：h 器r 3 2 1 。e g s b 反应器具有耐冲击负荷能力 强的特点，可能是处理有毒废水的适宜反应器，但是至今有关报道甚少d 3 1 。 5 江南大学硕士学位论文 1 5 论文研究的意义、研究目标和主要研究内容 1 5 1 研究意义 由于p c p 是氯酚族中最难降解的化合物之一，无论是经济成本，还是环境效益，生 物厌氧降解都是自然环境中消除p c p 污染的最佳选择。作为降解的关键步骤，p c p 厌氧 脱氯和补充碳源的关系、与外加电子供体的关系，p c p 的脱氯降解途径目前仍然缺乏明 确的结论，有待于进一步研究。 此外，鉴于传统培养的局限性，分离到的物种并不能真实反映厌氧降解p c p 的微生 物多样性信息，因此有必要从分子生物学、基因工程学等方面加强基础研究，目前仅有 应用分子生物学技术对p c p 降解生物群落多样性进行研究的少量报道。而对添加不同外 加碳源和电子供体条件下p c p 厌氧降解微生物群落结构的变化特性研究，国内外还鲜见 报道。 现代厌氧反应器处理废水的一个新趋势是难降解和有毒物质的处理。p c p 作为多种 工业来源的有毒废水，对环境中的人和其它生物有极大的危害。而应用e g s b 反应器处 理p c p 废水的报道极少，已有报道对颗粒污泥的驯化、反应器的启动和运行条件的探索 不够深入细致，继续这方面的研究可以为应用e g s b 反应器处理p c p 废水的提供必要的 策略，组合有效的单一工艺形成合理的综合处理工艺流程，以达到从水中消除p c p 污染 的目的。 1 5 2 研究目标 ( 1 )研究外加碳源和电子供体对p c p 降解的影响，以及p c p 脱氯降解行为，探讨 p c p 的脱氯降解规律。 ( 2 )利用t - r f l p 技术分析外加碳源、电子供体条件下p c p 降解茵群的微生物群落 结构变化。 ( 3 )通过构建1 6 sr r n a 基因克隆文库方法深入研究p c p 降解体系中脱氯微生物的 具体组成及多样性。 ( 4 )运用e g s b 反应器处理p c p 废水，完成反应器处理效能的过程参数优化。 1 5 3 研究内容 本文主要研究内容如下： ( 1 )研究厌氧状态下酵母膏、葡萄糖、丙酮酸作为共代谢基质，h 2 作为外加电子供 体，深入探讨外加碳源和电子供体对p c p 降解的影响，以及p c p 脱氯降解行为。 ( 2 )借助t r f l p 技术对比研究在不同外加碳源及氢气处理条件下p c p 降解菌群的 微生物群落结构变化，并对样品中可能存在的优势微生物进行了推测，旨在为全面认识 p c p 厌氧降解微生物的多样性及降解机理提供有用的信息。 ( 3 ) 构建1 6 sr r n a 基因克隆文库方法深入研究p c p 降解体系中脱氯微生物的具体 组成及多样性，对p c p 厌氧降解体系中微生物群落组成及系统发育多样性进行分析。 ( 4 ) 应用实验室规模的e g s b 反应器处理p c p 废水，对反应器进行启动和运行研究， 6 第一章绪论 优化降解p c p 和去c o d 的条件。 7 江南大学硕士学位论文 2 1 引言 第二章五氯苯酚的厌氧生物降解 在绪论中谈到，氯代芳烃降解的限速步骤为脱氯，其降解始于一个或几个脱氯步骤， 以氢原子取代氯，释放氯离子。p c p 具有还原脱氯活性，可形成低氯代苯酚或完全矿化 形成的c 0 2 、c i q 4 、h 2 0 和h c l ，它们的还原脱氯活性及氯酚降解历程受接种物、驯化物、 驯化时间、电子供体和电子受体的影响。在厌氧环境中进行的脱氯活动，大多都是在混 合培养中发现，表明厌氧混合培养的微生物群落在脱氯过程中，各微生物类群之间存在 相互协作的关系。 此外，p c p 的还原脱氯可以通过共代谢途径进行。共代谢是指当生长基质存在时， 生长基质的代谢能够提供足够的碳源和能源供微生物生长，并诱导产生相应的降解酶来 降解非生长基质，改变非生长基质的化学结构，最终达到降解非生长基质的目的。 近年来，许多研究者发现，在厌氧条件下有很多菌种能够在发酵的过程中产生h 2 ，并 且利用的基质很广【3 4 娜】，而h 2 又是一种有效的电子供体，可以提供还原脱氯所需的电子， 因此，将产氢过程和脱氯过程有效结合起来，将是研究加速脱氯的一个新方向。 由于p c p 的广泛应用和较易发生厌氧降解，本文研究厌氧状态下酵母膏、葡萄糖、 丙酮酸作为共代谢基质，h 2 作为外加电子供体，深入探讨外加碳源和电子供体对p c p 降解的影响，以及p c p 脱氯降解行为，以期对p c p 的脱氯降解规律有更深入的了解。 2 2 材料与方法 2 2 1 种泥来源及驯化 种泥取自无锡格林艾普化工厂车间地沟的底泥。驯化方法如下：培养基为r a m m 培养基【3 6 】。取2 0 0g 种泥加入到5 0 0m l 带有上下嘴的摇瓶。用o 0 2m o l ln a o h 溶解 p c p ，配制成l g l 的贮备液，根据试验需要配制不同浓度。驯化过程中逐渐增加p c p 的投入量，其终浓度由5m g l 到2 0m g l 。每周更新一次培养基。锥形瓶用橡胶塞塞紧， 充入氮气2r a i n 以保持摇瓶内为厌氧状态，p h 调节至7 0 。摇瓶置于摇床中培养( 3 5o c ， 1 2 0r m i n ) 。每周更新培养基时测定摇瓶内p c p 的浓度。 2 2 2 实验设计 分别考察上述驯化培养物在四种处理情况下对p c p ( 2 0r a g l ) 的厌氧降解特性。处理 一：加入2g l 葡萄糖作为外加碳源；处理二：加入1 0m m o f l 丙酮酸作为外加碳源：处 理三：加入1g l 酵母膏作为外加碳源；处理四：不添加外加碳源( 对照组) ；处理五：充 入氢气( 氢气处理组，氢气：二氧化碳：氮气的体积比为l ：1 ：8 ) 。除第五个处理外，其它 四个处理中均充入氮气以保持厌氧环境。以上各处理组各设三个重复。每隔一天测定一 次p c p 的浓度。同时还考察了不同葡萄糖浓度( 1g l 、2g l 、5g l 和1 0g l ) 对p c p 降解的 影响。 第二章五氯苯酚的厌氧生物降解 2 2 3p c p 的测定 采用高效液相色谱法( a g i l c n t1 1 0 0 ) 。p c p 的测定条件为：c 1 8 柱，柱温3 0o c ，流动 相中甲醇占9 0 ，2 乙酸占1 0 ；检测波长为2 2 0n t n ，带宽2 0n i n ：流速1m l m i n 。 2 2 4c o d 的测定 c o d 用快速测定法测定。 2 2 5p h 的测定 p h 值采用p h s 3 精密数显酸度计测定。 2 2 6g c m s 测定方法 水样预处理：从摇瓶中取1 0 0m l 上清液，经2 0 0 0r p m 速度离心1 0r a i n ，加入浓硫 酸1 血至上清液，振荡1r a i n ，加入3 0m l 二氯甲烷在分液漏斗中强烈振荡1m i n ，静置 1h 后取有机相，将经过5 0 0o c 烘干的无水硫酸钠1 0g 加入二氯甲烷萃取液中，脱去少 量的水，过滤，取滤液在4 0o c 水浴中蒸发二氯甲烷至5m 1 ，最后经0 2 2p x n 的微孔滤 膜过滤进行g c m s 分析。 g c m s 分析方法：采用美国f i n n i g a nm a t 公司产t r a c ec r c 和t r a c em s 联用 的方法分析。g c 条件为：o v l 7 0 1 毛细管色谱柱，3 0m x 0 2 5 衄。升温从8 0o c 2 4 0o c ， 升温速度1 5o c m i n ，在2 4 0o c 保持1 5r a i n ，以氦气为载气。m s 条件：f f 接口温度， 2 5 0o c ；离子源温度，2 0 0o c ；灯丝发射电流，1 5 0 衅；电子能量，7 0e v ；检测器温度， 3 5 0o c 。 2 3 结果与讨论 2 3 1 厌氧驯化阶段p c p 降解及c o d 的去除 二个月后，实钡t j p c p 浓度，p c p 的去除率在5 0 以上，c o d 去除率达到9 0 以上，降 解体系稳定，证明该样品具有降解p c p 的能力( 图2 1 ) 。 时间( d ) 图2 - 1 驯化阶段p c p 及c o d 的去除率 f i g 2 1c o d a n dp c pr e m o v a lr a t e sd u r i n ga c c l i m a t i z a t i o n c o d ；一p c p 9 江南大学硕士学位论文 2 3 2 不同外加碳源及氢气对p c p 降解的影响 经驯化的培养物在以葡萄糖、丙酮酸、酵母膏作为外加碳源条件下，p c p 降解趋势 明显( 图2 2 ) 。p c p 的浓度由初始的1 0 1 6m g l 降到8m g l 以下，去除率分别达到7 1 、5 1 和5 6 。不加碳源处理( 对照组) 中，p c p 的去除率较低( 1 8 ) ( 图2 3 ) 。这一研究结果与其 它研究发现相同，可能说明p c p 的厌氧还原脱氯过程确实是依赖初级基质的共代谢过程 【z 引。外加碳源存在时，p c p 降解微生物可以部分利用所投加的基质作为其生长所需的碳 源生长，以缓解p c p 对其的抑制；同时易降解基质的存在，也有利于各种微生物的迅速 繁殖，增强了微生物活性，这样不同物种间可以以协同的作用方式促进p c p 的脱氯降解 p 7 。结果还显示，氢气处理组的去除率也较高，达7 4 。p c p 的厌氧脱氯是一个需要电 子供体的还原过程，氢气可作为良好的电子供体，其还原脱氯能力在很多氯代芳烃降解 实验中均得到证实【3 8 】。国内其它学者也发现类似的结果【3 9 , 4 0 】。 图2 2 不同p c p 浓度下的p c p 降解曲线 f i g 2 - 2d e g r a d a t i o nc u r v e so fp c p a tp c pd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s 葡萄糖；酵母膏；丙酮酸；对照；氢气 图2 - 3 不同条件下的p c p 去除率 f i g 2 - 3p c pr e m o v a lr a t e sa td i f f e r e n tc o n d i t i o n s 2 3 3 不同葡萄糖浓度对p c p 降解的影响 如图2 4 、2 5 所示，外加碳源的添加有一个适量的浓度范围。外加2g l 的葡萄糖 l o 第二章五氯苯酚的厌氧生物降解 时，p c p 的降解作用最显著，随着葡萄糖添加量由lg l 增加到2g l ，p c p 的去除率从 5 5 增加7 0 。而添加葡萄糖的量超过2g l 后，p c p 去除率下降。葡萄糖的添加量为 1 0g l 时，去除率为4 1 。这可能是葡萄糖浓度相对较低时( 1g l ) ，虽然能提供易降解 的碳源促进微生物迅速增殖，但不足以持续地维持厌氧体系中微生物的生长，导致p c p 降解有限。然而，当葡萄糖浓度增加至2g l 后，由于碳源充足，p c p 降解菌占优势， 此时p c p 可以达到较高的去除率。过高的葡萄糖添加浓度( 1 0g l ) 可以导致非降解p c p 的微生物大量繁殖，与降解p c p 的优势菌竞争营养物质，从而导致p c p 的去除率下降。 时间( ” 图2 4 不同葡萄糖浓度下p c p 的降解曲线 f i g 2 - 4d e g r a d a t i o nc u r v e so fp c pa td i f f e r e n tg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n s l g l ；4 2 9 l ；0 5 9 l ；1 0 9 l 葡萄糖浓度( g l ) ， 图2 - 5 不同葡萄糖浓渡下p c p 的降解