（食品科学专业论文）单辛酸甘油酯的酶法合成及性质研究.pdfVIP

摘要 摘要 单辛酸甘油酯是脂肪的中间代谢物，在体内没有代谢不良的蓄积性和特异性反应， 是一种安全性较高的物质。它不仅具有典型的表面活性，还具有一定的防腐功能，因而 用于食品中，能提高食品质量，延长食品贮藏期。本文以辛酸和甘油为原料，通过脂肪 酶在无溶剂条件下催化合成单辛酸甘油酯。 通过酶的筛选，确定n o v 0 4 3 5 脂肪酶催化酯化合成最为有效。单因素和响应面实验， 确定使用该酶催化合成单辛酸甘油酯的最佳工艺条件为：无水条件下甘油辛酸摩尔比为 1 ：l ，脂肪酶与底物质量比为o 8 8 ，反应温度为6 6 8 ，反应时间为11 5 h 。此时辛酸 转化率约为9 3 5 3 ，单酯含量约为4 7 6 9 。 采用高效液相、质谱分析鉴定合成粗产物，确定其主要成分为辛酸甘油单酯、辛酸 甘油二酯及辛酸甘油三酯。以氯仿：丙酮：甲酸( 9 6 ：4 ：0 5 ) 为展开剂的薄层层析定性分析得 到单酯、二酯及三酯的比移值r f 分别为o 1 5 、0 5 和o 6 5 、0 9 4 。采用c 1 8 柱，分别以 3 倍柱体积甲醇水溶液6 0 、7 0 、8 0 、9 0 、1 0 0 为连续流动相梯度沈脱能得到纯 度在9 0 以上的单辛酸甘油酯样品。 研究了单辛酸甘油酯作为表面活性剂的一些基本性质如h l b 值、临界胶束浓度 ( c m c ) 、表面张力、乳化性、起泡性。其h l b 值约为4 7 ；c m c 约为0 8 9 l ；质量分数为 o 3 的溶液表面张力约为2 8 4 m n m ；当质量分数大于临界胶束浓度时单辛酸甘油酯表 现出较好的乳化稳定性；单辛酸甘油酯起泡性很差，基本没有泡沫稳定性。 抑菌活性研究表明，单辛酸甘油酯对一些食品中常见的细菌、霉菌和酵母均有较强 的抑菌作用，有较广的抑菌谱，且具有较好的耐酸碱性和热稳定性。它对大肠杆菌 ( e s c h e r i c h e a ec o l i ) 、金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ) 的最低抑菌浓度分别为0 8 ：g l 及0 7 l ；对啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r i v i s i a e ) 及面包酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v l s i a e ) 的最低抑菌浓度分别为0 6 9 l 和o 8 9 l ；对黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 和桔青霉( p e n i c i l l i u m c i t r i n u m ) 的最低抑菌浓度分别为o 8 l 和0 9 9 l 。添加一定量的单辛酸甘油酯可有效延 长大肠杆菌、啤酒酵母、黑曲霉及牛奶酸败菌的生长适应期，降低它们的最终生长量， 并且效果优于常用防腐剂山梨酸钾。 关键词：酶合成单辛酸甘油酯分离纯化表面活性抑菌活性 a b s t r a c t g l y c e r o lm o n o c a p r y l a t ei sam e t a b o l i s mp r o d u c to ft h ef a tw h i c hi so n eo ft h et h r e e m a j o rn u t r i t i o n s ，i ti sah i g hs e c u r em a t e r i a lw i t hn oa d v e r s ea c c u m u l a t i o na n dr e a c t i o ni n p e r s o n s b o d y g l y c e r o lm o n o c a p r y l a t ec a nb eu s e dt oi m p r o v et h ef o o d q u a l i t ya sa s u r f a c t a n ta n dt oe x t e n dt h ef o o ds t o r a g ep e r i o da sap r e s e r v a t i v e i nt h i s p a p e r ，g l y c e r o l m o n o c a p r y l a t ew a ss y n t h e s i z e db yg l y c e r o la n do c t a n o i ca c i di nas o l v e n tf r e es y s t e m i na l le n z y m e s ，t h ei m m o b i l i z e dl i p a s e n o v 0 4 35w a sf o u n dt h em o s t e f f e c t i v ef o r e s t e r i f i c a t i o n t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fs y n t h e s i sw e r eo b t a i n e dt h r o u g hs i n g l ef a c t o rt e s t a n dr e s p o n s es u r f a c em e t h o d s u c c e s s i v e l y w h e nt h er a t i oo fg l y c e r o lt oo c t a n o i ca c i d1 ：1 t h e l i p a s ed o s a g e0 8 8 ( w w ) b a s e do nt h er e a c t a n tw a se m p l o y e di nt h er e a c t i n gs y s t e m ，t h e c o n v e r s i o nr a t eo fo c t a n o i ca c i dc o u l dr e a c h9 3 5 3 a t6 6 8 f o r11 5 hr e a c t i o n t h e c o n t e n to fg l y c e r o lm o n o c a p r y l a t ew a sa b o u t4 7 6 9 i nt h e r e a c t i n gp r o d u c t i o n t h e r ew e r em o n o e s t e r ，d i e s t e ra n dt r i e s t e ri nt h ep r o d u c tw h e n a n a l y s e db yl c m s t h e a n a l y s i sc o n d i t i o nf o rt h et h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) w a sc o n f i r m e d ，c h l o r o f o r n l ： a c e t o n e ：f o r m y l ( 9 6 ：4 ：0 5 ) w a su s e da st h em o b i l ep h a s e ，a n dt h ep r o d u c tw a sd e t e c t e db v i o d i n es t e a m t h er e t e n t i o nf a c t o r ( r 0o ft h em o n o e s t e r ，d i e s t e ra n d t r i e s t e rw a s0 15 0 5a n d o 6 5 ，0 9 4 ，r e s p e c t i v e l y t h e n ，t h ec o n d i t i o n so fh p l cw a sa p p l i e dt ot h el i c h r o s p h e rc 18 c o l u m nc h r o m a t o g r a p h yf o rs e p a r a t i n ga n dp u r i f y i n gt h eg l y c e r o lm o n o c a p r y l a t e m e t h a n o l ： w a t e r ( 6 0 ，7 0 ，8 0 ，9 0 ) w a su s e da sm o b i l ep h a s e ，e v e r ym o b i l ep h a s ev o l u m ew a s3 t i m e so ft h ec18c o l u m nv o l u m e t h el c - m sa n di rw e r eu s e dt o a n a l y z et h ep r o d u c t i o n ， t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ec o n t e n to f g l y c e r o lm o n o c a p r y l a t ew a sm o r et h a n9 0 t h es u r f a c t a n tp r o p e r t i e so fg l y c e r o lm o n o c a p r y l a t ew e r ea l s os t u d i e d t h eh l b v a l u e w a s4 7 ，t h ec m cw a s0 8 9 l ，a n dt h es u r f a c et e n s i o nw a s2 8 4 m n mw h i c ht h em a s s c o n c e n t r a t i o nw a s0 3 t h ee m u l s i o na c t i v i t yo fg l y c e r o lm o n o c a p r y l a t ew a sg o o da n dh a d e x c e l l e n te m u l s i o ns t a b i l i t yw h e nt h ec o n c e n t r a t i o nw a sm o r et h a nt h ec m c t h ef o 锄 a c t i v i t yo fg l y c e r o lm o n o c a p r y l a t ew a sn o tg o o da n dh a dn of o a m s t a b i l i t y t h er e s u l t so fa n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y o f g l y c e r o lm o n o c a p r y l a t es h o w e dt h a ti t s m i n i m u mi n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o nw a s o 8 9 l f o re s c h e r i c h e a e c o l i 0 7 e e l f o r s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，o 6 9 lf o rs a c c h a r o m y c e sc e r i v i s i a e ，0 8 9 lf o rs a c c h a r o m v c e s c e r e v l s i a e ，0 8 9 lf o ra s p e r g i l l u sn i g e ra n d0 9 9 lf o rp e n i c i l l i u mc i t r i n u m i ts u g g e s t e dt h a t g l y c e r o lm o n o c a p r y l a t eh a daw i d ea n t i m i c r o b i a ls p e c t r a t h eg l y c e r o lm o n o c a p r y l a t ec o u l d e f f e c t i v e l yp r o l o n ga d a p t i v ea n dd e c r e a s eg r o w t hq u a n t i t yo ft h ee s c h e r i c h e a e c o l i s a c c h a r o m y c e sc e r i v i s i a e ，a s p e r g i l l u sn i g e ra n dm i l ks p o i l a g em i c r o o r g a n i s m s ，a n dt h ee 虢c t w a ss u p e n o rt h a nt h ep o t a s s i u ms o r b a t ew h i c hw a si nc o m m o m u s e f u r t h e n l l o r ei th a db e t t e r h e a ts t a b i l i t ya n da c i da n da l k a l is t a b i l i t yw h e nw a su s e da sp r e s e r v a t i v e i i a b s t r a c t k e yw o r d s ：e n z y m e ；s y n t h e s i s ；g l y c e r o lm o n o c a p r y l a t e ；s e p a r a t i o n ；s u r f a c t a n t ； a n t i m i c r o b i a la c t i v i t 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 日 期：g 爹- 芗q 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 2 口口髫、箩扣 日 期： 2d 口彦箩弓口 第一章绪论 1 1 单辛酸甘油酯的性质 第一章绪论 单辛酸甘油f l 旨( c 8 m g ) 是由8 个碳原子的直链饱和辛酸和甘油以1 ：1 形成的酯，相对 分子质量为2 18 ，是单脂肪酸甘油酯( 简称单甘酯) 的一种。单辛酸甘油酯为浅黄色粘稠 液或乳白色塑性体，无臭，略带有苦味，熔点4 0 。c ，微溶于水，可与热水振摇后乳化， 溶于乙醇、乙酸乙酯、氯仿和苯中。就化学结构而言，他具有两种结构，即c 【一型和p 一 型，一般是两种构型的混合物，其中以0 【型为主。 0 i i c h 2 一o c 一( c h 2 ) 6 一c h 3 i c h 一0 h i c h 2 0 h 伍型 1 2 单辛酸甘油酯的功能特性及应用 1 0 i c h 2 - - 0 h 8 型 单辛酸甘油酯除具有典型的表面活性作用外，在食品中还具有许多其它功能。在此 基础上，单辛酸甘油酯不仅能提高食品质量，延长食品贮藏期，改善食品的感官性状， 而且还可以防止食品变质，便于食品加工和保鲜，有助于新型食品的开发【2 j 。 1 2 1 乳化性 单甘酯是非离子表面活性剂，具有两亲分子结构。其亲油基团由脂肪酸组成，亲水 基团由甘油基组成。这种两亲分子结构使单辛酸甘油酯能够容易富集于溶液表面发生吸 附，而且在表面和界面上定向排列，产生表面活性和界面活性，降低了表面或界面张力。 使原来互不相溶的物质得以均匀混合，形成均匀状态的分散体系，改变了原料的物理状 态，进而改善食品的内部结构，提高质量【3 】；这种分子结构还可使其在油相和水相间的 界面形成一层膜，降低液体的表面张力，具有很好的乳化性能，为优良的w o 乳化剂。 单甘酯还可与淀粉、蛋白质及油脂等食物组分形成复合体，能抑制淀粉的老化，改善食 品的性能，为优良的食品乳化剂【4 】，单甘酯目前是用量最大的食品乳化剂【5 j 。 1 2 2 防腐作用 关于脂肪酸及其酯类的防腐作用机制。国外已经作了大量研究工作，日本的岩波等 提出脂肪酸及其酯与微生物膜的关系假说，其中指出，脂肪酸及其酯首先接近作为对象 的细胞膜表面，然后亲油部分的脂肪酸及其酯在细胞膜中多数呈刺透进入状态。这种状 态影响了细胞膜的正常代谢，最终导致细胞机能终止【l j 。 江南人学硕十学位论文 1 2 3 单甘酯的应用 从文献报道看【6 】，食品中添加单甘酯类物质主要是利用其乳化功能，而对它的防腐 剂作用报道较少。 1 ) 单甘酯在面包等烘烤食品中的应用 单甘酯是制作优质面包等烘烤食品的重要乳化剂。作为乳化剂本身具有亲水亲油基 团，能增加食品各组份间的亲合力，降低界面上的张力，促进原料特别是油脂均匀地混 合在一起。单甘酯在面包中作乳化剂有乳化作用和抗老化作用两个方面，可消除面包变 硬、掉渣、失去弹性、口感变劣等现象，使制得的面包松软体大、富于弹性，内部结构 呈松软海绵状，放置一周仍可保持良好风味。 2 ) 单甘酯在糕点中的应用 单甘酯与蔗糖酯、丙二醇酯等乳化剂合用，是制作糕点的起泡剂。单甘酯能促进蛋 白质起泡性，在制作蛋糕时能形成“蛋白一单甘酯 的复合体，有效地帮助蛋糕打搅起 泡，产生稳定的气泡膜，从而制出稳定细小的气泡、容积明显增大的糕点。 3 ) 单甘酯在米面制品中的应用 单甘酯、卵磷脂、海藻酸钠等合用，能增加生面团的紧密性和明显提高面条的弹性， 面条的制品在沸煮时不易糊烂，减少煮水混浊，食用时口感良好。方便面、速食面等由 于添加了分子蒸馏单甘酯，能促进水的润湿和渗透，方便食用。米粉制品添加单甘酯， 可使水分传导性好，增加米粉白度和柔韧性，改善食感。 4 ) 单甘酯在饼干中的应用 添加面粉量5 的单甘酯，可使油脂以乳化状态均匀分散于饼干中，改良饼干、曲 奇饼的组织结构，防止油脂的渗出，提高饼制品的松脆性。还可使饼干在生产过程中易 于脱模、花纹清晰，贮存运输时不易破碎。 5 ) 单甘酯在糖果、巧克力中的应用 利用单甘酯作乳化剂和增塑剂，可防止奶油糖、太妃糖等糖果产生油脂分离现象， 提高糖果的防潮性，减少变形，防止粘纸粘牙、改善口感，单甘酯能抑制巧克力油脂结 晶，防止巧克力起霜，提高巧克力脆性。有效地防止受潮受热变软而影响品味。单甘酯 是胶姆糖的良好增塑剂，赋予胶姆糖、泡泡糖更佳的柔软性和可塑性，更佳的咀嚼口感。 6 ) 单甘酯在冰淇淋中的应用 单甘酯是制作优质冰淇淋最理想的乳化剂和稳定剂，添加后可使冰淇淋各组分混合 均匀，组织细腻光滑，膨化适度，品尝时口溶性好，避免冰晶形成，提高保形性和贮存 稳定性。单甘酯与海藻酸钠、果胶等同用，效果更佳。单甘酯的添加量为冰淇淋原料总 重量0 5 左右。 7 ) 单甘酯在食用油脂、乳制品中的应用 人造奶油、黄奶、起酥油、花生酱、蚝油等产品，都需要加入单甘酯作为乳化剂和 稳定剂，以调整油脂结晶作用，防止油水分离、分层现象发生，提高制品质量。炼奶、 麦乳精、乳酪、速溶全脂奶粉等制品，单甘酯是其良好的乳化剂，可提高速溶性，防止 沉淀、结块结粒，改善产品质量。粉末油脂制品如咖啡伴侣，单甘酯是其主要的乳化剂。 2 第一章绪论 8 ) 单甘酯在饮料中的应用 单甘酯添加于含油脂或蛋白质的饮料中，如豆奶、花生奶、乳酸奶、可可奶、杏仁 奶、豆浆晶等，可显著提高溶解度和稳定性，防止沉淀、分离现象，延长货架寿命。普 通胶体类稳定剂、增稠剂，在高温情况下易致分子降解，影响饮料的均质效果。而单甘 酯能耐受高温，可适合各种饮料生产。配合酪朊酸钠等乳化剂同用，适当提高均质压力， 则乳化效果更佳。单甘酯还可用于生产饮料用的乳化香精。 9 ) 单甘酯在肉类制品上的应用 在生产香肠、午餐肉、肉丸、鱼肉馅等肉类制品时，往往需要添加适量淀粉作填加 充料，加入单甘酯后，可防止淀粉回生、老化，改善食感。同时由于单甘酯的乳化作用， 可使脂肪类原料更好的分散，易于加工，抑制析水、收缩或硬化现象。 1 0 ) 单甘酯在化妆品中的应用 由于单甘酯具有良好的乳化分散和增稠稳定作用，所以很适用于油水( o w ) 型或水 油( w o ) 型乳化系的化妆品、药品，如雪化膏、洗面奶、高级香皂等，提高分散相的分 散度，保证产品的质量稳定。 1 1 ) 单甘酯在制药中的应用 在美国药典1 6 版( t h en a t i o n a lf o r m u l a r yxv i ) 中列有单甘酯。单甘酯可用于制各膏 药、搽剂和软膏等外用药，也用于悬浮液和乳状液口服制剂中，如鱼肝油乳剂、眼药膏 世 1 亍o 12 ) 单甘酯在其他方面的应用 单甘酯有消泡作用，在豆类产品加工中可作消泡剂使用，并可使豆腐制品保水性好， 收率提高。食用干酵母在加工过程中，为保护细胞活性，可添加单甘酯等作保护剂。水 果保鲜剂中，可添加单甘酯，改善保鲜效果。制糖工业用单甘酯等乳化剂，能促进蔗糖 结晶，提高蔗糖收率，减少糖密量。单甘酯还可用于包装行业生产聚氯乙烯材料，聚乙 烯瓶，提高其柔软性和塑性，在纤维工业和纺织工业中经常是纺丝油剂的乳化剂组份【7 1 。 随着人类生活水平的不断提高，单甘酯的应用领域还在不断扩展。 1 3 单甘酯的合成方法 1 3 1 化学法合成 单甘酯的商业化生产方法主要还是化学合成法，包括直接酯化法和甘油解法两种基 本类型【8 】，其反应式如下： 1 ) 直接酯化法 0 1 1 0 i l c h 2 一o h。c h 2 一。一c rc h 2 0 一爸一r 催化剂 ii 。 一 c h - - o h + r c 0 o h ；三吾兰c h o h+ c h o h 0 i高温j ii | c h a - o h c h a - - o h e h 2 0 一c r 甘油脂肪酸 单酯 二酯 该方法一般采用过量甘油，在1 5 0 1 8 0 c 下反应，反应时问为2 4 h ，所得产物为 3 江南大学倾十学位论文 单脂肪酸甘油酯、二脂肪酸甘油酯以及部分未反应的底物的混合物，其中单脂肪酸甘油 酯含量为5 0 左右，反应结束后要分离除去过量甘油和催化剂。 2 ) 甘油解 o i l c h 2 0 一c o r c h 2 一o h c h 2 0 一c rc h 2 一o c o r c h 一0 一c o r + c ih - - 0 h 墨c i h一0h+clh o c o r 一一 一r+ ；= = 三 一 + 一u 一 一r i 2 一一。一r占h 2 一。h 高温 l 2 一h!2一ohch0c c h0 c ho i - t 2 一一o rc h 2 0 h2 一h 2 一 油脂甘油单酯 = 酯 0 i l c h 2 0 一c o - r c h 2 一o h c h 2 0 一c r c h 2 一o h c h - - o - - c o r + c h - - o h ；= = 兰c h o h + c h - - 0 - - c o - - r c h 2 一o h c h 2 - - o hc h 2 - - o h c h 2 一o h 二酯 甘油 单酯单酯 该法是在高温下( 2 2 0 ) 以碱为催化剂进行的反应，反应时间2 - - , 3 h ，产物同样是 单脂肪酸甘油酯、二脂肪酸甘油酯的混合物，单脂肪酸甘油酯含量为4 5 左右，需要经 分子蒸馏得到高纯度的单甘酯。 化学合成的优点：反应时间短，所得产物产量较高。缺点：需要使用过量甘油；高 温条件下反应，能耗较大；高温会导致油脂中不饱和脂肪酸发生降解，降解产物颜色较 深，影响产品色泽；副产物较多，分离提纯较困难；设备投资大，成本高。 1 3 2 酶法合成 近年来，人们进行了利用脂肪酶催化合成单甘酯方面的研究，提出了由脂肪酶催化 三甘油酯的选择性水解、脂肪酸或酯与甘油的酯化或转酯化、天然油脂的醇解以及甘油 解等几种工艺路线9 1 ，并对相应的反应体系、工艺过程及反应温度、底物浓度等因素对 单甘酯的产率影响进行了研究。几种常用的合成工艺如下【l o 】： 1 ) 水解法 o i | c h 2 0 一c o - rc h 2 0 一c r c h 2 0 一c o - r 占h o c o r + h 2 0 坚占h 一。h+ 占h 一。一c o r c h 2 0 一c 0 一r c h 2 一o hc h 2 一o h 油脂 单酯= 酯 2 1 酯化法 o i l e h 2 0 hc h 2 0 一c rc h 2 0 一c 0 一r i脂肪酶ii c h o h+ r c o o h jc h o h+ c h 一0 一c 0 一r lil c h 2 0 h c h 2 一o hc h 2 一o h 甘油 脂肪酸单酯二酯 4 第一章绪论 3 ) 甘油解法 o | i c h 2 一。一c o r旱h 2 一o hc h 2 一。一c rc h 2 一。一c o - - r 占h 一0 一c o r + 占h o h 塑占h o h+ 占h o c 。一r c h 2 一o c o - - r c h 2 一o h c h 2 一o h c h 2 一o h 油脂 甘油单酯 二酯 与化学法相比，酶促法合成单甘酯具有以下优点：反应在低温或者常温下进行，节 省能源，且不会发生高温下会出现的那些副反应，产品品质高，色泽、气味好；反应转 化率高，提高了效率和原料利用率；由于化学法在高温下进行，所用的脂肪酸必须是饱 和脂肪酸，而酶法在常温下进行，因此对脂肪酸饱和度没有要求。 虽然目前酶法合成单甘酯由于种种原因还没有完全实现工业化，但由于以脂肪酶为 催化剂合成单甘酯，具有反应温度低，选择性好，产率高，设备投资少等优点，国外一 些研究机构开展了以脂肪酶为催化剂，催化油脂甘油解或甘油与脂肪酸酯化，或油脂部 分水解等路线制备单甘酯，成为一个具有应用前景的新的酶化工合成方法 1 1 , 1 2 】。 过去习惯以为酶仅能在水中发挥催化作用，而非水酶学这一崭新领域的出现，大大 扩展了酶的应用范围，为酶学注入了新的生机和活力。非水酶学的研究在近年来取得了 可喜的成果，为酶在精细化工、材料科学和医药等方面的应用展现了广阔的前景【l3 1 。 1 4 非水相生物催化技术的研究情况 酶作为生物催化剂，具有专性、高效性、反应条件温和等优点，越来越受到人们 的关注。传统观念认为酶只能在水溶液中发挥其催化作用，而在有机溶剂中酶蛋白容易 变性失活。1 9 8 4 年z a k s 和k l i b a n o v 1 4 】首次研究报道了在非水相中可进行酶的催化反应， 从此非水相酶学成为一个迅速发展的研究领域，吸引了大批化学家、生物学家和化学工 程师的广泛兴趣。 1 4 1 非水相酶促反应的优点 非水相酶学的发展极大的促进了酶在有机合成中的应用。到目前为止，根据报道， 在有机溶剂中催化反应的酶已经有十多种，他们是：脂肪酶、酯酶、蛋白酶、过氧化氢 酶、多酚氧化酶、a t p 酶等【l5 1 。但研究最多的还是脂肪酶。这些酶的使用形式也从简单 的游离酶到固定化酶、化学修饰酶、蛋白质工程酶和抗体酶。与在水相中进行的酶促反 应相比，非水相酶促反应具有许多优越性【1 6 1 ： 1 酶不溶于有机相，容易回收再利用； 2 从低沸点的溶剂中分离纯化产物比水中容易； 3 固定化酶方法简单，在无水介质中酶不易脱离吸附表面； 4 增加了非极性底物的溶解性，有利于高浓度底物连续生产转化； 5 抑制与水有关的副产物； 6 没有微生物的污染。 江雨大学坝l 学位论文 脂肪酶( e c 3 1 1 3 ) 本质上是水解三酰化甘油酯键的丝氨酸水解酶，在有机相中可使 反应热力学平衡从水解反应转为其逆反应，如酯合成、酯交换、肽合成、酯聚合、酰化 等【1 7 。2 4 】，在食品、制药、精细化工、有机合成等领域有广阔的应用前景。 1 4 2 非水溶剂对酶的影响及溶剂的选择原则 1 ) 非水相中水对酶催化的影响 在非水相中，水是酶蛋白所表现出的许多特性的决定因素，如酶的活性，酶的稳定 性和酶的特异性。控制好非水相生物催化体系中水的量和位置是成功应用非水相生物转 化的关键。一般认为，水在酶催化系统中起着正反两方面的作用。 在正的方面，酶在绝对无水的条件下是不可能有催化活性的【2 5 1 。因为是水分子直接 或间接地通过氢键、疏水键、范德华力等作用来维持着酶分子具有催化活性时所必需的 构象。维持酶催化活性所必需的最少量水称为“必需水”，只要这层“必需水 不丢失， 酶的催化活性就不受影响。因而可以把有机溶剂中进行的酶催化反应理解为宏观上的非 水相，而微观上是微水相反应。在反的方面，水与大部分酶的失活作用有关，尤其是酶 的“热失活”。温度升高时，酶分子首先发生可逆折叠，然后进行下述一种或几种反应 幽j ：( 1 ) 形成不规则结构；( 2 ) 通过1 3 消除使二硫键破坏；( 3 ) 天冬酰胺和谷氨酰胺残基的 脱酰胺；( 4 ) 天冬酰胺残基的肽键水解。这些过程都需要有水的存在才能进行。另外，在 有水生成的可逆反应( 如酯化反应) 中，水分的存在也对该反应的热力学平衡不利。 此外，水含量对有机相酶催化反应的反应速率、转化率选择性以及化学平衡方向均 有一定的影响。 2 1 非水相中有机溶剂对酶催化的影响 非水相酶催化反应体系中可以有有机溶剂，也可以没有有机溶剂，对于有有机溶剂 的体系，溶剂对酶、底物以及反应的热力学、动力学参数都会有所影响。 ( 1 ) 溶剂对酶活性的影响溶剂可以影响底物和产物的分配和扩散，从而间接影响酶 的活性；溶剂也可以作用于酶的水化层，比如极性溶剂可以溶解大量的水并且剥去酶的 结合水，从而影响酶的活性；溶剂也可以直接作用于酶，破坏酶蛋白活性中心构型的氢 键、疏水作用等使酶失活。 ( 2 ) 溶剂可提高酶的热稳定性在导致酶在高温下不可逆变性失活的一系列热降解 反应中，水不仅是反应试剂，而且易促进蛋白质流动，导致热不折叠和热诱导的不j 下确 构型形成及热聚合 2 7 】。而当有机溶剂为介质时，可防止酶的不利构型形成和酶变性的 共价作用，从而使酶的稳定性提高。 ( 3 ) 溶剂对酶底物专一性的影响研究发现，对同一种酶，采用不同有机溶剂时，酶 催化底物的优先情况不同，这种选择性包括主题选择性，前手性选择性和基团选择性。 3 ) 非水溶剂的选择原则 在所有含溶剂的生物催化体系中，溶剂的性质会在很大程度上影响酶的活性、选择 性和稳定性，其中起关键作用的足溶剂的极性。降低介质的介电常数将导致酶分子中电 残基之间静电作用力的增强。这可能会降低酶分子的柔性( f l e x i b i l i t y ) 进而降低酶催化的 6 第一章绪论 活力。 l 妒是经常用来描述溶剂对生物催化系统影响的一个衡量参数，其定义为一种物质 在标准的正辛醇水两相系统中的分配系数的常用对数值例。一些常见溶剂的1 妒见表 表1 1 一些常见溶剂酗j l g p t a b l e 1 1l g po fs o m eu s u a lo r g a n i cs o l v e n t 有关溶剂对生物催化剂影响的研究大多数是在水不溶性溶剂中进行的。l g p 值越大， 溶剂的极性就越低。在这类溶剂中，l g p 4 的非极性溶剂中酶催化活力较高；2 l g p 4 的 溶剂中酶具有中等催化活力；在l g p 2 的极性溶液中酶催化活性较低，若在某些应用中 不得不使用这类溶剂时，就必须在酶的稳定性与底物的溶解性之间进行权衡，此时，“混 合溶剂 系统或许是一种最佳的折中方案。 1 4 3 非水相生物催化反应体系类型 在非水介质中，由于酶处于一种与水极不相同的环境，不可避免地导致酶存在状态 与酶结构的改变，在水相中建立起来的酶反应动力学及反应机制都不能直接应用于非水 介质中。非水相反应生物催化体系主要包括： 1 ) 有机溶剂体系 脂肪酶和底物、有机溶剂直接混合反应。水解反应、酯化或转酯反应、醇解反应都 可在自由溶解的有机溶剂体系中进行。p h 值为6 6 7 6 ，温度范围为1 8 3 5 c ，高熔点 底物可在较高的温度如5 5 以上反应，酯化和甘油解反应底物配比均要控制甘油过量。 甘油解反应的水活度应控制在0 2 0 3 ，以维持酶的活性构象。 2 1 水一有机溶剂两相体系 有些有机溶剂不能与水互溶，与水构成两相体系。在这种两相体系中，酶与亲水性 底物在水相，憎水性底物在有机相。 通常在两相体系中，酶的操作稳定性比较好。改变两相体系的一些性质l l 女h p h 值， 可以改变酶的选择性。同时，由于产物和一种底物不溶于水，因而两相体系可以较好地 解决产物抑制和底物抑制的问题。水与有机溶剂的比例范围几乎可以从纯水到纯有机溶 7 江南人学硕士学位论文 剂。但是为了保持酶的活力通常需要保留一定的水分，只要水分足以在酶周围形成一层 水膜能维持酶活就够了。 3 ) 表面活性剂包埋体系 由表面活性剂包埋的脂肪酶催化的酯化反应比直接乳化体系产生了更高的反应速 率和单甘酯产率，同时，也增加了脂肪酶的稳定性。脂肪酶制剂的活性取决于表面活性 剂，最好的表面活性剂是非离子型的。表面活性剂有许多羟基，这些羟基与脂肪酶表面 氨基酸残基之间形成氢键，混合物中酶的含量取决于脂肪酶表面氨基酸残基的数量。 4 ) 超临界流体体系 超临界流体( s u p e r c r i t i c a lf l u i d s ) 是一种超过临界温度和临界压力的特殊物质，物理性 质介于液体和气体之间。如二氧化碳、氟里昂c f 3 h 、烷烃类( 甲烷、乙烯、丙烷) 或无机 化合物( s f 6 ，n 2 0 ) 等都可以作为酶催化亲脂性底物的溶剂，酶在这些溶剂中就像在亲酯 性有机溶剂中一样稳定。超临界流体作为酶反应中间介质，具有明显的特点和优点：( 1 ) 似液体的密度、似气体的扩散性和粘度，因此显示出较大的溶解能力和较高传递特性， 从而大大降低酶反应的传质阻力，提高酶反应速率；( 2 ) 反应底物的溶解性对超临界的操 作条件( 如温度、压力) 特别敏感，通过简单改变操作条件或附加其它设备，就可达到底 物和产物分离的目的；( 3 ) 无毒、不可燃、化学惰性、易于底物产物分离、价格便宜等。 而该体系的缺点是需要能有耐受几十个兆帕的高压容器，并且在减压时易使酶失活。总 的来说，该体系在工业上，尤其是在食品与发酵行业上的应用，具有广阔的发展前景【2 9 1 。 5 ) 反胶束体系 反胶束体系( r e v e r s em i c e l l e ) 是表面活性剂与少量水存在的有机溶剂体系【3 0 】。表面活 性剂是由疏水性尾部和亲水性头部两部分组成，在含水有机溶剂中，它们的疏水性基团 与有机溶剂接触，而亲水性头部形成极性内核，从而组成一个反相胶束，水分子聚集在 反相胶束内核中形成“小水池 ，里面容纳了酶分子，这样酶被限制在含水微环境中， 而底物和产物可以自由进出胶束。由于反胶束体系能够较好的模拟酶的天然环境，因而 大多数酶在该体系中能保持活性和稳定性，甚至表现出“超活性 。反相胶束中的酶催 化反应一般可用于油脂水解、辅酶再生、消旋体拆分、肽和氨基酸合成及高分子材料合 成3 1 。5 1 。 6 ) 无溶剂体系 无溶剂体系是指反应体系中没有附加的溶剂，只含有反应物和酶。其具有突出的优 点：可避免有机溶剂引起的毒性及易燃问题，这对于食品、化妆品、药物的生产尤为重 要；增大底物浓度；减少反应体积，提高了产物浓度；最终产物易于分离纯化。 无溶剂体系中包含底物的液相和含有酶的固相，因此反应速度受到内、外传质的限 制。而且固定化酶的载体也会影响传质过程，同时反应体系粘度大，底物浓度大，也会 影响传质过程，从而降低产物得率。 8 第一章绪论 1 5 本课题的立题依据和研究内容 1 5 1 本课题的立题依据 食品防腐剂是最重要的食品添加剂之一，几乎所有的食品都要添加防腐剂，以延长 食品的保质期。如果没有防腐剂，由于腐败而导致的食品损失将不可估量。可以这么说， 没有防腐剂就没有今天的食品工业。但是，由于使用的不规范，通常使用的化学合成防 腐剂在过量使用时可能对人体健康不利。因此，更安全、更高效的食品防腐剂一直是食 品工作者不懈追求的目标。 回归自然，崇尚绿色，这是当今食品工业的一大潮流。相应的，食品防腐剂也努力 向天然方向发展，即天然食品防腐剂。然而，目前天然防腐剂有两大致命弱点。首先， 具有高效防腐作用的天然物质在数量上有限，自然界中的再生周期长，人工提取和制造 工艺复杂，技术投资规模大，产品得率低，价格昂贵，这就大大限制了生产商对这类产 品的生产和使用。其次，天然防腐剂的抗菌谱一般较窄，客观上使其应用领域受到了限 制【3 酬。所以，对天然防腐剂进行广泛研究的同时，找到高效、广谱、安全性高并且具有 良好应用前景的防腐剂，是当前急需解决的课题。而据报道酯类是食品的三大营养物质 之一的脂肪的中间代谢物，在体内没有代谢不良的蓄积性和特异性反应，是安全性高的 无毒、高效、广谱、实用的新型防腐剂。单甘酯在日本的食品卫生法中规定不受用途和 添加量的限制【j 。 单甘酯己成为我国食品乳化剂中的一个重要产品，单甘酯的合成方法也为大家所关 注。目前，工业上生产单甘酯通常采用无机催化剂、2 2 0 以上高温，以油脂醇解或脂 肪酸与甘油酯合成两种工艺，含量在3 0 4 0 左右。要得到高纯度( 9 0 以上) 的单甘酯 采用分子蒸馏方法，设备投入及生产成本高。 进入九十年代以后，国际上对脂肪酶催化合成单甘酯的研究逐渐成为非水相酶催化 的一个热点【3 8 1 。国内外在脂肪酶催化酯的合成领域，已经对酶的合成机制、酶的选择性 酯化、水分含量及有机溶剂对反应的影响、工艺条件的优化以及各类反应体系等各个方 面都有了一定的研究，同时建立了对脂肪酶催化合成酯反应的平衡转化率和产物水分对 反应平衡的影响的数学模式，为我们更好的控制反应过程提供了理论基础。 相对于无机催化剂，脂肪酶作为一种高效的生物催化剂，不仅具有高立体选择性和 区域专一性，可合成化学法难以合成的光学纯活性物质，而且其催化反应类似于生物体 代谢，改变了化学法在高温2 2 0 * c 下以碱为催化剂、需n 2 保护的强烈的反应条件。酶法 合成反应条件温和、能耗低，减少了设备投资，提高了产率，是一个有应用前景的新的 酶化工合成方法。 9 江南人学硕士学位论文 1 5 2 本课题的研究内容 1 ) 筛选不同的脂肪酶在无溶剂条件下对催化辛酸、甘油酯化合成单辛酸甘油酯效 果的影响，确定较优的酶种，并优化该酶催化合成单辛酸甘油酯的反应条件。 2 ) 分离纯化并鉴定酶法合成单辛酸甘油酯的粗产物。 3 ) 单辛酸甘油酯作为非离子表面活性剂的性质评价。 4 ) 单辛酸甘油酯作为防腐剂的性能测试。 1 0 第二章无溶剂条件下酶催化辛酸 油合成甲酯的研究 第二章无溶剂条件下酶催化辛酸甘油合成单酯的研究 2 1 前言 目前脂肪酸单甘油酯的合成方法主要有化学法和酶法：化学法包括直接酯化法、甘 油解法、缩水甘油法、环氧氯丙烷法、化学基团保护法及p 位保护法等1 3 w ；酶法常见的 有有溶剂体系4 0 1 、反向胶束体系h 1 1 、超临界体系【4 2 1 、无溶剂体系【4 3 】等。无溶剂体系因 成本低、杂质含量少及产物产量高而优于其他酶法合成方法。本章研究在无溶剂条件下 不同脂肪酶对直接催化甘油和辛酸酯化合成单辛酸甘油酯的效果影响，筛选合适的酶 种，并且优化该酶催化合成单辛酸甘油酯的反应条件。 2 2 材料与仪器 2 2 1 实验材料 诺维4 3 5 脂肪酶( n o v 0 4 3 5 ) l i p a s ea y a m a n o 30 l i p a s eg a m s n o 5 0 l i p a s ea a m s n o 6 c a n d i d al i p o l y t i c a ( c 1 1 ) 甘油( a r ) 辛酸( c p ) 无水乙醚( a r ) 无水乙醇( a r ) 氢氧化钠( a r ) 硫代硫酸钠( a r ) 高碘酸( a r ) n a o h ( a r ) 氯仿( a r ) 丙酮( a r ) 2 2 2 实验仪器 8 s 一1 型电动搅拌器 5 0 1 型超级恒温水浴锅 分析天平 分液漏斗 酶反应器 n o v o 公司【4 4 】 天野公司 天野公司 天野公司 无锡酶制剂厂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 中国医药集团上海公司 中国医药集团上海公司 中国医药集团上海公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂 上海实验仪器厂 梅特勒一托利多( 上海) 江南大学硕士学位论文 2 3 实验方法 2 3 1 酶催化酯化反应 称取约o 1 5 m o l 重量的辛酸，加入一定量的甘油( 由甘油辛酸的摩尔比来定) 于 l o o m l 的酶反应器中，再加入所需的水，在一定温度下搅拌半小时左右，至反应物混匀 时加入一定量的酶，反应温度由超级恒温水浴锅来控制，继续反应一定时问。 2 3 2 辛酸转化率的