（轻工技术与工程专业论文）有机人工老窖应用技术的研究.pdf

x l i l l lli l l u l llll y 171 at h e s i ss u b m i t t e df o r t h e a p p l i c a t i o no f t h em a s t e r sd e g r e eo f e n g i n e e r i n g t h er e s e a r c ho f o r g a n i ca r t i i l i c i a la g e dp i t s i n a p p l i c a t i o n c a n d i d a t e ： m a y e z h u n s p e c i a l t y ： l i g h ti n d u s t r yt e c h n o l o g ya n d e n g i n e e r i n g s u p e r v i s o r ： p r o f e s s o rl i j i n g l o n g s h a n d o n gi n s t i t u t eo fl i g h ti n d u s t r y , j i n a n ，c h i n a j u n e ，2 0 1 0 a 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名： 刍建! 盘日期：厶2 2 年名月l 日 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 虽皇直 导师签名： 日期：2 生垒年l 月上日 日期：厶2 三年上月上日 一 山东轻下业学院t 程顾l j 学位论文 目录 摘要。i a b s t r a c t i 第1 章绪论1 1 1 微生态学研究的内容i 1 2 微生态学在国内外的研究现状和发展趋势l 1 2 1 污染环境微生态学l 1 2 2 水处理微生态学1 1 2 3 异常环境下微生态学l 1 3 浓香型白酒窖池微生态的研究现状2 1 3 1 国内外关于曲药微生物区系的研究概况2 1 3 2 窖泥微生物生态的研究概况2 1 4 我国浓香型白酒窖池中微生物生态研究的意义和发展趋势2 1 4 1 菌种资源数据库的建立及完善2 1 4 2 发酵过程中微生物代谢途径的认识2 1 5 浓香型有机人工老窖3 1 5 1 北方人工老窖的发展3 1 6 本论文的选题背景、选题依据和研究意义3 1 7 本论文的主要研究内容4 第2 章己酸菌筛选5 2 1 概述5 2 2 材料与设备5 2 2 1 实验材料5 2 2 2 仪器设备6 2 3 实验方法6 2 3 1 己酸的定性分析硫酸铜显色法6 2 3 2 富集培养6 日录 2 3 3 单菌落分离6 2 3 4 初筛7 2 3 5 复筛7 2 3 6 发酵条件试验7 2 4 结果与讨论8 2 4 1 分离筛选结果8 2 4 2 发酵条件试验9 、 2 5 本章小结1 1 1 3 章己酸菌纯培养一1 5 3 1 引言一l5 3 2 材料与设备1 5 3 2 1 实验材料l5 3 2 2 仪器设备1 6 3 3 方法与步骤一1 6 3 3 1p h 值与己酸菌生长情况的关系1 6 3 3 2 乙醇对己酸菌生长的影响1 6 3 3 3 热处理条件与己酸菌生长情况的关系1 6 3 3 4 培养温度与己酸菌生长情况的关系1 6 3 3 5 培养时间对己酸菌生长的影响情况1 6 3 3 6 培养条件正交试验17 3 4 结果与讨论l7 3 4 1 有机酸选择17 3 4 2 乙醇浓度对己酸菌生长情况的影响l8 3 4 3 热处理条件对己酸菌生长情况的影响l8 3 4 4 培养温度对己酸菌生长情况的影响1 9 3 4 5 培养时间对己酸菌生长情况的影响1 9 3 4 6 己酸菌最佳纯培养条件的研究1 9 3 5 本章小结2 0 第4 章窖泥中己酸菌产酸能力的研究2 3 4 1 材料与设备2 3 4 1 1 材料2 3 2 一 山东轻t 业学院r 程硕l ：学位论文 4 1 2 仪器与设备2 3 4 2 方法与步骤2 3 4 2 1 碳源的种类及添加量对己酸菌产己酸能力的影响一2 4 4 2 2 氮源种类及不同添加量对己酸菌产己酸能力的影响一2 4 4 2 3 微量元素对己酸菌产己酸能力的影响一2 5 4 3 结果与讨论2 5 4 3 1 碳源的添加种类与不同添加量对己酸菌产己酸能力的影响2 5 4 3 2 不同氮源及添加量对己酸菌产己酸能力的影响2 6 4 3 3 添加微量元素对己酸菌产酸的影响。2 7 4 4 本章小结2 7 第5 章有机人工老窖培养技术研究3 l 5 1 引。言3 1 5 2 实验与步骤3 2 5 2 1 有机窖泥对土壤的要求3 2 5 2 2 有机窖泥相关菌种的培养3 3 5 2 3 有机人工老窖的培养3 5 5 2 4 人工老窖的养护和复壮一3 6 5 3 结果与讨论3 6 5 3 1 感官质量3 6 5 3 2 窖泥理化指标j 3 6 5 3 3 人工窖泥与百年老窖成分比较。3 7 5 3 4 不同窖泥中的微生物3 7 5 3 5 窖泥池产酒样理化分析3 8 5 4 本章小结3 9 第6 章结论与展望4 1 6 1 结论4 l 6 1 1 己酸菌筛选及产己酸研究4l 6 1 2 己酸菌纯培养条件研究4 l 6 1 3 有机人工老窖技术4 2 6 2 展望4 3 3 日录 j 射4 9 间主要科研成果5 l 发表学术论文。5 1 4 山东轻1 _ 业学院下程硕f j 学位论文 摘要 从百脉泉公司各车间老窖、新窖的窖壁、窖底以及污泥中取得的2 8 个泥样进 行分离，通过显微镜、油镜观察并经过定性测定，分离得到1 l 株己酸菌，经过初 筛、复筛测定产己酸含量，选出产己酸最高的菌株5 5 ，其己酸产量可达5 5 0 m g 10 0 m l 。 本课题对筛选出的菌株驯化后进行纯培养，最终确定的优化结果是：p h 6 ，酒 精浓度为2 ，8 0 热处理，3 0 培养，接种量4 ，培养时间为6 d 。通过对己酸菌 产己酸能力影响的研究，选择葡萄糖为碳源，添加量为1 5 ；选择l 广酪氨酸作为 氮源，确定添加量为0 1 。研究还表明，适当添加微量元素，能够促进己酸菌产 己酸。当此微量元素添加量为0 1 时，每1 0 0 r a l 发酵液中的己酸含量可以达到 7 7 8 m g 。 使用本课题筛选驯化的优良己酸菌菌株配制有机人工老窖泥，然后进行发酵 生产，通过对其所生产出的l 4 排酒的大渣池底酒样和二渣混合酒分别进行微量 成分分析，检测数据显示所生产的半成品酒中己酸乙酯的含量基本上呈现逐排增 加的趋势，其它微量成分的含量与比例也比较适宜，通过感官品评，其质量达到 国家二级。 关键词：有机人工老窖泥，己酸菌，驯化，纯培养，复配 摘要 n 山东轻丁业学院t 程硕i j 学位论文 a b s t r a c t t h es l u d g es a m p l e so b t a i n e d2 8w e l es e p a r a t e df r o mt h el o t u sp l a n to l dp i t ，t h e n e w p i ti nt h ep i tw a l l ，p i tb o t t o m ，a n ds l u d g eo f b a i m a i q u a nc o m p a n y 。d e t e r m i n a t i o n o flls t r a i n si s o l a t e df r o ma c i db a c t e r i at h r o u g ho b s e r v a t i o no ft h em i c r o s c o p ea n d q u a l i t a t i v ea n a l y s i s a f t e rs e c o n ds c r e e n i n g , h a sp r o d u c e da c i dc o n t e n td e t e r m i n a t i o nt o e l e c tt h eh i g h e s ta c i dp r o d u c i n gs t r a i n sh a v e b e e n5 5 t h eo u t p u to fa c i dh a dr e a c h e d 5 5 0m e 9 1 0 0 m l t h es u b j e c tt od o m e s t i c a t e ds t r a i n so fs e l e e t e da n dt h e nt op u r ec u l t u r e t h e f i n a l i z e do p t i m a lr e s u l ta r ea sf o l l o w s ：p h 6 ，a l c o h o lc o n c e n t r a t i o no f 2 ，8 0 h e a t t r e a t m e n t ，c u l t u r et e m p e r a t u r ei s3 0 ，i n o c u l u mi s4 ，c u l t u r et i m ei s6 d s e l e c t e d g l u c o s ea st h ec a r b o ns o u r c e ，s e l e c tl t y r o s i n ea san i t r o g e ns o u r c e ，a n da p p r o p r i a t et o a d dt r a c ee l e m e n t s t or e s e a r c ht h ec a p a c i t yo fa c i db a c t e r i a , s e l e c t i o no f g l u c o s ea st h e c a r b o ns o u r c e , a d dc o n t e n tw a s1 5 ；s e l e c tl t y r o s i n ea sa n i 仃o g e ns o u r c e ，d e t e r m i n e t h ed o s a g ew a s0 1 t h es t u d ya l s os h o w e dt h a t ，a d d i t i o no ft r a c ee l e m e n t sc a l l c o n t r i b u t et op r o d u c ea c i d w h e nt h et r a c ee l e m e n t sa d d e d0 1 ，t h ep e r10 0 m lo f f e r m e n t a t i o na c i dc o n t e n th a sb e e nu pt o7 7 8 m g u s et h ec a p r o i ca c i db a c t e r i aw h i c ht h i st o p i cf i l t e r e dt op r e p a r a to f o r g a n i ca c i d a r t i f i c i a lc e l l a rm u d ，a n db yt h ea n a l y s i so ft h ef e r m e n t e do ft h ep r o d u c t i o no fi t slt o4 w h i c ht h eb o t t o mr o wo fw i n eb i gs l a gm i x e dl i q u o rs a m p l e sa n dt w os e p a r a t e m i c r o w i n ec o m p o n e n t n l et e s td a t as h o w e dt h a tt h ep r o d u c t i o no fs e m i f i n i s h e dw i n e i sb a s i c a l l yt h ec o n t e n to fe t h y lc a p r o a t es h o w e da ni n c r e a s i n gt r e n db yr o w , t h e c o n t e n ta n dp r o p o r t i o no ft h et r a c ed e m e n t sw a ss u i t a b l e ，b ys e n s o r ye v a l u a t i o n ，t h e q u a l i t yr e a c h i n gg r a d ei i k e yw o r d s ：o r g a n i cm a n m a d ep i tm u d ，c a p r o i ca c i db a c t e r i a ，d o m e s t i c a t i o n ，p u r e c u l t u r e a b s t r a c t u ， 山东轻t 业学院侦 j 学位论文 1 1 微生态学研究的内容 第1 章绪论 生态学的形成和发展经历了一个漫长的过程，它是研究生命与环境这两个系 统作用和机理的学科。现代生态学在研究层次上形成了微观生态学和宏观生态学 两个分支l 。经过几十年的发展，微生态学作为一门边缘学科，在科学理论及实 践生产应用上取得了很多成就，在世界范围内带来了许多的观念性革命f 2 4 1 。近年 来，随着计算机技术的发展与应用，遗传学研究的开展与深入，以及细胞、分子、 群落水平等不同层次研究工作的开展，微生物生态学的研究得到了飞速的发展。 1 2 微生态学在国内外的研究现状和发展趋势 1 2 1 污染环境微生态学 微型生物在降解有毒物质方面的能力非常强。根据微生物必然性的假说推断， 只要能够找到匹配的微型生物和诱导物，并为其创造并提高适当的生存环境和培 养条件，从理论上讲，所有的有机化合物都可以被微型生物降解。污染环境微生 态学是微型生物生态研究的重点，被国际微型生物生态学委员会作为主要研究项 目。研究主要目的探索微生物间的转化规律，以期解决污染问题【5 1 。 1 2 2 水处理微生态学 通过对水处理构筑物进行研究，探索出其中所含有的微型生物群落的结构和 功能，将研究成果运用的实际生产生活中，有利于控制水处理过程，在保证处理 效果的基础上提高处理效率。目前水处理方法有很多，但一般主要采用好氧处理 与厌氧处理，着重研究微型生物生态，以及功能和它们之间的相互作用规律。 1 2 3 异常环境下微生态学 异常环境即极端环境，包括高渗环境、高盐环境，还包括其它特殊环境如沙 漠、火山口等。极端环境微生态学主要研究微型生物在极端环境下的生理机能及 生存机理，以期探索出微生物能够在恶劣环境下生存，并且具有很强的适应能力 的原理。 1 4 1 菌种资源数据库的建立及完善 资料显示，如若对白酒窖池中丰富的菌种资源进行研究利用，能够使我国的 白酒生产技术得到较大提高。但是由于目前科研水平较低、技术手段的发展比较 落后，没能充分认识窖池内的多种微型生物资源的复杂作用机理，以至于不能发 挥其应有的作用，因而目前我国的科研方面应采用常规菌种分离鉴定方法，研究 微型生物分布及其相互作用规律【3 6 j 。 1 4 2 发酵过程中微生物代谢途径的认识 发酵过程中微生物代谢途径的认识大多停留在定性的描述，定量分析研究甚 少。针对当前的研究现状，科研工作者应探索研究功能菌与发酵过程的物质变化 关系，弄明白微生物区系在窖池发酵过程中的各种物质变化与多种酶学反应的相 关性，特定生化代谢反应与曲酒风格和质量变化的相关性等。通过这些研究探索， 可以为中国浓香白酒的工艺改进和白酒品质提高提供十分必要的理论依据【3 7 舶】。 2 山东轻t 业学院硕l ：学位论文 1 。5 浓香型有机人工老窖 人工老窖是利用微生物方法，富集培养模拟天然老窖的多菌种体系，人工培 养老窖泥，并以此老窖泥建成的浓香型大曲酒发酵池。如果把整个粮食酒生产比 喻成一个人的话，那么相对应见下表： 表1 1 有机人1 ：老窖的原料与人体器官的对应 1 5 1 北方人工老窖的发展 “千年老窖万年糟”高度概括了老窖在粮食酒生产中的根本作用，7 0 年代初， 科研单位和白酒企业合作对浓香白酒的生产进行了深入的研究，通过气相色谱分 析技术确定了己酸乙酯为浓香白酒的主体香气成分，认定己酸乙酯来源于老窖泥 中己酸菌的代谢产物，成功完成了己酸菌的分离、纯化，并在四川率先推进了人 工培养老窖泥技术，在全国掀起了学四川浓香白酒的高潮，人工老窖技术在全国 推广【4 0 - 4 2 1 。 北方的人工老窖培养技术大体经历了三个阶段，先生产无机窖泥，再生产有 机窖泥。 第一阶段：“北斗工艺的推广”，7 0 年代中期，北方推广北斗生产工艺培养人 工老窖泥，先培养汉逊酵母、球拟酵母和1 2 7 4 酵母等生香酵母生成己酸菌所需的 前驱物质，再混入己酸菌培养液，最后培养人工窖泥。 第二阶段，己酸菌的培养，9 0 年代，北方各厂逐步淘汰“北斗工艺”，采用培 养纯种己酸菌液，增加窖泥中己酸菌的数量，有效提高了酒中己酸乙酯的含量， 但香气单一。 第三阶段，2 0 0 0 年后，随着消费者对产品质量的不断提高，尤其是川酒在全 国的大流通，酒体香气成分单一，成为北方浓香型酒的瓶颈，同时，四川的人工 老窖生产技术不断成熟，于是北方各厂把目光重新投向四川，学习四川的有机人 工窖泥培养方法。近几年，北方的人工老窖生产技术有了长足的发展4 3 - s o 。 1 6 本论文的选题背景、选题依据和研究意义 己酸菌是梭状芽孢杆菌属的一种，是浓香型大曲白酒发酵中起决定作用的一 种窖泥功能菌，它能产生己酸，生成己酸已脂，形成浓香型大曲白酒的主体香， 因而己酸菌数量多少和己酸乙脂转化能力的强弱直接影响浓香型大曲白酒的质 量。纯培养的己酸菌液还可以应用于液态发酵法白酒、培养人工老窖、淋窖或灌 3 本课题从章丘百脉泉酿酒有限公司优质老龄窖池中筛选出一株繁殖快、生长 旺盛、己酸产量高、不易退化、更适宜于此厂家生产环境的优良己酸菌菌种，并 对其培养条件、发酵条件及产己酸能力进行研究，目的是用其培养有机人工老窖 泥，提高浓香白酒的酒质。 ( 1 ) 己酸菌筛选：经过富集培养、初筛、复筛，挑选出多株优良菌种，再通 过发酵条件测试，最终确定适合本课题研究的己酸菌菌种。 ( 2 ) 己酸菌液纯培养：考察p h 值、乙醇浓度、热处理条件、培养温度及培养 时间对己酸菌生长情况的影响，并对这些影响因素进行优化，确定最佳纯培养条 件。 ( 3 ) 己酸菌产己酸能力的研究：研究碳源、氮源及微量元素对己酸菌产己酸 能力的影响，确定碳源、氮源及微量元素的添加量及添加种类，通过控制这些因 素，提高己酸菌产己酸的能力及己酸乙酯转化能力，以提升白酒品质。 ( 4 ) 有机人工老窖泥生产技术：将本课题筛选的己酸菌进行三角瓶培养、大 缸培养，生产出母液，然后用以配制有机人工老窖，进行发酵生产，观察窖泥特 征并检测窖泥与所生产白酒的理化指标，以对有机人工老窖的性能进行确定。 ( 5 ) 有机人工老窖的养护和复壮：研究有机人工老窖的退化现象、退化原因 及退化后对窖池与白酒产生的危害，通过控制这些因素防止窖泥退化，并采取相 应可行的措施对窖泥进行复壮。 4 山东轻丁业学院丁程硕 ：学位论文 2 1 概述 第2 章己酸菌筛选 用于发酵浓香型大曲酒泥窖中栖息着大量的微生物，这些微生物在发酵过程 中相互作用，产生许多新的代谢产物。这些产物对形成浓香型曲酒的典型风格起 着非常重要的作用。在众多微生物当中，己酸菌是浓香白酒发酵工艺中十分重要 的产酸菌。己酸菌在发酵过程中经过复杂代谢产生的己酸，己酸再与发酵过程中 产生的酒精相互作用生成己酸乙酯，己酸乙酯形成了浓香型大曲白酒的主体香气 物质。己酸菌培养液可广泛应用于浓香型大曲酒的灌窖、窖池保养、人工窖泥培 养、酯化液的制作等，以改善和提高浓香型大曲酒的质量。 本试验目的是通过对章丘百脉泉公司的优质老龄窖泥中菌种进行分离筛选， 通过富集培养，获得一株优质高产酸己酸菌，然后研究探索该己酸菌的生长规律， 以更好地指导生产、服务生产，为己酸菌的科学应用奠定基础。 2 2 材料与设备 2 2 1 实验材料 2 2 1 1 培养基 ( 1 ) 乙酸钠改良培养基 乙酸钠5 9 ，酵母膏l g ，2 硫酸镁5 m l ，5 硫酸铵1 0 m l ，4 磷酸氢二钾 1 0 m l ，0 5 硫酸钙2 0 m l ，5 m g l 生物素l m l ，自来水1 0 0 0 m l ，p h 6 肛6 5 ，于0 1 m p a 灭菌3 0 r a i n ，接种前加乙醇2 0 m l ( 2 ) 配制液体培养基 配制液体培养基，添加2 琼脂与沸腾的培养液，融化后过滤分装于小三角瓶 中，于0 1 m p a 灭菌3 0 m i n ，使用前加乙醇2 。 ( 3 ) 固体斜面试管制作 配制液体培养基，加琼脂4 ，加热融化后过滤分装至小试管各1 0 m l ，包扎 后于0 1 m p a 灭菌3 0 m i n ，放无菌室冷却至6 0 左右时加入2 乙醇，趁热摆放斜面， 于3 3 恒温培养3 d ，取出观察斜面染菌状况，如有染菌加以剔除。 ( 4 ) 己酸菌种子液的制备 取l g 窖泥放入装有液体培养基的细颈瓶中，8 0 c 水浴处理1 0 r a i n ，冷却后无 菌操作向瓶内补加液体培养基至细颈部，再加2 3 滴无水乙醇封口，加塞包扎， 5 将其溶于l o o m l 真空干燥器，无 菌刀，离心机，分光光度计，碱式滴定管( 5 0 r a l ，最d , n 度0 1 m l ) ，酸式滴定 管( 5 0 r a l ) ，锥形瓶( 2 5 0 m l ) ，试剂瓶，称量瓶，碘量瓶( 2 5 0 m l ) ，容量瓶 ( 1 0 0 m l 、1 0 0 0 m l ) ，烧杯，量筒( 5 m l 、l o o m l ) ，移液管( 1 m l 、2 5 m l 、l o m l ) 等。 2 3 实验方法 j 2 3 1 己酸的定性分析硫酸铜显色法 取2 m l 己酸菌的种液，加入2 得硫酸铜溶液2 m l ，加入乙醚l m l ，混合后振 荡，使混合液反应分层。观察乙醚层呈现的绿色，乙醚层的颜色越深，则说明己 酸含量越高。 2 3 2 富集培养 在装有富集培养基的试管中加入窖泥样品1 9 ，用8 0 。c 水浴热处理l o m i n ，冷 却，然后置于真空干燥器中抽真空至6 0 0 t u r n 汞柱，放在恒温培养箱中于3 5 培 养7 d ，观察试管中的产气情况，选取产期多的试管，再接种新培养液中，同条件 下培养7 d 。对培养液进行定性分析，根据分析结果挑选产己酸富集培养液，进行 分离培养。 2 3 3 单菌落分离 将预先配置好灭菌后的巴氏固体培养基2 0 0 r a l 熔化，加入已经灭菌的硫酸钙 和乙醇，冷却至5 0 c 左右时介入1 0 0 富集培养液试样2 m l ，混匀后倒入已经灭过 菌的2 5 0 r a l 烧杯中，凝固后倒置于盛有氢氧化钠和焦性没食子酸的小培养皿中， 用石膜封住烧杯口，在恒温培养箱中于3 5 培养7 d ，选取己酸菌单菌落，接入装 有巴氏合成培养基的试管中。 6 山东轻t 业学院r ：程硕l ：学位论文 2 3 4 初筛 挑选出的单菌落接入装有1 0 m l 的巴氏合成培养液的试管中，用真空干燥器 抽真空至6 0 0 m m 汞柱，培养液采用硫酸铜显色，挑取产己酸的菌株。 2 3 5 复筛 将初步筛选出的菌株培养液接入装有2 5 0 m l 巴氏合成培养液的碘量瓶中，放 在恒温培养箱中于3 5 培养7 d ，测定各菌株的己酸含量。 2 3 6 发酵条件试验 ( 1 ) 酸碱度对己酸菌产己酸的影响 用2 0 氢氧化钠和2 n 盐酸调整发酵培养液p h 值分别至4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、 8 0 、9 0 ，测定5 5 己酸菌在不同p h 值条件下产己酸量。结果见表2 4 。 ( 2 ) 乙醇浓度对己酸菌产己酸的影响 设计乙醇浓度为o 、l 、2 、3 、4 、5 ，将上述不同浓度的乙醇分别 添加至巴氏合成培养液中，测定5 5 己酸菌产己酸量，结果如表2 5 。 ( 3 ) 碳酸钙含量对己酸菌产己酸的影响 分别添加浓度为o 、1 、2 、3 、4 的碳酸钙至巴氏合成培养液中，测 定测定5 5 己酸菌产己酸量，结果如表2 6 。 ( 4 ) 厌氧对己酸菌产己酸的影响 将2 5 0 m l 三角瓶半瓶、满瓶的培养液真空抽气至容积系数为4 5 、9 5 ，测 定不同厌氧条件下己酸菌5 5 产己酸量，研究氧气对己酸菌产己酸的影响，结果 见表2 7 。 ( 5 ) 接种量对己酸产量的影响 分别按4 、8 、1 1 、1 5 的接种量将种子液接入到巴氏合成培养基中， 研究接种量的不同对该己酸菌产己酸量的影响。 ( 6 ) 己酸菌最适培养条件选择 为探讨己酸菌的最适培养条件，从操作的方便性和多选择两方面考虑，选择 酒度、热处理温度、p h 值、培养温度及培养时间5 个因素做l 1 6 ( 4 5 ) 正交试验，因 素水平对照如表2 1 。 7 第2 章己酸菌筛选 表2 1 因素水平对照表 水平酒度热处理温度 p h 值 培养温度 培养时间 ( ，v v )( ) ( ) ( d ) l0 1 0 042 84 229 05 3 05 348 0 63 36 46不处理 73 57 配制乙酸钠改良培养液，取4 瓶培养液，用6 n 硫酸分别调节p h 至4 、5 、6 、7 ， 在0 1 m p a 下灭菌3 0 m i n 。将3 支细颈试管己酸菌液倒人无菌三角瓶中，混匀，分别 吸取菌液5 m l 加入到细颈试管中，一共1 6 支，各自编号。按各自对应p h 值倒入大 半培养基，按试管容积的2 、4 、6 加入所需酒精，稍微振荡，继续用培养液 加满。将编好号的细颈试管分组于1 0 0 。c 、9 0 。c 、8 0 c 处理2 m i n ，达到处理时间后 后迅速放人凉水中冷却，然后分别放置于2 8 。c 、3 0 。c 、3 3 ( 2 、3 5 ( 2 的恒温培养箱 中，培养至4 d 、5 d 、6 d 、7 d 时分别进行己酸菌计数。 2 4 结果与讨论 2 4 1 分离筛选结果 分别从百脉泉公司各车间老窖、新窖的窖壁、窖底以及污泥中取得的2 8 个泥 样进行分离，挑选生长较好的单菌落，通过显微镜、油镜观察并经过定性测定， 分离得到1 1 株己酸菌，经过初筛、复筛测定产己酸含量，结果如表2 2 。 表2 2 己酸菌初筛结果 项目 方法现象初步结论 革兰氏染色菌 革兰氏染色体染色后呈红色菌株为革兰氏阴性 菌 对氧需求 有氧、无氧对照培养有氧组不生长 菌株为厌氧菌 无氧组生长 运动特征 穿刺培养穿刺四周扩散呈假根状菌株运动 菌体、芽孢形态 菌体、芽孢大小 简单染色后镜检 测微计测量 直径1 2 m m 菌体为杆状，芽孢膨大， 端生，呈鼓锤状 菌体长4 9 m ，宽l p m ， 芽孢直径1 3 p r o 该菌株为芽孢菌 接近文献中关于己 酸菌的描述 8 山东轻t 业学院下程硕 = 学位论文 从表2 3 可以看出，经过己酸产量的测定，筛选出的1 l 株己酸菌，产己酸最高 的菌株5 5 己酸产量可达5 5 0 m g 1 0 0 m l ，最低也可达4 5 0 m g 1 0 0 m l ，因此，选择5 5 做发酵条件试验。 2 4 2 发酵条件试验 ( 1 ) 酸碱度对己酸菌产己酸的影响 将p h 值调整至似之间，分别测定不同p h 值情况下产己酸的量，根据己酸 产量确定p h 值对己酸菌产己酸的影响。 表2 4 不同p h 值对己酸菌产己酸的影响 由表2 4 可以看出，该己酸菌产己酸的量随p h 值升高而增加，在p h 值为8 0 时己酸达到产量最高，而后p h 值继续升高己酸产量不升反降，试验说明该己酸 菌在中性和偏碱性条件下己酸产量较高。 ( 2 ) 乙醇浓度对己酸菌产己酸的影响 分别将浓度为o 、1 、2 、3 、4 、5 的乙醇添加至巴氏合成培养液中， 测定5 5 己酸菌产己酸量，结果如表2 5 。 表2 5 乙醇浓度对己酸菌产己酸的影响 试验结果表明，如表2 5 ，乙醇是己酸菌必须的碳源，培养过程中若没有乙醇， 则己酸菌不产己酸。通过试验得知，己酸菌5 5 最适乙醇浓度为1 2 ，当浓度高 于2 时，己酸产量下降，当浓度达到5 时，该菌将不再产生己酸。 ( 3 ) 碳酸钙含量对已酸菌产己酸的影响 添加不同浓度的碳酸钙到巴氏合成培养液中，测定己酸菌5 5 的产己酸量， 结果见表2 6 。 9 第2 章己酸菌筛选 表2 6 碳酸钙含量对己酸菌产己酸的影响 碳酸钙( ) 0 1234 己酸407 4 5 54 6 54 3 33 6 3 ( m g 1 0 0 m l ) 从表2 6 中可以看出，该菌对碳酸钙要求不严格，碳酸钙对该己酸菌产己酸 影响不大，不加碳酸钙时己酸产量可达到4 0 7 m g l o o m l ，但是添加后能提高己酸 产量，试验表明，最适碳酸钙含量为2 。 ( 4 ) 厌氧对己酸菌产己酸的影响 测定不同厌氧条件下己酸菌5 5 产己酸量，研究氧气对己酸菌产己酸的影响， 结果见表2 7 。 表2 7 溶氧对己酸菌产己酸的影响 厌氧条件( 真空抽气)容积系数( ) 己酸( m g l o o m l ) 2 5 0 r a l 三角瓶满瓶 2 5 0 r a l 三角瓶半瓶 2 5 0 m l 三角瓶满瓶 2 5 0 m l 三角瓶半瓶 9 5 4 5 9 5 4 5 5 1 3 4 1 7 4 4 9 3 8 1 试验结果表明，该己酸菌5 5 培养时不需要真空抽气，容器装满后以液体深 层发酵培养，己酸产量即可达到最高，当瓶内增加氧气含量时，己酸产量降低。 ( 5 ) 接种量对己酸产量的影响 将种子液分别按4 、7 、1 0 、1 5 浓度接入到巴氏合成培养基中，测定 己酸含量。不同接种量对己酸菌5 5 产己酸量的影响见表2 8 。 表2 8 接种量对己酸菌产己酸的影响 从表2 8 中看以看出，当接种量为4 时，己酸产量最高，当接种量继续提高， 直至达到1 5 时，己酸产量没有明显增加，故该己酸菌的最佳接种量为4 。 ( 6 ) 己酸菌最适培养条件正交试验结果 l o 山东轻t 业学院t 程硕卜学位论文 影响己酸菌生长繁殖大小的因素依次为酒度、p h 值、培养时间、培养温度、 热处理温度，其中酒度和p h 值对己酸菌的生长繁殖影响最大。较理想的试验编 号为1 群、1 4 撑，最优量化因子为a 3 8 3 c 2 d 2 e 3 ，即己酸菌的最佳培养条件为：p h 6 ， 酒度为2 ，热处理温度8 0 。c ，培养温度为3 0 c ，培养时间为6 d 。 2 5 本章小结 经过己酸产量的测定，筛选出1 1 株己酸菌，产己酸最高的菌株5 5 己酸产量 可达5 5 0 m e d l 0 0 m l ，最低也可达4 5 0 r a g 1 0 0 m l ，因此，选择5 5 做发酵条件试验。 将p h 值调整至4 - , 9 之间，分别测定不同p h 值情况下产己酸的量，根据己酸 产量确定p h 值对己酸菌产己酸的影响。结果显示，该己酸菌产己酸的量随p h 值 升高而增加，在p h 值为8 0 时己酸达到产量最高，而后p h 值继续升高己酸产量 不升反降，试验说明该己酸菌在中性和偏碱性条件下己酸产量较高。 分别将浓度为o 、1 、2 、3 、4 、5 的乙醇添加至巴氏合成培养液中， 养过程 不加 试验结果表明，该己酸菌5 5 培养时不需要真空抽气，容器装满后以液体深层发 酵培养，己酸产量即可达到最高，当瓶内增加氧气含量时，己酸产量降低。 将种子液分别按4 、7 、1 0 、1 5 浓度接入到巴氏合成培养基中，测定 己酸含量。结果表明，当接种量为4 时，己酸产量最高，当接种量继续提高， 直至达到15 时，己酸产量没有明显增加，故该己酸菌的最佳接种量为4 。 影响己酸菌生长繁殖大小的因素依次为酒度、p h 值、培养时间、培养温度、 热处理温度，其中酒度和p h 值对己酸菌的生长繁殖影响最大。较理想己酸菌的 最佳培养条件为：p h 6 ，酒度为2 ，热处理温度8 0 ，培养温度为3 0 ，培养 时间为6 d 。 通过试验我们可以得到以下结论： ( 1 ) 菌种筛选 从百脉泉公司各车间老窖、新窖的窖壁、窖底以及污泥中取得的2 8 个泥样进 行分离，通过显微镜、油镜观察并经过定性测定，分离得到1 1 株己酸菌，经过初 筛、复筛测定产己酸含量，选出产己酸最高的菌株5 5 ，其己酸产量可达5 5 0 m g 1 0 0 m l ，最低也可达4 5 0 r a g 1 0 0 m l 。 ( 2 ) 发酵条件研究 己酸菌产己酸的量随p h 值升高而增加，在p h 值为8 0 时己酸达到产量最高， 而后p h 值继续升高己酸产量不升反降；乙醇是己酸菌必须的碳源，培养过程中 若没有乙醇，则己酸菌不产己酸。通过试验得知，己酸菌5 - 5 最适乙醇浓度为 l 2 ，当浓度高于2 时，己酸产量下降，当浓度达到5 时，该菌将不再产生 己酸；菌对碳酸钙要求不严格，碳酸钙对该己酸菌产己酸影响不大，不加碳酸钙 时己酸产量可达到4 0 7 m g 1 0 0 m l ，但是添加后能提高己酸产量，最适碳酸钙含量 为2 ；己酸菌5 5 培养时不需要真空抽气，容器装满后以液体深层发酵培养，己 酸产量即可达到最高，当瓶内增加氧气含量时，己酸产量降低；当接种量为4 时，己酸产量最高，当接种量继续提高，直至达到1 5 时，己酸产量没有明显增 加，故该己酸菌的最佳接种量为4 。 1 2 山东轻下业学院t 程颇 j 学位论义 ( 3 ) 最佳培养条件 影响己酸菌生长繁殖大小的因素依次为酒度、p h 值、培养时间，培养温度、 热处理温度，其中酒度和p h 值对已酸菌的生长繁殖影响最大。较理想的试验编 号为1 群、1 4 # ，最优量化因子为a 3 8 3 c 2 d 2 e 3 ，即己酸菌的最佳培养条件为：p h 6 ， 酒度为2 ，热处理温度8 0 。c ，培养温度为3 0 。c ，培养时间为6 d 。 1 3 1 4 山东轻t 业学院t 程顾1 ：学位论文 3 1 引言 第3 章己酸菌纯培养 生产实践过程中，之所以要对己酸菌进行纯培养，目的是为了增加发酵过程 中己酸的产量，进而提高己酸乙酯的转化率，以此增加白酒中己酸乙酯的含量， 用以最大限度突出浓香白酒中己酸乙酯主体香。己酸菌的主要代谢产物为己酸， 发酵过程中，己酸与酒醅中的乙醇反应生成己酸乙酯，所以只有己酸的含量高时， 白酒中的己酸乙酯的含量才会高。要提高己酸乙酯含量，先要提高己酸产含量， 因此要从筛选驯化具有优良性能的己酸菌的菌株入手。 本课题对己酸菌纯培养技术进行研究，通过改善纯培养技术，增加窖泥中己 酸菌的含量，继而增加白酒中己酸乙酯含量，突出主体香。以改善和提高浓香型 大曲酒的质量。 3 2 材料与设备 3 。2 1 实验材料 ( 1 ) 菌种：自行分离筛选的己酸菌s c l 2 0 3 ( 2 ) 培养基 乙酸钠改良培养基 蒸馏水5 0 0 m l ，乙酸钠2 5 9 ，酵母膏o 5 9 ，浓度为2 的硫酸镁2 5 m l ，浓 度为5 的硫酸铵5 m l ，4 浓度的磷酸氢二钾5 m l ，浓度为0 0 5 的硫酸钙1 0 m l ， 5 m g l 的生物素l m l ，p h 为6 0 , - , 6 5 ，配制好后于o 1 m p a 灭菌3 0 r a i n ，灭完菌后 待用，接种前加乙醇1 0 m l 。 固体斜面试管 蒸馏水5 0 0 m l ，乙酸钠2 5 9 ，酵母膏o 5 9 ，浓度为2 的硫酸镁2 5 m l ，浓 度为5 的硫酸铵5 m l ，4 浓度的磷酸氢二钾5 m l ，浓度为0 0 5 的硫酸钙1 0 m l ， 5 m g l 的生物素l m l ，加入4 的琼脂，p h 为6 0 - - a 5 5 ，配制好分装到小试管，后 于0 1 m p a 灭菌3 0 m i n ，灭完菌后待用，接种加入2 乙醇，摆放斜面，凝固后放 置恒温培养箱培养，3 3 培养3 d 。 固体乙酸钠改良培养基 配制乙酸钠改良培养基，煮沸后加入2 的琼脂，待琼脂融化后分装到2 5 0 m l 的三角瓶中，于0 1 m p a 灭菌3 0 m i n ，使用前加入乙醇2 。 1 5 第3 章己酸菌纯培养 2 仪器设备 灭菌锅，恒温培养箱，显微镜，超净工作台，天