（发育生物学专业论文）褪黑素拮抗可卡因引燃诱导的cpp强化和相关脑区△fosbags3th的表达.pdf

灿 y 17 6 9 3 7 9 目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要4 二、英文缩略语7 三、论文 前言8日舌8 材料与方法1 0 实验结果1 3 讨论1 9 结论2 2 四、本研究的创新性的自我评价2 3 五、参考文献2 4 六、附录 综j 苤2 9 在学期间科研成绩3 9 致谢4 0 个人简介4 1 中文论著摘要 褪黑素拮抗可卡因引燃诱导的c p p 强化和相关脑区 f o s b a g s 3 t h 的表达 刖吾 可卡因成瘾以依赖、戒断困难、易于复吸为主要特征。目前临床上使用的戒 毒药因为其本身存在神经毒性和精神行为异常的副作用而未能得到毒品吸食者的 广泛接受。寻找安全、有效的戒毒药品是目前戒毒研究领域的当务之急。 大量实验证明褪黑素在药理剂量下发挥多种功效，而且其本身并无明显的耐 受性和依赖性。褪黑素改善吗啡依赖大鼠的戒断症状，这一报道为褪黑素作为用 于治疗中枢兴奋药依赖的潜在性治疗药物而加以开发利用带来了可能。褪黑素受 体在多巴胺环路等脑区广泛分布，且为g i 型g 蛋白偶联受体。此外，褪黑素可 能作为c a ：+ c a m 的拮抗剂结合c a m ，并抑制神经系统内含量丰富的c a m ki i 的 激活和自身磷酸化，从而使得c a m k i i 对神经元的调节功能减弱或丧失。褪黑素 通过上述两条或更多的未知途径发挥其负向调节作用。 大量研究表明，可卡因主要作用于中脑边缘多巴胺系统，除影响多巴胺合成 限速酶t h 的活性外，主要通过阻断多巴胺转运子( d a t ) 对多巴胺重吸收，进 而引起突触的d a 堆积以及d 1 和d 2 多巴胺受体介导的受体后信号级联反应发挥 其中枢兴奋作用。通过观察褪黑素信号通路和可卡因作用的多巴胺信号通路可以 发现，a c 、c a m p 和c a ：+ c a m 是两条途径共同的重要分子。 本研究通过采用动物行为学测试c p p ( 条件性位置偏爱) 方法建立大鼠可卡因 依赖动物模型【2 0 1 ，并以褪黑素信号通路和可卡因作用的多巴胺信号通路两条途径 共同的重要分子为切入点探讨m t 和松果体摘除术对可卡因引燃诱导的c p p 强化 和可卡因依赖相关蛋白z x f o s b a g s 3 t h 在相关脑区表达的作用，为寻找对可卡因 依赖有效的药物治疗新靶点提供实验室依据。 方法 1 、动物模型建立 ( 1 ) 大鼠松果体摘除手术及假手术 ( 2 ) 可卡因依赖大鼠动物模型即c p p 的建立、戒断和引燃 2 、w e s t e mb l o t t i n g 检测褪黑素对可卡因引燃诱导的相关脑区 f o s b a g s 3 t h 表达的作用 检测盐水组、可卡因组和褪黑素可卡因组三组以及松果体摘除组和假手术组 两组大鼠的p f c 、n a c 、c p u 、h i p 、a m y 和v t a 等各脑区内 f o s b a g s 3 t h 表达。 3 、共聚焦激光扫描显微镜技术检测f o s b 的表达 检测盐水组、可卡因组和褪黑素可卡因组各组大鼠h i p 、c p u 和n a c 部位 k f o s b 的表达。 结果 l 、可卡因依赖大鼠模型成功建立、戒断和引燃 ( 1 ) 可卡因诱导后可卡因组及褪黑素可卡因组c p p 均偏爱伴药箱( 白箱) ， 可卡因诱导后松果体摘除组的c p p 偏爱分数较假手术组的低。 ( 2 ) 可卡因戒断后各组动物的c p p 均恢复到诱导前的生理偏爱。 ( 3 ) 可卡因引燃后褪黑素可卡因组的c p p 偏爱分数显著低于可卡因组。 2 、w e s t e mb l o t t i n g 结果显示褪黑素或松果体摘除可拮抗可卡因引 燃对三个靶蛋白的调节 ( 1 ) 可卡因引燃诱导相关脑区a f o s b 的累积，褪黑素抑制除伏核外相关脑 区该分子的表达。松果体摘除抑制可卡因引燃对海马a f o s b 表达的上调。 ( 2 ) 可卡因引燃下调了腹侧被盖区a g s 3 表达，上调了a g s 3 在额前皮质和 尾状壳核的表达，褪黑素可抑制此下调和上调作用。 2 ( 3 ) 可卡因引燃降低额f j i 皮质和腹侧被盖区t h 的表达，增加t h 在尾状壳 核和杏仁核的表达，褪黑素可抑制此降低和增加作用。松果体摘除抑制可卡因引 燃上调杏仁核t h 表达的作用。 3 、激光共聚焦扫描显微镜技术检测a f o s b 的表达 可卡因引燃诱导a f o s b 在h i p 、c p u 和n a c 的高表达，褪黑素拮抗前两个脑 区的此诱导作用。 结论 褪黑素拮抗可卡因引燃诱导的c p p 强化，褪黑素抑制可卡因引燃诱导的相关 脑区内t h 、a g s 3 和a f o s b 表达。褪黑素拮抗可卡因引燃诱导的c p p 强化作用 可能是通过拮抗可卡因对相关脑区t h 、a g s 3 和a f o s b 的诱导实现的。 关键词 可卡因；条件性位置偏爱；褪黑素；松果体摘除；a f o s b ；a g s 3 ；t h 3 英文论著摘要 m e l a t o n i nc o u n t e r a c t sr e i n s t a t e m e n to fc o c a i n e p r i m i n g i n d u c e dcp pa n daf o s b a g s 3 t h e x p r e s s l o ni nr e l a t e c id r a i nr e r l o n s 1 i n t r o d u c t i o n m a j o rf e a t u r e so fc o c a i n ea d d i c t i o nc o n t a i nl o n g - t e r m i n g ，d i f f i c u l t yt oe x t i n c ta n d v u l n e r a b i l i t yt or e l a p s e g i v e nt h e i rs i d ee f f e c t st h a tn e u r o t o x i c i t ya n da b n o r m a li n b e h a v i o r s ，t h o s ea v a i l a b l em e d i c i n ef o ra d d i c t i o ns t i l lu n p o p u l a ra tp r e s e n ta m o n g p e o p l et a k i n gi nd r u g i ti su r g e n tp r i o r i t yt ol o o kf o rs a f ea n de f f e c t i v em e d i c i n ef o r t r e a t m e n to fa d d i c t i o n r e s u l t si n d i c a t e dt h a tm e l a t o n i n p o s s e s s e dm u l t i p l e f u n c t i o n sw i t h i n p h a r m a c o l o g i c d o s ew i t h o u tt o l e r a n c ea n dd e p e n d e n c ei ni t s e l f t h e r e p o r tt h a t m e l a t o n i ni m p r o v e dm o r p h i n ei n d u c e d a b s t i n e n ts y m p t o mi nr a t s ，w h i c hb r o u g h ti t p o s s i b l et h a td e v e l o p m e n to fm e l a t o n i na sp o t e n t i a lm e d i c i n ef o rt r e a t m e n to fd i s o r d e r i n d u c e db yp s y c h o s t i m u l a n t s m e l a t o n i nr e c e p t o r s ，c o u p l e dt og a i ，w i d e s p r e a di n l i m b i cd o p a m i n es y s t e m a l s o ，m e l a t o n i nm a ya n t a g o n i z ec a 2 + c a mb yb i n d i n gc a m ， a n di n h i b i tt h e a c t i v a t i o na n da u t o p h o s p h o r y l a t i o no fc a m k i i ，l e a d i n gt od e c r e a s e r e g u l a t i o no fc a m k i io nn e u r o n m e l a t o n i nw a sr e p o r t e dt oe x e c u t en e g a t i v ee f f e c t sb y m o r et h a nb o t hp a t h w a y s i tw a sr e p o r t e d ，c o c a i n ea f f e c t e dm a i n l yl i m b i cd o p a m i n es y s t e m ，p r e v e n t i n g r e - u p t a k eo fd a t o nd o p a m i n e ，a sw e l la sa f f e c t i n gt h ，w i t hd o p a m i n ea c c u m u l a t i o n a n dr e c e p t o r sm e d i a t e d s i g n a l i n gc a s c a d et op r o d u c er e w a r d w i t ho b s e r v i n gm e l a t o n i n s i g n a l i n ga n dc o c a i n ea f f e c t e ds i g n a l i n gp a t h w a y s ，a c ，c a m pa n dc a 2 + c a mw e r e r e g a r d e da sk e ym o l e c u l e si nb o t hp a t h w a y s o u rs t u d yt r yt o i n v e s t i g a t et h e e f f e c t so fm e l a t o n i na n dp i n e a l e c t o m yo n 4 r e i n s t a t e m e n to fc o c a i n ep r i m i n gi n d u c e d c p pa n d a f o s b a g s 3 t he x p r e s s i o ni n r e l a t e db r a i nr e g i o n s ，b ya d o p t i n gc p p a s s a ya n de s t a b l i s h i n ga n i m a lm o d e l ，i nv i e wo f c o m m o nm o l e c u l e si nb o t hm e l a t o n i np a t h w a ya n dc o c a i n e p a t h w a y a n dn e wt a r g e t s f o rt r e a t i n ge f f e c t i v e l yc o c a i n ea d d i c t i o nm a y b ef o u n di np r e s e n ts t u d y m e t h o d s 1 e s t a b l i s h m e n to fa n i m a lm o d e l ( 1 ) p i n e a l e c t o m ya n ds h a m o p e r a t i o ni nr a t s ( 2 ) c o n d i t i o n i n g , w i t h d r a w a l ，a n dp r i m i n go fc p pi na n i m a lm o d e lo fc o c a i n e a d d i c t i o n 2 e f f e c t so fm e l a t o n i no nm o d u l a t i o no fc o c a i n e p r i m i n gi n d u c e d f o s b a g s3 t he x p r e s s i o ni se x a m i n e d b yw e s t e r nb l o t t i n g a f o s b a g s 3 t he x p r e s s i o ni se x a m i n e db yw e s t e r n b l o w i n gi np f c ，n a c ，c p u ， a m ya n dv t af r o m s a l i n e ， c o c a i n e ，m e l a t o n i na n d c o c a i n e ，p i n e a l e c t o m y s h a m o p e r a t i o n 3 a f o s be x p r e s s i o ni si n v e s t i g a t e db yc o n f o c a l m i c r o s c o p y a f o s be x p r e s s i o ni se x a m i n e db yc o n f o c a lm i c r o s c o p yi n h i p , c p ua n dn a c f i - o ms a l i n e ，c o c a i n e ，a n dm e l a t o n i na n dc o c a i n e r e s u l t s 1 a n i m a lm o d e lo fc o c a i n ea d d i c t i o nw a ss u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e d ， e x t i n g u i s h e d ，a n dp r i m e d ( 1 ) c o c a i n eg r o u pa n dm e l a t o n i n - c o c a i n e g r o u pp r e f e r r e df o r ( 1 r u g - p a i r e d c o m p a m l l e l l ta f t e rr e p e a t e dc o c a i n ea d m i n i s t r a t i o ni nc p p a s s a y t h ep r e f e r e n c eo f p i n e a l e e t o m yg r o u pw a sl o w e rt h a ns h a m - o p e r a t i o ng r o u pi nc p p a s s a ya f t e rr 印e a t e d c o c a i n ea d m i n i s t r a t i o n ( 2 ) n a t u r a lp r e f e r e n c ew a sr e s t o r e da f t e rw i t h d r a w a lf o l l o w e dr e p e a t e dc o c a i n e a d m i n i s t r a t i o ni ne a c hg r o u p 5 ( 3 ) c o c a i n ep r i m i n gi n d u c e dc p pr e i n s t a t e m e n t i nm e l a t o n i n - c o c a i n eg r o u p ， w h i c hw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a to fc o c a i n e 2 r e s u l t sf r o mw e s t e r nb l o t t i n gi n d i c a t e dt h a tt h er e g u l a t i o no ft h r e e t a r g e t s i n d u c e d b y c o c a i n ep r i m i n gw a sc o u n t e r a c t e d b ym to r p i n e a l e c t o m y ( 1 ) c o c a i n ep r i m i n gi n d u c e da f o s ba c c u m u l a t i o ni nr e l a t e db r a i nr e g i o n s ，m t i n h i b i t e di t se x p r e s s i o ni nm o s tb r a i nr e g i o n sb u tn a c p i n e a l e c t o m yc o u n t e r a c t e d a f o s bi n c r e a s ea f t e rc o c a i n ep r i m i n g ( 2 ) c o c a i n ep r i m i n gd e c r e a s e da g s 3e x p r e s s i o ni np f ca n dv t a ，a n di n c r e a s e d a g s 3e x p r e s s i o ni nc p u ，b o t ht h ed e c r e a s i n ga n dt h ei n c r e a s i n gw e r ei n h i b i t e db ym t ( 3 ) c o c a i n ep r i m i n gd e c r e a s e dt he x p r e s s i o ni np f ca n dv t a ，a n di n c r e a s e dt h e x p r e s s i o ni nc p u ，b o t ht h ed e c r e a s i n ga n dt h ei n c r e a s i n gw e r ei n h i b i t e db ym t p i n e a l e c t o m yc o u n t e r a c t e dc o c a i n ep r i m i n gi n d u c e d t hi n c r e a s ei na m y 3 a f o s be x p r e s s i o ni si n v e s t i g a t e db yc o n f o c a lm i c r o s c p p ya s s a y r e s u l t si n d i c a t e dt h a tm ti n h i b i t e d f o s ba c c u m u l a t i o ni nh i p ，c p ub u tn a c ， w h i c hw a si n d u c e db yc o c a i n ep r i m i n g co n c l u s i o n s m tc o u n t e r a c t st h er e i n s t a t e m e n to fc p pi n d u c e db yc o c a i n ep r i m i n g m t i n h i b i t e dm o d u l a t i o no fc o c a i n ep r i m i n go na f o s b a g s 3 t he x p r e s s i o n m t c o u n t e r a c t st h er e i n s t a t e m e n to fc o c a i n ep r i m i n gi n d u c e d c p p , w h i c hi sm e d i a t e d p o s s i b l yb yt h a g s 3 a f o s b k e yw o r d s c o c a i n e ；c o n d i t i o np l a c ep r e f e r e n c e ；m e l a t o n i n ；p i n e a l e c t o m y ；a f o s b ；a g s 3 ； t h 6 英文缩略语 7 循环中反复。复吸是药物成瘾治疗中一个亟待解决的难题。 药物戒毒是可卡因依赖治疗的首要环节。目前临床上使用的戒毒药品主要是 针对精神兴奋药受体的激动n 拮抗剂或钙通道阻滞剂等。这类药物能在一定程度 上控制毒品依赖，改善戒断症状，但是因为其本身存在成瘾和出现戒断症状的问题 或存在像过度镇静、致幻、震颤等神经毒性和精神行为异常的副作用而未能得到 毒品吸食者的广泛接受【5 ，6 】。寻找安全、有效的戒毒药品是目前戒毒研究领域的当 务之急。 褪黑素( m e l a t o n i n ，m t ) 是由体内松果体分泌的一种激素，因能使青蛙的皮肤 颜色改变而得名。大量实验证明，褪黑素在药理剂量下，除具有改善睡眠、治疗 时差反应综合症等作用外，还有抗衰老、参与学习记忆、镇痛、抗癌等多方面功 效，而且其本身并无明显的耐受性和依赖性【j 7 1 。近年来，褪黑素在多器官、多系统 的多种药理作用越来越受到人们的广泛关注。令人感兴趣的是，褪黑素能降低吗 啡戒断大鼠脑组织中信号传导的第二信使c a m p 的含量并改善吗啡依赖大鼠的戒 断症状【引。这一实验结果为褪黑素作为用于治疗中枢兴奋药依赖的潜在性治疗药 物而加以开发利用带来了可能。 褪黑素作为一种内源性的神经内分泌激素，其受体在多巴胺环路【9 】等脑区广 泛分布。研究证实，褪黑素受体分为m t l 、m t 2 和m t 3 三型，为g i 型g 蛋白 偶联受体。文献报道，褪黑素结合并激活受体后，g 蛋白解离出的a i 亚单位抑制 8 腺苷酸环化酶的活性，从而下调下游c a m p 、p k a 、c r e b 等分子及基因的表达 1 0 , 1 1 】。此外，除了通过膜受体起作用外，褪黑素可能作为c a 2 + c a m 的拮抗剂结合 c a m ，并抑制神经系统内含量丰富的c a m k i i 的激活和自身磷酸化，从而使得 c a m ki i 对神经元的调节功能减弱或丧失【l2 1 。褪黑素通过上述两条或更多的未知 途径发挥其负向调节作用。 大量研究表明，可卡因主要作用于起始于v t a ，并投射到伏核( n a c ) 或尾 状壳核( c p u ) ，杏仁核( a m y ) 和额前皮层( p f c ) 的中脑边缘多巴胺系统。可 卡因除影响多巴胺合成限速酶t h 活性外，主要通过阻断多巴胺转运子( d a t ) 对多巴胺重吸收，进而引起突触的d a 堆积以及d 1 和d 2 多巴胺受体介导的受体 后信号级联反应发挥其中枢兴奋作用【1 3 】。多巴胺受体d 1 和d 2 分别为g s 和g i 型g 蛋白偶联受体，解离出的o t s c t i 激活或抑制腺苷酸环化酶，生理条件下，两 者的平衡状态调节下游分子及基因表达，从而发挥多巴胺的生物学效应。长期可 卡因处理可诱导a g s 3 生成并持续上调，该分子可使d 2 受体偶联的g i 蛋白解离 出的0 【i 丧失对腺苷酸环化酶的抑制作用，从而使得d 1 受体信号和d 2 受体信号 之间的平衡移位而偏向d l 信号途径【h 】，导致多巴胺能神经突触后异常兴奋，这 使得d 1 受体下游胞内腺苷酸坏化酶，c a m p , p k a 的活性和浓度甚至下游的c r e b 和f o s 样蛋白如a f o s b 也可能被显著上调【2 , 1 5 】从而产生可卡因依赖的神经和行为 可塑性1 6 ，1 7 1 。另外，研究发现，c a 2 + 与d 2 受体信号之间有交叉，c a 2 + 可能通过激 活c a m 直接抑制d 2 受体信号【1 8 】。可卡因长期作用后可增加神经元内的c a 2 + 浓度 1 1 9 1 ，增加的c a 2 + 可能增强激活的c a m 对d 2 受体信号的抑制作用。 通过观察褪黑素信号通路和可卡因作用的多巴胺信号通路可以发现，a c 、 c a m p 和c a 2 + c a m 是两条途径共同的重要分子。褪黑素能否改善可卡因引燃诱导 的c p p 强化，以及此作用是否通过t h a g s 3 a f o s b 等多巴胺信号通路中的重要 分子完成，尚未见文献报道。 本研究采用动物行为学测试c p p ( 条件性位置偏爱) 方法建立大鼠可卡因依赖 动物模型【2 0 】，并以褪黑素信号通路和可卡因作用的多巴胺信号通路为切入点探讨 m t 和松果体摘除术对可卡因引燃诱导的c p p 强化和可卡因依赖相关蛋白 a f o s b a g s 3 t h 在成瘾相关脑区的表达的作用，为寻找对可卡因依赖有效的药物 9 治疗新靶点提供实验室依据。 一、试剂、仪器和动物 材料和方法 ( 一) 试剂 褪黑素( s i g m a ) 、a f o s b 抗体( c e l ls i g n a l i n gt e c h n o l o g y ) 、酪氨酸羟化酶( t h ) 抗体( s a n t ac r u z ) 和a g s 3 抗体( s a n t ac r u z ) ，h r p 标记相应二抗( s a n t ac r u z ) 。 盐酸可卡因购于青海第一制药厂( 中国西宁) 并溶于无菌生理盐水获取最终浓度。 褪黑素购于s i g m a 公司( 美国) ，先溶于少量无水乙醇后再充分混匀于生理盐水， 乙醇终浓度为5 。整个溶解过程需不断振摇。褪黑素溶液或介质在可卡因引燃前 3 0 分钟经腹腔注射给药。 ( 二) 仪器 大鼠脑立体定位仪( n a r i s h i g e ) 体视显微镜( m o t i c ) 条件性位置偏爱箱( z h ) 震荡切片机( z q p d x s l ) 共聚焦激光扫描显微镜( n i k o n ) 7 2 3 分光光度计( 上海光谱) 电泳仪( b i o r a d ) 半干转印仪( b i o - r a d ) 计算机图像采集分析系统( l a s 3 0 0 0 ) 离心机( s i g m a3 k 3 0 ) 超净台( h a i e r ) ( 三) 动物 使用s d 大鼠( 中国医科大学实验动物中心提供) 进行动物实验，实验初体 重2 2 0 克2 5 0 克，每笼5 只，食物和水可随意获取。室温2 4 ：t ：1 ，相对湿度5 0 ， 1 2 小时：1 2 小时昼夜循环( 6 时1 8 时光照) 。将动物分为生理盐水组、可卡因组、 1 0 褪黑素可卡因组、松果体摘除组和假手术组，每组9 只。在实验开始前动物适应 环境1 周，实验在z t l 5 ( 7 时1 1 时) 进行。 二、实验方法 ( 一) 松果体摘除 手术按照文献实施 2 1 1 。用2 戊巴比妥钠( 4 0 m g k g ，腹腔注射) 麻醉大鼠， 并于立体定位仪上固定头部。剃毛消毒并分离颅骨上皮肤，用钻钻矩形( 3 5 x 7 m m ) 凹槽( 包含矢状缝，从冠状窦向前约7 毫米长) 。骨瓣背翻取下，将硬脑膜沿纵行 静脉窦双侧划开，静脉窦两侧结扎后从中间剪开。由绳结拉起静脉窦，用钝性镊 子移除静脉窦下凹槽内的松果体，还原骨瓣，腹腔注射抗生素和温盐水，回笼恢 复7 天后进行实验。假手术与松果体摘除手术操作形似，只是不摘除松果体。 ( 二) 位置偏爱流程 条件性位置偏爱检测箱由三个树脂玻璃箱组成，中间灰色箱子 ( 1 l o x 2 5 0 x 3 2 0 c m ) 将两端等大的箱子( 3 0 5 x 2 5 0 x 3 2 0 c m ) 分开。两端的大箱子有 不同颜色的墙壁( 黑或白) 和不同的地板( 穿孔或金属筛网) 并通过滑门与中间 箱分开。条件性位置偏爱模型的建立按照文献进行2 2 1 。伴药侧停留时问减去非伴 药侧停留时间即为偏爱分数。 1 、诱导前测试 在初始两天，移除箱问的分隔滑门，使大鼠被放入箱内地板后自由穿梭1 5 分 钟以适应测试箱。在第三天，动物自由探索检测箱1 5 分钟，记录大鼠在每个箱内 的停留时间。 2 、条件性位置偏爱诱导 依据诱导前测试所得偏爱分数分析得出，黑箱为生理偏爱侧，白箱为非偏爱 侧。药物诱导时，动物白箱伴可卡因而黑箱伴盐水。将滑门置于箱内位置，按照 8 天盐水和可卡因( 4 0 m g k g ) 交替的偏倚流程进行药物诱掣2 3 1 。即在第4 、6 、8 、 1 0 天给予大鼠腹腔注射生理盐水并置于非伴药箱3 0 分钟，在第5 、7 、9 、1 1 天 给予大鼠腹腔注射可卡因并置于伴药箱3 0 分钟。对照组的动物在黑白两箱内均注 射生理盐水。 3 、诱导后c p p 测试 第1 2 天，将大鼠黄于中间灰色箱内地板上，移除滑门，使其在整个箱内自由 穿梭1 5 分钟。记录1 5 分钟内大鼠在每个箱内停留的时间，伴药侧停留时间减去 非伴药侧停留时间即为偏爱分数。 4 、c p p 戒断 通过对之前伴药侧和非伴药侧的双侧交替伴生理盐水每天3 0 分钟进行动物 的消退诱导，持续两周( 从第1 3 天到第2 6 天) 。在第2 7 天，对大鼠进行c p p 测 试，以确认c p p 消退。 5 、引燃诱导c p p 的强化 在第2 8 天，给予大鼠可卡因( 1 0 m g k g ) 或生理盐水，并进行c p p 测试。褪 黑素可卡因组的大鼠在给予可卡因前3 0 分钟给予褪黑素( 4 0 m g k g ) ，生理盐水组 和可卡因组的大鼠给予相应介质。 ( 三) w e s t e r nb l o t t i n g 在可卡因引燃后2 4 小时收集动物脑组织用w e s t e mb l o t t i n g 技术进行检测【2 4 1 。 主要步骤是，等量蛋白提取物在上样缓冲液( 5 b 一巯基乙醇，0 0 5 溴芬兰， 7 5 m m o l lt r i s 一盐酸，p h6 8 ，2 s d s ，和1 0 甘油) 内煮沸5 分钟，由s d s p a g e 电泳分离，用半干转印仪( b i o r a d ) 转印到p v d f 膜( m i l l i p o r e ，m a ，u s a ) 。5 脱脂奶粉封闭，一抗孵育( 抗a f o s b ，a g s 3 ，t h 和1 3 - a c t i n ) ，4 c 过夜。h r p 标记 的二抗( s a n t ac r u zb i o t e c h ) 孵育，室温l 小时。利用l a s 3 0 0 0 m i n i ( f u j if i l m ，j a p a n ) 和e c l ( e c l ；a m e r s h a mp h a r m a c i a ，p i s c a t a w a y , n j ) 显示免疫反应带。 ( 四) 共聚焦激光扫描显微镜技术 按照文献进行共聚焦激光扫描显微镜检测【2 5 】。用戊巴比妥钠( 4 0 m g k g ) 深麻 动物，以含5 0 0 0 u 肝素1 0 0 m l 的o 0 1 m 的p b s 经左心室灌流，冲净血液后以4 多 聚甲醛( p h 7 4 ) 灌流。小心摘取脑组织并置于4 多聚甲醛4 c 孵育过夜。震荡 切片机切取1 0 0 微米冠状脑片并收集于p b s 内。以漂浮法进行免疫荧光染色。主 1 2 要步骤如下：切片在含0 3 t r i t o nx 1 0 0 和5 驴血清的p b s 内室温孵育l 小时。 4 湿盒内切片以含0 1 t r i t o nx 1 0 0 和l 驴血清的兔抗a f o s b 一抗( c e l l s i g n a l i n gt e c h n o l o g y , 1 ：2 5 0 ) 、鸡抗m a p 2 ( a b e a m ，1 ：8 0 0 0 ) 孵育过夜。第二天切 片二抗室温孵育2 小时( c y 3 驴抗兔抗体、c y 2 驴抗鸡抗体( j a c k s o n ) 1 ：5 0 0 稀释 于含o 1 t r i t o n x 1 0 0 和1 驴血清的p b s ) 。洗净后切片以3 0 0 n m 的d a p i 室温 孵育1 0 分钟。切片托于载片上并用盖片封闭，使用共聚焦激光扫描显微镜拍摄图 片( n i k o nd e c l i p s ec 1 ，t o k y o ，j a p a n ) 。 ( 五) 统计分析 所有结果以均数- l - 标准误表示。使用a n o v a ( o n e - w a ya n a l y s i so f v a r i a n c e ) 和 t u k e y sm u l t i p l ec o m p a r i s o nt e s t 对c p p 分数或w e s t e r nb l o t t i n g 灰度进行组间比 较。两个组间的比较用非配对t 检验，p 值小于0 0 5 被认为有统计学意义。g r a p h p a d p r i s m 统计软件( g r a p h p a dp r i s ms o f t w a r e ，i n c ) 用于所有数据分析。 实验结果 在诱导前测得非药物处理大鼠在白箱停留平均时间是1 9 7 1 4 - 6 5 9 秒，在黑箱 的平均停留时间是4 6 0 2 + 1 1 3 3 秒。因此，我们并将白箱作为伴药侧，黑箱作为非 伴药侧。 一、可卡因依赖和戒断 如图1 所示，可卡因最后一次诱导后，可卡因组和褪黑素可卡因组的大鼠相 比伴盐水侧表现出对伴药侧明显的偏爱，偏爱由暗箱的生理偏爱转变为对白箱的 可卡因诱导偏爱c f t 2 2 4 = 5 1 5 4 ，p 0 0 5 ) 。与各自诱导前相应偏爱分数比较，假手术 组转变为偏爱伴药箱( t o 0 5 1 0 = 3 2 4 4 ，p 0 0 5 ) ，而松果体摘除组表现出可卡因诱导 c p p 的延迟。反复可卡因诱导后，松果体摘除组的偏爱分数比假手术组的低( f o 0 5 1 0 = 2 2 8 1 ，p 0 0 5 ) 。 二、褪黑素或松果体摘除对可卡因引燃诱导的c p p 强化的作用 可卡因依赖和戒断的动物模型按照实验方法建立，在建立模型的基础上进行 1 3 有关褪黑素预处理对可卡因引燃诱导c p p 强化的效应研究。如图l a 所示，褪黑 素预处理可抑制可卡因引燃诱导的c p p 强化眠2 ，2 4 = 1 9 5 9 6 ，p 0 0 5 ) 与假手术组相 比，松果体摘除组可卡因引燃诱导的c p p 分数被略微下调( 图1 b ) 。 1 0 0 0 5 0 0 轴 搽0 求 瞄 g 一5 0 0 4 0 0 浍2 0 0 粲0 容 g - 2 0 0 4 0 0 _ 6 0 0 8 0 0 四生理盐水组 囝可卡困组 嗣祖 水 珠木 隧 。t = j 嘲掣鞫| | | 锄 锄 墨盈假手术组 翻手术组 锄锡 黑紊可卡困组 图1 ，褪黑素或松果体摘除对可卡因引燃诱导的c p p 的作用。a 褪黑素对戒 断后可卡因引燃诱导c p p 强化的抑制作用。b 松果体摘除对戒断后可卡因引燃诱 导的c p p 的作用。偏爱分数( 秒) 即伴药侧停留时间减去非伴药侧停留时间。 愀0 0 5 倦生理盐水组，撑p o 0 5w 可卡因组；m p o 0 5 诱导前测试；a p o 0 5 惯假手术组。 三、褪黑素或松果体摘除对可卡因引燃诱导的a f o s b 累积的效应 1 4 与对照组相比，可卡因引燃诱导f 0 s b 在奖赏相关脑区的累积，如额前皮层， 伏核，尾状壳核，海马和杏仁核。该累积在除伏核外的大多数脑区被褪黑素预处 理所拮抗( 尸 o 0 5 ) 。与假手术组比较，松果体摘除组表现f l ja f o s b 在h i p 的低表 达衅0 0 5 ) ，在其它脑区未观察到显著差异。图2 和图3 显示来自w e s t e r nb l o t t i n g 和 共聚焦激光扫描显微镜实验的代表性的结果。 a p f cn a c c p u h i pa m y 赞赫赫麟沓簟，静2 黼d e h a f o s b b - 一- - 一_ 。 _ - - _ 一l - a c t i n 善 8 口 鼍 喜 雩 皇 著 4 0 0 3 0 0 2 0 0 1 0 0 o 团生理盐水组 协乜锡 锄 嘞 h 田 _ 潞d e l 切f o 出 - _ ，p - a m a 吣祷敏 困组 ， 图2 ，w e s t e r nb l o t t i n g 检测褪黑素以及松果体摘除对可卡因引燃诱导的 d e l t a f o s b ( a f o s b ) 累积的抑制作用。 i - a c t i n 蛋白表达作为上样对照，以生理盐水 组z k f o s b p a c t i no d 值作为1 0 0 ，柱条代表均数4 - 标准误( 砬3 ) 。尸 o 0 5 粥生理 盐水组；籽 0 0 5w 可卡因组；a p 0 0 5w 假手术组。 1 5 直禹 函豳罩系 叽州“甜 8 6 4 2 口qo口霉o|粤冒。啊暑_弓 1 6 图3 ，共聚焦激光扫描显微镜技术检测褪黑素对可卡因引燃诱导的a f o s b 累 积的抑制作用。a 和b 、c 和d 、e 和f 分别为海马、尾状壳核和伏核。其中b 、d 、 f 分别为a 、c 、e 的重叠组合图片。抗a f o s b ( 红色) 抗体、抗m a p 2 ( 绿色) 抗体 和d a p i ( 蓝色) 三重免疫荧光染色，a f o s b 表达在细胞核中，m a p 2 表达在神经 元的突起中，d a p i 染核。结果显示，可卡因引燃诱导a f o s b 累积，而褪黑素预 处理可抑制其在尾状壳核和海马的累积，但不抑制在伏核的累积。1 、2 、3 分别 为生理盐水组、可卡因组和褪黑素可卡因组。比例尺= 7 5 微米。a c a ( 前联合前部) ； l v ( 倾y 脑室) ( 每组砭3 只大鼠) 。 四、褪黑素或松果体摘除对可卡因引燃诱导的a g s 3 表达的作用 如图4 所示，在w e s t e r nb l o t t i n g 实验，可卡因引燃使得a g s 3 的表达在额前 皮层和尾状壳核增加，而在腹侧被盖区降低。可卡因的上调作用和下调作用均被 引燃前的褪黑素预处理拮抗( 尸 0 0 5 ) 。在手术组和假手术组间未观察到显著差异。 1 7 kp f cc p uv t a 一一一e ：。= 。：一l a g s 3 _ - _ _ 一 一一_ - 一p - a c t i n 图4 ，w e s t e r nb l o t t i n g 检测褪黑素对可卡因引燃诱导的a g s 3 表达的作用。 i b - a c t i n 蛋白表达作为上样对照，生理盐水组a f o s b p a c t i no d 值作为1 0 0 。柱 条代表均数4 - 标准误( 庀3 ) 。p o 0 5 谘生理盐水组；杼 o 0 5 倦可卡因组。 五、褪黑素或松果体摘除对可卡因引燃诱导的t h 表达的作用 可卡因引燃显著下调t h 在额前皮层和腹侧被盖区的表达，而上调t h 在伏核、 尾状壳核和杏仁核的表达。在伏核除外的相关脑区可卡因的上调作用被褪黑素预 处理所拮抗( p ，o 0 5 ，图5 a 和b ) 。与假手术组相比，松果体摘除下调杏仁核t h 的表达俨 0 0 5 ，图5 c ) ，在其它检测脑区未观察到显著差异。 1 8 m o 4 3 2 1 啦厶)口。皇曩u甲譬n0 a p f c n a c c p u a m yv 丁a 。一- - _ 竹_ 熊-_ t h - - _ ，- - - - _ f l - a c t i n 零 一 e c 石 | 5 警 拿 = 百i 1 哥t r邑1