反转录试剂盒说明书.pdf

行业文档行业文档 takara code：takara code：drr014adrr014a primescript rt-pcr kit (50 次量次量) 目目 录录 内内 容容 页页 码码 制品说明 制品说明 1 1 制品内容 制品内容 1 1 保 存 保 存 2 2 原 理 原 理 2 2 试剂盒特点 试剂盒特点 3 3 rna 样品制备 rna 样品制备 3 3 使用注意 使用注意 4 4 反转录引物的选择 反转录引物的选择 5 5 实验操作 实验操作 5 5 实验例 实验例 7 7 q&a 8 8 制品说明制品说明 pcr（polymerase chain reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增 dna 的简单而有效的方法。虽 然原理上 pcr 法是扩增 dna，rna 不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把 rna 反转录成 cdna 后，pcr 法便可应用于 rna 的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于 rna 的构造解析、cdna 的克隆 及 rna 水平上的表达解析等多种领域。 pcr（polymerase chain reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增 dna 的简单而有效的方法。虽 然原理上 pcr 法是扩增 dna，rna 不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把 rna 反转录成 cdna 后，pcr 法便可应用于 rna 的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于 rna 的构造解析、cdna 的克隆 及 rna 水平上的表达解析等多种领域。 primescript rt-pcr kit是具有良好的延伸性能与高扩增效率的 2 step rt-pcr试剂盒。反转录反应 使用了takara独自开发的新型反转录酶primescript rtase；pcr反应使用了扩增性能良好的hot start 型dna聚合酶 primescript rt-pcr kit是具有良好的延伸性能与高扩增效率的 2 step rt-pcr试剂盒。反转录反应 使用了takara独自开发的新型反转录酶primescript rtase；pcr反应使用了扩增性能良好的hot start 型dna聚合酶takara ex taqtakara ex taqtm tm hs。 hs。 本试剂盒具有以下优点： 本试剂盒具有以下优点： 1.1. 进行高效的 rt-pcr 扩增。进行高效的 rt-pcr 扩增。 2.2. 在标准的 rna 反转录反应温度（42）下，便可使具有复杂结构的 rna 进行良好的延伸，可以避免 rna 在高温条件下的降解。 在标准的 rna 反转录反应温度（42）下，便可使具有复杂结构的 rna 进行良好的延伸，可以避免 rna 在高温条件下的降解。 3.3. 能有效抑制非特异性的 pcr 扩增。能有效抑制非特异性的 pcr 扩增。 4 4 . . 使用本试剂盒扩增得到的目的产物 3端附有一个 a 碱基，可以直接克隆于 t-vector 中。使用本试剂盒扩增得到的目的产物 3端附有一个 a 碱基，可以直接克隆于 t-vector 中。 本试剂盒含有反转录反应及 pcr 扩增反应所需的全部试剂。 本试剂盒含有反转录反应及 pcr 扩增反应所需的全部试剂。 制品内容（50 次量*制品内容（50 次量*1 1） ） 1.1. primescript rtase（for 2 step） 2. primescript rtase（for 2 step） 2. 5primescript buffer 3. 5primescript buffer 3. rnase inhibitor（40 u/l） 4. rnase inhibitor（40 u/l） 4. dntp mixture（10 mm each） 5. dntp mixture（10 mm each） 5. oligo dt primer（2.5 m） 6. oligo dt primer（2.5 m） 6. random 6 mers（20 m） 7. random 6 mers（20 m） 7. takara ex taqtakara ex taqtm tm hs（5 u/l） 8. hs（5 u/l） 8. 10pcr buffer 9. 10pcr buffer 9. control f-1 primer*control f-1 primer*2 2（20 m） 10. （20 m） 10. control r-1 primer*control r-1 primer*3 3（20 m） 11. （20 m） 11. positive control rna （210positive control rna （2105 5 copies/l） 12. rnase free dh copies/l） 12. rnase free dh2 2o o 25 l 200 l 25 l 150 l 50 l 50 l 25 l 250 l 10 l 10 l 20 l 1 ml 25 l 200 l 25 l 150 l 50 l 50 l 25 l 250 l 10 l 10 l 20 l 1 ml *1 反转录反应 20 l 、pcr 反应 50 *1 反转录反应 20 l 、pcr 反应 50 l l 体系时可使用 50 次。 体系时可使用 50 次。 *2 positive control rna 用上游引物。 *2 positive control rna 用上游引物。 *3 positive control rna 用下游引物。 *3 positive control rna 用下游引物。 【各种引物序列】 【各种引物序列】 引物名称 引物名称 各引物序列 各引物序列 random 6 mers random 6 mers 5-（p）nnnnnn-3 5-（p）nnnnnn-3 oligo dt primer oligo dt primer takara独自设计的dt区域*takara独自设计的dt区域*4 4 control f-1 primer control f-1 primer 5-ctgctcgcttcgctacttgga-3 5-ctgctcgcttcgctacttgga-3 control r-1 primer control r-1 primer 5-cggcacctgtcctacgagttg-3 5-cggcacctgtcctacgagttg-3 *4 该序列和 takara rna pcr kit（amv） ver.3.0（takara code: drr019a） *4 该序列和 takara rna pcr kit（amv） ver.3.0（takara code: drr019a） 的 oligo dt adaptor primer 不同，不含有 m13 primer m4 所对应的序列。的 oligo dt adaptor primer 不同，不含有 m13 primer m4 所对应的序列。 -1- -1- 【positive control rna】 【positive control rna】 本试剂盒中的control rna是以psptet3 质粒（质粒中的sp6 启动子下游插入长约 1.4 kbp的pbr322 来 源的dna片段， 其dna片段上含有抗四环素基因） 为模板由sp6 rna聚合酶经体外转录而得到的。 control rna（约 1.4 kbp）是带有 30 个a碱基的具有poly (a) 本试剂盒中的control rna是以psptet3 质粒（质粒中的sp6 启动子下游插入长约 1.4 kbp的pbr322 来 源的dna片段， 其dna片段上含有抗四环素基因） 为模板由sp6 rna聚合酶经体外转录而得到的。 control rna（约 1.4 kbp）是带有 30 个a碱基的具有poly (a)+ + 尾的rna。当把control rna经rt-pcr合成的双 链cdna插入质粒时，该质粒便可获得四环素抗性。control rna简图见图 1。 尾的rna。当把control rna经rt-pcr合成的双 链cdna插入质粒时，该质粒便可获得四环素抗性。control rna简图见图 1。 tetracycline resistance gene 462 bp f-1 primer r-1 primer f-1 primer r-1 primer hind iii bamh i sal i ecor v sph i aaaa sp6 promoter 图 1. positive control rna：使用 control primer 可以扩增 462 bp 的 dna 片段图 1. positive control rna：使用 control primer 可以扩增 462 bp 的 dna 片段 保 存： -20 保 存： -20 原 理 原 理 primescript rt-pcr kit首先用primescript rtase将rna合成cdna，再取反应液的一部分作为模 板，由 primescript rt-pcr kit首先用primescript rtase将rna合成cdna，再取反应液的一部分作为模 板，由takara ex taq takara ex taq tm tmhs进行pcr扩增。将rna反转录成cdna的引物可以使用random 6 mers、 oligo dt primer或特异性下游引物。 hs进行pcr扩增。将rna反转录成cdna的引物可以使用random 6 mers、 oligo dt primer或特异性下游引物。 图 2. primescript rt-pcr kit 原理图图 2. primescript rt-pcr kit 原理图 -2-2- 反转录反应： 反转录反应： 将反转录用的引物、dntp mixture、模板 rna 混合 将反转录用的引物、dntp mixture、模板 rna 混合 65、5 min 后 4 65、5 min 后 4 添加 5primescript buffer 和 primescript rtase 添加 5primescript buffer 和 primescript rtase 30、10 min* 30、10 min* 42（50）、1530 min 42（50）、1530 min 95、5 min 后 4 95、5 min 后 4 * 使用 random 6 mers 进行反转录时，首先在 30下保温 10 min，使 random 6 mers 延伸达到足够长度， 以便在 4250退火时与模板 rna 充分结合。 * 使用 random 6 mers 进行反转录时，首先在 30下保温 10 min，使 random 6 mers 延伸达到足够长度， 以便在 4250退火时与模板 rna 充分结合。 pcr 反应： pcr 反应： 将反转录反应液的一部分作为模板，进行 pcr 反应。 将反转录反应液的一部分作为模板，进行 pcr 反应。 94 30 sec 94 30 sec 5565 5565 30 sec30 sec 30 cycles 30 cycles 72 1 min/kbp 72 1 min/kbp 图 3. primescript rt-pcr kit 的操作流程 图 3. primescript rt-pcr kit 的操作流程 试剂盒特点试剂盒特点 rna 模板 rna 模板 适用于所有 rna 适用于所有 rna 扩增片段大小 扩增片段大小 12 kbp 以下 12 kbp 以下 反转录酶 反转录酶 primescript rtase（反转录反应最适温度 42） primescript rtase（反转录反应最适温度 42） takara ex taqtakara ex taq dna polymerase dna polymerase tm tm hs hs rnase inhibitor rnase inhibitor 必须使用（kit 中含有） 必须使用（kit 中含有） random 6 mers random 6 mers 合成第一条cdna链 的引物 合成第一条cdna链 的引物 oligo dt primer 可供选择 oligo dt primer 可供选择 特异性下游引物 特异性下游引物 rna 样品制备 rna 样品制备 本试剂盒是把 rna 合成 cdna，然后再对此 cdna 进行扩增的试剂盒。rna 的纯度会影响 cdna 的合成 量，而制备 rna 的关键是要抑制细胞中的 rna 分解酶和防止所用器具及试剂中的 rna 分解酶的污染。 因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用 rna 操作专用实验台；在操作过程中避免讲 话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的 rna 分解酶的污染。 本试剂盒是把 rna 合成 cdna，然后再对此 cdna 进行扩增的试剂盒。rna 的纯度会影响 cdna 的合成 量，而制备 rna 的关键是要抑制细胞中的 rna 分解酶和防止所用器具及试剂中的 rna 分解酶的污染。 因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用 rna 操作专用实验台；在操作过程中避免讲 话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的 rna 分解酶的污染。 -3- -3- 【使用器具】 【使用器具】 尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。 尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。 （1）用 0.1% depc（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37下处理 12 小时。 （1）用 0.1% depc（焦碳酸二乙酯）水溶液在 37下处理 12 小时。 （2）然后在 120下高压灭菌 30 分钟以除去残留的 depc。 （2）然后在 120下高压灭菌 30 分钟以除去残留的 depc。 rna 实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。 rna 实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。 【试剂配制】 【试剂配制】 用于 rna 实验的试剂，需使用干热灭菌（180，60 min）或用上述方法进行 depc 水处理灭菌后的 玻璃容器盛装（也可使用 rna 实验用的一次性塑料容器） ，使用的无菌水需用 0.1%的 depc 处理后进 行高温高压灭菌。 用于 rna 实验的试剂，需使用干热灭菌（180，60 min）或用上述方法进行 depc 水处理灭菌后的 玻璃容器盛装（也可使用 rna 实验用的一次性塑料容器） ，使用的无菌水需用 0.1%的 depc 处理后进 行高温高压灭菌。 rna 实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。 rna 实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。 【制备方法】 【制备方法】 使用简单的 rna 纯化方法即可获得满足于 rt-pcr 反应的 rna（只需少量的 rna 便可进行 rt-pcr 反应） 。但为了保证实验的成功率，建议使用 gtc 法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度 rna。 使用简单的 rna 纯化方法即可获得满足于 rt-pcr 反应的 rna（只需少量的 rna 便可进行 rt-pcr 反应） 。但为了保证实验的成功率，建议使用 gtc 法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度 rna。 从培养细胞、组织中提取时，使用rnaiso reagent（takara code: d312） 。从血液中提取rna用 catrimox-14 从培养细胞、组织中提取时，使用rnaiso reagent（takara code: d312） 。从血液中提取rna用 catrimox-14tm tm rna isolation kit ver.2.11（takara code: dwa005）在短时间内能调制高纯度的 rna。 rna isolation kit ver.2.11（takara code: dwa005）在短时间内能调制高纯度的 rna。 从 total rna 中分离 mrna 时，使用从 total rna 中分离 mrna 时，使用oligotex-dt30superoligotex-dt30supermrna purification kit（takara code: d9086）能迅速高效回收 mrna。 mrna purification kit（takara code: d9086）能迅速高效回收 mrna。 使用注意 使用注意 以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前请一定认真阅读。 以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前请一定认真阅读。 1）1） 当同时需要进行数次 rt-pcr 反应时，应先配制各种试剂的混合液（master mix；其中包括 rnase free dh 当同时需要进行数次 rt-pcr 反应时，应先配制各种试剂的混合液（master mix；其中包括 rnase free dh2 2o、buffer、dntp mixture 等） ，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积 更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。 o、buffer、dntp mixture 等） ，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积 更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。 2）2） 用primescript用primescripttm tm rtase、rnase inhibitor、 rtase、rnase inhibitor、takara ex taqtakara ex taqtm tm hs酶等酶类时，应轻轻混匀，避免 起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有 50%的甘油，粘度高，分取时 应慢慢吸取。 hs酶等酶类时，应轻轻混匀，避免 起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部；由于酶保存液中含有 50%的甘油，粘度高，分取时 应慢慢吸取。 3）3） 酶制品应在实验前才从-20中取出，使用后也应立即放入-20保存。 酶制品应在实验前才从-20中取出，使用后也应立即放入-20保存。 4）4） 为了防止 positive control rna 分解，应尽量避免反复冻融。有条件的实验室最好保存于-70-80。 为了防止 positive control rna 分解，应尽量避免反复冻融。有条件的实验室最好保存于-70-80。 5） 5） 分装试剂时务必使用新的枪头（tip） ，以防止样品间污染。 分装试剂时务必使用新的枪头（tip） ，以防止样品间污染。 6） 6） 最佳的 pcr 反应条件，因 pcr 扩增仪的不同而不同，所以在使用您的样品之前最好先试做一下 control 反应，以确定最佳的 pcr 反应条件。 最佳的 pcr 反应条件，因 pcr 扩增仪的不同而不同，所以在使用您的样品之前最好先试做一下 control 反应，以确定最佳的 pcr 反应条件。 -4-4- 反转录引物的选择反转录引物的选择 反转录引物的选择，应结合实验的具体情况，选择以下三种引物，即：random 6 mers、oligo dt primer 或特异性下游引物。对没有发夹结构的短链 mrna，上述三种引物都可以使用；一般情况下的反转录引物 的选择请参照以下说明。 反转录引物的选择，应结合实验的具体情况，选择以下三种引物，即：random 6 mers、oligo dt primer 或特异性下游引物。对没有发夹结构的短链 mrna，上述三种引物都可以使用；一般情况下的反转录引物 的选择请参照以下说明。 适用于长的或具有 hairpin 构造的 rna。 包括 rrna、 mrna、 trna 等在内的所有 rna 的反转录反应都可使用本引物。 适用于长的或具有 hairpin 构造的 rna。 包括 rrna、 mrna、 trna 等在内的所有 rna 的反转录反应都可使用本引物。 random 6 mers random 6 mers 适用于具有poly (a)适用于具有poly (a)+ + tail的rna。 （注意：原核生物的rna、真核生 物的rrna、trna以及某些种类的真核生物的mrna等不具有poly (a) tail的rna。 （注意：原核生物的rna、真核生 物的rrna、trna以及某些种类的真核生物的mrna等不具有poly (a) oligo dt primer oligo dt primer + + tail） 。 tail） 。 特异性下游引物 特异性下游引物 必须与模板序列互补，需了解 target 序列。 必须与模板序列互补，需了解 target 序列。 （pcr 时的下游引物） （pcr 时的下游引物） 实验操作 实验操作 1. 反转录反应。1. 反转录反应。 在 microtube 管中配制下列混合液。 在 microtube 管中配制下列混合液。 dntp mixture（10 mm each） dntp mixture（10 mm each） 1 1 l l oligo dt primer（2.5 m） oligo dt primer（2.5 m） or random 6 mers（20 m） or random 6 mers（20 m） 1 1 l l or specific primer（2 m）*or specific primer（2 m）*1 1 template rna*template rna*2 2 （or positive control rna （or positive control rna 4104105 5 copies） copies） rnase free dhrnase free dh2 2o o *1 合成 cdna 的引物可结合实际情况从 oligo dt primer、random 6 mers、specific primer 中 任选一种，请参照“反转录引物的选择” 。 *1 合成 cdna 的引物可结合实际情况从 oligo dt primer、random 6 mers、specific primer 中 任选一种，请参照“反转录引物的选择” 。 *2 template rna 最多可加至 8 l，当使用 total rna 时，最多可加至 5 g(推荐使用量：100 pg 1 g)。 *2 template rna 最多可加至 8 l，当使用 total rna 时，最多可加至 5 g(推荐使用量：100 pg 1 g)。 在 pcr 仪上进行变性、退火反应。 在 pcr 仪上进行变性、退火反应。 65 5 min 65 5 min 4 4 (说明：变性、退火操作有利于模板 rna 的变性以及反转录引物和模板的特异性退火，可提高反转 录反应效率。 ） (说明：变性、退火操作有利于模板 rna 的变性以及反转录引物和模板的特异性退火，可提高反转 录反应效率。 ） 离心数秒钟使模板 rna/引物等的混合液聚集于 microtube 管底部。 离心数秒钟使模板 rna/引物等的混合液聚集于 microtube 管底部。 在上述 microtube 管中配制下列反转录反应液。 在上述 microtube 管中配制下列反转录反应液。 上述变性、退火后反应液 上述变性、退火后反应液 5primescript buffer 5primescript buffer rnase inhibitor（40 u/l） rnase inhibitor（40 u/l） primescript rtase（for 2 step） primescript rtase（for 2 step） rnase free dhrnase free dh2 2o o total volume total volume -5-5- up to 10 lup to 10 l 10 10 l l 4 4 l l 0.5 0.5 l l 0.5 0.5 l l 5 5 l l 20 20 l l 在 pcr 仪上按下列条件进行反转录反应。 在 pcr 仪上按下列条件进行反转录反应。 （30 10 min）（30 10 min）*3 *3 42（50） 42（50） 1530 min1530 min 95 95 5 min 5 min *4 *4 4 4 *3 反转录反应引物为 random 6 mers 时进行，此操作可使 random 6 mers 在 42(50)和模板 rna 充分退火、延伸，增加反转录效率。 *3 反转录反应引物为 random 6 mers 时进行，此操作可使 random 6 mers 在 42(50)和模板 rna 充分退火、延伸，增加反转录效率。 *4 进行长片段 dna 扩增时，为了避免破损 1st cdna 链 ，请进行 70、15 min 的失活反应。 *4 进行长片段 dna 扩增时，为了避免破损 1st cdna 链 ，请进行 70、15 min 的失活反应。 （说明：primescript（说明：primescript rtase 对具有复杂二级结构的模板同样具有良好的延伸性能，通常可在 42下 进行反应。使用特异性下游引物进行反转录时，有时会因错配而产生非特异性扩增。此时可将 温度升到 50，可能会减少非特异性扩增。 ） rtase 对具有复杂二级结构的模板同样具有良好的延伸性能，通常可在 42下 进行反应。使用特异性下游引物进行反转录时，有时会因错配而产生非特异性扩增。此时可将 温度升到 50，可能会减少非特异性扩增。 ） 2. pcr 反应。 2. pcr 反应。 按下列组成配制 pcr 反应液。 按下列组成配制 pcr 反应液。 5 5 l l10pcr buffer 10pcr buffer 2 2 l ldntp mixture（10 mm each） dntp mixture（10 mm each） 0.5 l0.5 lprimer-fprimer-f*5 *5 0.5 l0.5 lprimer-rprimer-r*6 *6 0.5 l0.5 ltakara ex taqtakara ex taqtm tm hs（5 u/l） hs（5 u/l） 5 l5 l上述的反转录反应液 上述的反转录反应液 up to 50 lup to 50 l rnase free dh rnase free dh2 2o o *5 positive control rna 使用 f-1 primer。 *5 positive control rna 使用 f-1 primer。 *6 positive control rna 使用 r-1 primer。 *6 positive control rna 使用 r-1 primer。 反应条件。 反应条件。 普通反应条件。 普通反应条件。 （a）3 step pcr 的反应条件： （b）2 step pcr 的反应条件： （a）3 step pcr 的反应条件： （b）2 step pcr 的反应条件： positive control rnapositive control rna*7 *7的反应条件。 的反应条件。 *7 反转录引物使用 oligo dt primer、random 6 mers、r-1 primer 中的任何一种引物，在进行 pcr 扩增时使用 control primer f-1 和 r-1 引物，都可以得到 462 bp 的 pcr 扩增产物。 *7 反转录引物使用 oligo dt primer、random 6 mers、r-1 primer 中的任何一种引物，在进行 pcr 扩增时使用 control primer f-1 和 r-1 引物，都可以得到 462 bp 的 pcr 扩增产物。 -6-6- 94 94 30 sec 30 sec 989810 sec 10 sec 5565 5565 30 sec 30 cycles30 sec 30 cycles 72 72 1 min/kbp 1 min/kbp 68681 min/kbp1 min/kbp 30 cycles30 cycles 94 94 30 sec 30 sec 60 60 30 sec 30 cycles30 sec 30 cycles 72 72 1 min 1 min 【有关 pcr 反应条件的说明】 【有关 pcr 反应条件的说明】 退火温度 退火温度 control rna 的退火温度设定为 60，检测样品的最适退火温度可以在 5565间进行研讨。有时 也可将退火温度范围扩大到 4565进行研讨。 control rna 的退火温度设定为 60，检测样品的最适退火温度可以在 5565间进行研讨。有时 也可将退火温度范围扩大到 4565进行研讨。 延伸时间 延伸时间 延伸时间根据目的片段的长度而改变，延伸时间根据目的片段的长度而改变，takara ex taqtakara ex taq tmtm hs 在 72时的设定标准是 1 kbp/min。 hs 在 72时的设定标准是 1 kbp/min。 循环圈数 循环圈数 cdna 少时，可进行 4050 cycles。 cdna 少时，可进行 4050 cycles。 实验例 实验例 1扩增不同长度 dna 片段的 rt-pcr 实验。1扩增不同长度 dna 片段的 rt-pcr 实验。 template：human heart total rna 和 hl60 total rna。 template：human heart total rna 和 hl60 total rna。 target： target： 以 human heart total rna 为模板，扩增 dystrophin 基因的 112以 human heart total rna 为模板，扩增 dystrophin 基因的 112 kbp 的 dna 片段；以 hl60 total rna 为模板，扩增 tfr 基因的 0.54.4 kbp 的 dna 片段；以 hl60 total rna 为模板，扩增 tfr 基因的 0.54.4 kbp 的 dna 片段。 kbp 的 dna 片段。 分别在 20 l 的反转录体系中，加入各 total rna 1 g，进行反转录反应。再以 2 l 的反转录反 应液作为模板，进行 50 l 的 pcr 扩增反应。 分别在 20 l 的反转录体系中，加入各 total rna 1 g，进行反转录反应。再以 2 l 的反转录反 应液作为模板，进行 50 l 的 pcr 扩增反应。 pcr 反应条件： pcr 反应条件： 0.56 kbp 812 kbp 0.56 kbp 812 kbp 1 min 1 min 94 94 1 min 1 min 94 94 电泳结果如下。结果显示，0.512 kbp dna 片段都得到了良好的 rt-pcr 扩增 电泳结果如下。结果显示，0.512 kbp dna 片段都得到了良好的 rt-pcr 扩增。 m1 1m1 1 2 2 3 4 m2 m13 4 m2 m1 5 5 6 6 7 87 8 9 10 m2 9 10 m2 -7-7- 98 98 10 sec 10 sec 68 68 8 min or 15 min 8 min or 15 min 94 94 30 sec 30 sec 55 55 30 sec 30 cycles30 sec 30 cycles 72 72 1 min/kbp 1 min/kbp 30 cycles30 cycles 0.5 2.2 3 k 4.4 1 k 2 k 4 k 6 k 8 k 12 m1：phy marker 1：tfr 2：tfr 3：tfr 4：tfr 5：dystrophin 6：dystrophin 7：dystrophin 8：dystrophin 9：dystrophin 10：dystrophin