培美曲塞二钠的质量研究.pdf

i 摘 要 培美曲塞二钠是一种新型的多靶位抗叶酸剂， 作用靶点包括嘧啶和嘌呤合成 中的多种酶，在非小细胞肺癌(nsclc)、恶性胸膜间皮瘤、乳腺癌、直肠癌、子 宫颈癌、头颈癌和膀胱癌等多种肿瘤中表现出较好的抗癌活性。 本文结合培美曲塞二钠的结构特点和生产工艺，设计实验，制订出合理的质 量标准。对性状、鉴别、检查、含量测定、稳定性等项目进行研究。通过实验， 建立等度洗脱 hplc 法和手性流动相 hplc 法，分别用于培美曲塞二钠有关物 质、含量和 d-异构体的测定，并运用气相色谱法对溶剂残留进行重点考察。按 照 ich 指导原则的要求，对上述方法进行了完整的方法学研究和方法验证。 采用 hplc 法对培美曲塞二钠进行有关物质检查和含量测定时，以 c18 柱 为分析柱， 0.05mol/l磷酸钠水溶液(ph3.0)- 乙腈(85:15, v/v)为流动相， 于 227nm 处检测。所建立的方法具有良好的专属性，在一定范围内线性良好。培美 曲塞二钠 d-异构体的检查则采用手性流动相 hplc 法，以 0.05mol/l 醋酸 铵溶液(ph7.0)-乙腈(95:5, v/v)，加入 3.0g/l 手性添加剂-环糊精作为流动 相，分离度达到 2.0 以上。利用气相色谱法测定了培美曲塞二钠原料中的 溶剂残留，检测结果合格。 通过对培美曲塞二钠原料长期稳定性考察来确定本品的贮藏条件和 有效期。本品属对温度、湿度不稳定化合物，建议本品在凉暗、干燥条件 下贮藏。 本研究工作建立了产品的有效成分及杂质的定量、定性检测方法。方 法简便、准确、专属性强、重现性好。所建立的标准能反映药品的内在质 量、生产工艺水平和检验手段，为培美曲塞二钠的生产和质量控制提供了 有效的分析方法和判断标准。 关键词关键词 培美曲塞二钠 抗叶酸剂 杂质 质量标准 i abstract pemetrexed disodium is a novel antifolate antimetabolite with multiple enzyme targets involved in both pyrimidine synthesis and purine synthesis. it has shown encouraging activity in a wide range of tumors, including non-small cell lung carcinoma (nsclc), malignant mesothelioma, and carcinomas of the breast, colorectum, uterine cervix, head and neck, and bladder. according to material production-techniques and structure characteristic, scientific experiments had been done to establish the quality standard of pemetrexed disodium. the study was emphasized on character, identification, examination, contents determination and stability. specifically, the research focused on studies of measuring methodologies of related substances, resolution of d-enantiomers from pemetrexed disodium , contents of the drug and the limit of residual solvent. in this paper, hplc methods were described and developed to quantitatively determine pemetrexed disodium assay and separate the enantiomers of pemetrexed disodium with chiral mobile phase additives. a gc method was established to determinate the residual solvent. above methods were validated based on the ich guideline and the results shown the good specificity, accuracy, precision, repeatability and rubstiness. the method was established for determination the related substances and contents of pemetrexed disodium. the mobile phase was 0.05mol/l sodium phosphate(ph3.0) acetonitril (85:15, v/v) and the wavelength was 227nm. the calibration curve was linear within certain concentration range. the hplc method which was established for determination of d-enantiomer of pemetrexed disodium used an c18 column with-cyclodextrin as the chiral mobile phase additive, 0.05mol/l ammonium acetate (ph7.0)- acetonitril (95:5, v/v) as mobile phase. two enantiomers could be separated well with resolution better than 2.0. the limit of residual solvent in pemetrexed disodium drug had been tested, and the drug was qualified. ii this paper studied the stability of raw drugs. it was convenient for determination the condition of store. the result indicated the drugs should be stored at dryness, darkness and low-temperature. the study established the methods which were simple, accurate, exclusive and with good reproducibility, for analyzing effective component and impurity. the standards can reflect drugs quality, production-techniques and test means, which providing efficient analysis methods and estimation standards for production as well as quality control. keywords pemetrexed disodium；antifolate；impurity；quality standard 硕士学位论文 1 第一章 文献综述 1.1 课题的研究背景课题的研究背景 肿瘤为仅次于心脑血管疾病的第二大死因， 是目前威胁人类生命的最主要的 疾病之一。据世界卫生组织统计，2005 年全球有 760 万人死于癌症，超过总死 亡人数的 12，其中近 60以上死于肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠直肠癌、口腔 癌、肝癌和宫颈癌。近年来，随着生态环境的恶化及激素的大量使用，癌症发病 率更呈上升趋势。 当今世界肿瘤的治疗仍以化疗为主，近年来随着对肿瘤特性的研究，世界各 国亦涌现出大量新抗肿瘤药物。开发抗癌药物，尤其能治疗发病率高的胃癌、肝 癌、肺癌、食道癌的广谱抗癌药，无疑具有良好社会和经济效益。 此外，相当一部分罕见肿瘤，如原发性肺肉瘤、恶性间皮瘤、舌纤维瘤、胸 椎脊索瘤等，仍然是肿瘤史上的疑难症、少见症，缺乏有效的治疗药物和治疗方 法。因此对于罕见肿瘤治疗药物的开发具有很重大的现实意义和研究价值。 1.1.1 肺癌的研究现状 在过去的二十多年中，肺癌的发病率持续上升，很多欧美国家肺癌发病率已 占所有恶性肿瘤的首位，现已成为世界许多国家和地区癌症死亡的主要原因。 根据世界卫生组织国际癌症研究中心（iarc/who）统计，2002 年全球肺 癌的男性发病率为 35.5/10 万， 发病 97 万人， 死亡率为 31.2/10 万， 死亡 85 万人； 女性发病率为 12.1/10 万，发病 39 万人，死亡率为 10.3/10 万，死亡 33 万人。肺 癌总发病数占全部恶性肿瘤发病的 20.0。自 2000 年至 2005 年，我国的肺癌死 亡人数增加 10.1 万（自 2000 年的 32.7 万增至 2005 年的 42.8 万，增加 30.9， 其中男性肺癌死亡增加 6.1 万，女性为 4.0 万） ，肺癌发病人数增加 11.6 万（自 2000 年的 38.1 万增至 2005 年的 49.7 万，增加 30.4，其中男性肺癌发病人数 增加 7.0 万，女性 4.6 万） 。中国各大城市的肺癌平均死亡率在逐渐增长中。在上 海、广州、西安等城市中，肺癌已居各种死因的第一位。 临床上 80%的肺癌为非小细胞肺癌(nsclc)，根据美国癌症协会的统计数 据，美国每年大约新增 174000 例 nsclc 患者。其中 65%以上确诊时已属、 期。除部分期 nsclc 可经诱导治疗后手术切除，大部分需要采用化疗1。 晚期非小细胞肺癌的治疗仍具挑战性， 外科手术仅可以治愈大约 30%的局限 第一章 文献综述 2 期病变。因此对非小细胞肺癌化疗药物的研究具有很重要的现实意义。 nsclc 的化疗对晚期患者作用的争议，国际上有 8 个随机对照研究 2-9，对 支持治疗和化疗加支持治疗在晚期 nsclc 治疗的效果进行了比较，治疗效果以 化疗加支持治疗组为优，证明化疗能延长 nsclc 患者生存期。2003 年美国临床 肿瘤协会(asco)年会也认为化疗能延长晚期 nsclc 患者的生存期， 且含铂方案 不影响患者的生活质量10。 目前 nsclc 的化疗迄今仍以含铂方案为主。stephens 等11报道了 725 例 nsclc 的研究结果，认为含铂方案的效果较未用化疗组好。含铂方案以顺铂应 用较早，然而它的肠胃道反应、肾毒性较大；卡铂的胃肠道反应低，因此也常被 采用，但能否替代顺铂仍无定论。zatlouka 等12和伦敦肺癌组13随机对照研究显 示两者在 nsclc 治疗中疗效相同，但卡铂血小板毒性大，而顺铂引起恶心、呕 吐的较多。 对联合用药的研究认为 2 种药物联合化疗的效果优于单个药物， 且 2 种药物 联合方案优于 3 种药物联合方案。 nsclc 的二线化疗倾向于采用单药，理由是有效而且毒性较低。 在非小细胞肺癌移植肿瘤中， 培美曲塞二钠与铂类化合物联合如顺铂或者奥 沙利铂比培美曲塞二钠和环磷酰胺、吉西他滨、多柔比星联合产生的附加作用更 为明显，而且和放疗相结合能起到增敏作用14。 1.1.2 恶性胸膜间皮瘤的研究现状 恶性胸膜间皮瘤(mpm)是一种少见的肿瘤，发生于浆膜的间皮细胞，最常累 及胸膜或腹膜，单纯的腹膜间皮瘤比较少见。间皮瘤有良、恶性之分。恶性中也 有局限、弥散之分。在美国，每年大约有 2000 个新病例被诊断出来，但近年来 其发病率有明显上升的趋势。通过流行病学调查、大量的动物实验和体外培养细 胞的诱导转化实验证明，间皮瘤的发生通常与接触石棉的历史具有极强的相关 性。 据国际癌症研究机构(iacr)公布的数据显示， 长期的职业接触可明显诱发间 皮瘤及其它肺部肿瘤。进入肺部的石棉纤维粘附于外侧的肺衬和胸壁，引起肿瘤 生长。当症状出现时，疾病通常已经晚期，70的病患已不能选择手术，患者经 诊断后平均只能存活 9-13 个月。 间皮瘤细胞对化疗药物有抗性，对肿瘤坏死因子等细胞毒素也不敏感，仅对 硕士学位论文 3 干扰素有一定的敏感性，这给治疗带来了困难。 到目前为止对治疗间皮瘤尚无其他有效的疗法。而培美曲塞二钠期试验数 据显示，培美曲塞二钠对大多数恶性胸膜间皮瘤的患者的治疗具有临床效果，故 而为治疗这种致命的肿瘤提供了新的希望。 1.2 药物简介药物简介 培美曲塞二钠通用名为 pemetrexed disodium，化学名为 n-4-2-(2-amino- 4,7dihydro-4-oxo-1h-pyrrolo2,3-dpyrimidin-5-yl)ethylbenzoyl-l- glutamic acid, disodium salt, 2.5 hydrate(n-4-2-(2-氨基-4,7-二氢-4-氧代-1h-吡咯2,3-d嘧啶-5- 基)乙基苯甲酰-l-谷氨酸二钠盐 2.5 水合物)。 培美曲塞二钠结构如图 1-1。 n n h n h o h2n 2.5h2o o hn coona coona 图 1-1 培美曲塞二钠结构式 fig1-1 structure of pemetrexed disodium 1.2.1 国内外研究现状 培美曲塞二钠为抗代谢抗肿瘤药物，为胸苷酸合成酶(ts)、二氢叶酸还原酶 (dhfr)和苷氨酰胺核苷酸转甲酰酶(garft)抑制剂，最先由美国印第安纳州 eli lilly(礼莱)公司研制，商品名 alimta。 2004 年 2 月被美国食品和药品管理局(fda)批准上市， 与顺铂联合用于恶性 胸膜间皮瘤一线治疗15。 2004 年 6 月在欧洲获准用于间皮瘤和非小细胞肺癌双重适应证。 2004 年 8 月，又获 fda 批准用于非小细胞肺癌(nsclc)的二线治疗。 目前培美曲塞二钠已经成为国内研究热点。 1.2.2 用于 nsclc 二线治疗 2004 年 8 月 19 日，礼莱公司宣布，fda 批准抗癌药物培美曲塞二钠作为局 部晚期或者转移性 nsclc 的二线用药。培美曲塞二钠作为 nsclc 化疗二线用 第一章 文献综述 4 药，采用单药，理由是有效而且毒性较低。 在培美曲塞二钠获批之前，多西紫杉醇(txt)是唯一一个被fda批准的治疗 非小细胞肺癌的二线药物。和支持性治疗相比，txt能够使患者生存期平均延长 数月，但是该药会引起严重毒副作用，包括中性粒细胞减少症、因白细胞数量下 降引起的发热和腹泻，以及脱发等。2003年hanna等16报道了新药培美曲塞二钠 治疗nsclc的结果，并与单用txt的相比，结果显示两者疗效相同，培美曲塞 二钠毒性较低。 培美曲塞二钠对多种细胞株有效17，包括ccrf2cem白血病、gc3pc1结肠 癌和hcf8回盲肠癌。且本品对高表达ts(对5-fu和雷替曲塞耐药)的mcftdx和 h630rio细胞株也有效，表明本品有望用于对5-fu或雷替曲塞等耐药肿瘤的治 疗。teicher 等18研究发现，培美曲塞二钠与5-fu可产生协同作用，组成的培美 曲塞二钠+ 5-fu方案比5-fu + mtx方案有更好的抗癌疗效。同样与吉西他滨、 铂剂、长春瑞滨(nvb)、紫杉醇或ctx联用疗效也有相加或协同作用；在分次放 疗前给予培美曲塞二钠可使疗效增加23倍19。 1.2.3 用于恶性胸膜间皮瘤(mpm)的一线治疗 培美曲塞二钠的有效性在随机临床试验中得到确定。试验比较了联用培美 曲塞二钠和顺铂的治疗组与只用顺铂的治疗组的效果。 研究结果显示与顺铂联合 化疗组的中位生存期为 12.1 月，而顺铂组的中位生存期为 9.3 月，统计学差异显 著。这是首个证实化疗可确实延长恶性胸膜间皮瘤患者生存的药物。这一结果促 使 fda 加快批准培美曲塞二钠进入临床并上市。 wang20等研究发现在人恶性间 皮瘤细胞系中存在着一种特异性高亲和力的载体， 这种载体的存在可能能够说明 培美曲塞二钠在 mpm 治疗中的作用。 培美曲塞二钠必须与维生素 b12及叶酸补充剂一起给药，以降低副作用的发 生率和严重程度。培美曲塞二钠的常见副作用是血液毒性，以中性粒细胞减少为 著，常为剂量限制性毒性。另外，低白血球数、恶心、呕吐、疲乏、出疹和腹泻 也为多发的不良反应，其他不良反应还有肝肾功能异常、呕吐、便秘、胸痛等。 这些症状可能是由该药物引起的骨髓抑制造成的感染的症兆。 1.2.4 作用机理 培美曲塞二钠是一种新型的吡咯并嘧啶结构的抑制叶酸代谢的新型特效药 硕士学位论文 5 物，是能同时抑制胸腺脱氧核苷酸合成酶(ts)、二氢叶酸还原酶(dhfr)和甘氨 酰胺核苷酸转甲酰基酶(garft)的多靶点的叶酸抑制剂。 通过干扰叶酸依赖的代 谢途径从本质上抑制细胞复制，发挥其抗肿瘤活性。培美曲塞二钠通过还原的叶 酸运载体(rfc)和叶酸运载膜蛋白(fpb)运输系统被带入细胞内。一旦进入细胞 中， 培美曲塞二钠很快被叶酸聚谷氨酸化合成酶(fpgs)催化形成聚谷氨酸物。 未 聚谷氨酸化和聚谷氨酸化的培美曲塞二钠都可以作为竞争性抑制剂， 对几种叶酸 依赖的酶产生作用，包括核苷酸生物再合成过程中的数种关键酶。这些功效类似 于对 ts、dhfr 具有抑制作用的氨甲蝶呤。培美曲塞二钠以及其聚谷氨酸化合 物与一些叶酸合成所需酶形成竞争性抑制，这些酶均涉及胸腺嘧啶，嘌呤核苷酸 的生物合成途径。正是因为培美曲塞二钠对酶抑制的多靶点性，使得它抑瘤活性 更强，不易产生耐药性21。 1.2.5 药代动力学 静脉和腹膜给药的实验表明培美曲塞二钠人体的药代动力学与小鼠类似。 在 分别对小鼠、犬和人单独静脉给药中，药物的血浆浓度下降很快。在所有的动物 实验中，auc 值的增加与所给剂量有关。在培美曲塞二钠人体细胞色素 p450 cyp3a、cyp2d6、cypp2c9 和 cyp1a2 交互作用试验中，当药物在血浆中浓 度达到 1000m 时，不会诱导 cyp2d6，但会抑制人体肝细胞中的 cypp2c9 和 cyp1a2 活性。 放射性元素跟踪测定，14c培美曲塞二钠给药 5 分钟后在肝部出现最大药 物浓度。 人和犬体内药物消除半衰期比小鼠短。在静脉给药的同位素跟踪过程中，碳 的放射性同位元素很快被代谢，在组织中的水平也仅维持了 3 小时。 自动放射性照相术显示对小鼠单独剂型静脉给药 20 mg/kg 后给药的一个小 时内，高浓度的放射活性聚集在肾脏、膀胱、肝和胆囊中，这说明尿排泄和胆汁 排泄也很快速。在给药 24 小时和 48 小时，放射性活性除了在肾和肝中，在其他 组织中检测不到。 在小鼠和犬的动物实验中， 药物的消除途径主要是经肾脏消除， 大多数药物未被转化，直接排出体外。 另外与乙酰水杨酸和布洛芬联用不影响培美曲塞二钠的药代动力学。 1.2.6 培美曲塞二钠毒理学 第一章 文献综述 6 对小鼠 2 周和 6 周(腹腔注射)一次性给药和反复给药进行研究及犬 4 周和 6 周(静脉注射)一次性给药和重复给药进行研究。一次性给药研究中，培美曲塞二 钠对小鼠和大鼠均表现出有限的急毒，但对狗则表现出较大的毒性。6 周的反复 给药研究被用以指导确定日常用药剂量。 每周两次或每周一次小鼠腹腔给药的剂 量和犬静脉注射的剂量研究中，小鼠每周腹腔给药可以承受剂量高至 944 mg/m2(近似临床剂量的两倍)而不致死或临床产生毒性，相反，每周静脉注射剂 量 2099 mg/m2(近似临床剂量的四倍)却导致数只实验犬在用药后不久死亡。更高 剂量反复给药的副作用引起实验犬的食欲下降、呕吐、腹泻、粘膜炎、红细胞密 度下降、白血球减少、嗜中性白血球减少和转氨酶的增加。对小鼠，体重下降和 白细胞减少是药物引起毒性的主要指标。毒性组织病理学的指标一般发生于胸 腺、淋巴、gi tract(生殖道)、肠道(肠病和粘膜炎)、睾丸(萎缩和/或退化)、骨髓 和皮肤。临床上，皮疹、恶心、腹泻、乏力、白细胞减少及嗜中性粒细胞减少是 与剂量相关的。剂量超过 0.3mg/m 2会引起睾丸萎缩和生殖能力下降。此外，施 药达到 0.6 mg/m2时，培美曲塞二钠对小鼠具有胚胎毒性和和致畸作用。 1.2.7 临床研究 培美曲塞二钠期临床针对实体肿瘤，研究单药和联合用药途径、剂量限制 性毒性和限制给药剂量，最终给出期临床给药剂量和给药方式。联合用药的 期临床研究对培美曲塞二钠联合其他化疗药物的研究进行了多种配伍的尝试， 包 括顺铂、卡铂、奥沙利铂等铂类，还有紫杉醇、多西紫杉醇、吉西他滨、长春瑞 滨等多种药物，其中研究比较多的是铂类和吉西他滨，在同一天给药，推荐期 的剂量为培美曲塞二钠 500 mg/m2，顺铂 75 mg/m2 22；培美曲塞二钠为 500 mg/m2， 草酸铂 120 mg/m2 23； 推荐期的给药方法为第 1、 8 天吉西他滨给药 1000 mg/m2，培美曲塞二钠 500 mg/m2在第 8 天吉西他滨后输注24。 期临床以单药或联合用药的形式分别针对不同的实体瘤进行研究。 结果显 示，培美曲塞二钠单药对常见肿瘤缓解率约为 5 %28 %，其中胰腺癌偏低，为 5.7 %，乳腺癌和头颈部肿瘤单药缓解率接近 30 %，对 nsclc 单药缓解率在 9 %16%，与其他化疗药联合使用的缓解率则为 37 %46 %。 培美曲塞二钠的期临床实验主要针对 mpm 和 nsclc。在 mpm 病人中 培美曲塞二钠和顺铂联合组与顺铂单药组比较初治 mpm 的疗效25。 为减轻培美 硕士学位论文 7 曲塞二钠的不良反应，对部分入选病人补充叶酸和维生素 b12，培美曲塞二钠联 合用药治疗间皮瘤的缓解率达到 41.3 %。 最大规模的关于二线肺癌临床治疗的 期研究， 则直接对培美曲塞二钠和多西紫杉醇进行了比较26， 结果发现两者疗效 相似，而培美曲塞二钠的副作用明显要轻。 1.3 培美曲塞二钠的质量研究培美曲塞二钠的质量研究 培美曲塞二钠以两种结晶水的形式存在，七水合物和2.5水合物。lilly公司 已在中国申请七水合物的专利保护。从回避专利的角度，本论文制备了2.5水合 物。本文考察其各项理化指标和稳定性，在此基础上制订质量标准，严格控制产 品质量。 制订质量标准时， 根据培美曲塞二钠原料的化学结构和理化性质， 设计鉴别、 检查和含量测定方法，并对鉴别试验的专属性和灵敏度，以及含量测定方法的精 密度和准确度进行验证。根据工艺、稳定性、分解产物等拟出控制可能引入杂质 或降解产物的项目，进行实验，摸清限量。其中对可能引入杂质或降解产物的控 制是最为至关重要的一项。 本论文所测的培美曲塞二钠样品的合成工艺27-31以对溴苯甲酸为起始原料， 经多步反应得到产物培美曲塞二钠，路线如下： br cooh br cooch3cooch3cooch3 cho so3na oh ch3oh oh nahso3 i ii iii iv cooch3 cho br n n h n h h2n o cooch3 naoh (ch3)3sibr hn nh2nnh2 o v vi 第一章 文献综述 8 n n h n h h2n o cooh n n h n h h2n o conh cooc2h5 cooc2h5 so3h l-glu so3h vii viii n n h n h h2n o conh coona coona naoh pemetrexed disodium ：4-2-(2-氨基-4,7-二氢-4-氧代-1h-吡咯2,3-d嘧啶-5-烃基)乙基苯甲酸 ：n-4-2-(2-氨基-4,7-二氢-4-氧代-1h-吡咯2,3-d嘧啶-5-烃基)乙基苯甲酰-l- 谷氨酸二乙酯对甲苯磺酸盐 其中、等在合成过程中可能会被带入最后的成品中，在质量研究中将把 它们作为重点杂质加以研究。 针对不同的杂质性质，本文从药品本身的理化性质、结构特点出发，在各种 不同条件下可能产生的杂质进行分离检测，以得出最佳的质量控制方案。 1.4 本课题的内容和意义本课题的内容和意义 药物的质量研究与质量标准的制订是药物研发的重要内容之一。 药物从研制 开始，结构和组成一旦确定，就以药典等32-34权威性指导为基础开始建立科学性 强且能有效控制药物性状、真伪、有效性、均一性、纯度、安全性和有效成分含 量的综合质量裁定依据及药品质量标准。并不断地修订和完善，以控制药物的质 量，保证其在有效期内安全有效。 药物质量标准的建立主要包括以下过程：确定质量研究的内容，进行方法学 研究，确定质量标准的项目及限度，制订及修订质量标准。以上过程密切相关， 相互支持。药物的质量研究是质量标准制订的基础，质量研究的内容应尽可能全 面，既要考虑一般性要求，又要有针对性。确定质量研究的内容，应根据所研制 产品的特性，采用的制备工艺，并结合稳定性研究结果，以使质量研究的内容能 充分地反映产品的特性及质量变化的情况。 药品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适用于相应检测要求。 在起草药品质量标准时，分析方法需经验证。需验证的分析项目包括鉴别试验、 硕士学位论文 9 杂质定量检查或限度检查、 原料药或制剂中有效成分含量测定等。 验证内容包括： 准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。 本文结合培美曲塞二钠原料的合成工艺，结合自身结构特点，设计下述项目 进行质量研究： 1性状(包括外观，溶解度和比旋度等物理常数)； 2鉴别试验(钠盐的鉴别，高效液相色谱法保留时间比照法)； 3检查(比浊法检查溶液的澄清度，目视比色法和分光光度法检查溶液的颜 色， 络合比色法测定了氯含量， 高效液相色谱法检查有关物质， 手性添加剂 hplc 法测定旋光异构体，气相色谱法测定了溶剂残留量，水分测定仪测定水分、目视 比色法测定样品的重金属)； 4含量测定(高效液相色谱法测定培美曲塞二钠有效成分的含量)。 重点研究了紫外-可见分光光度计法、高效液相色谱法、气相色谱法用于本 品有效成分及杂质的定量、定性分析，对原料中 d-异构体的检测。并对具体质 量分析方法的准确度、精确度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性 进行了验证。在此基础上制订出药物的质量标准，用以控制产品质量。本文在中 国药典 2000 版指导下进行了药物的质量研究工作， 并在中国药典 2005 版指导下 修正了培美曲塞二钠的质量标准。 第二章 培美曲塞二钠的结构确证 10 第二章 培美曲塞二钠的结构确证 2.1 样品精制方法样品精制方法 将培美曲塞二钠样品 24g， 加入去离子水 200ml， 用 2mol/l 盐酸调节 ph 至 3，有大量白色固体析出，过滤，用大量去离子水洗涤固体，固体抽干。将所得 固体加水 100ml，搅拌下滴加 1mol/l 氢氧化钠溶液，控制滴加量使固体恰好全 溶，此时 ph 约为 8.0，加入 600ml 乙醇，有极少量黄绿色乳状物生成，过滤， 并用乙醇洗涤滤饼，去除极少量绿色杂质，滤液再加入 450ml 乙醇，析出大量 白色固体，冷却过夜，有大量白色晶体析出，过滤，抽干，得到白色固体，在室 温下五氧化二磷真空干燥 30h，得培美曲塞二钠 2.5 水合物，重 18.2g，收率 75.8 。 2.2 结构确证结构确证 2.2.1 元素分析 2.2.1.1 测试仪器：foss heraeus 240 cnh rapid； 测试单位：南京大学现代分析中心； 元素分析数据见表 2-1。 表 2-1 培美曲塞二钠元素分析检测结果 table2-1 elementary analysis results of pemetrexed disodium 元素 c h n na 检测值 1() 46.47 4.71 13.63 8.91 检测值 2(%) 46.53 4.62 13.51 8.92 平均值 46.50 4.67 13.57 8.92 理论值 46.52 4.68 13.56 8.90 2.2.1.2 解析 元素分析结果显示，本品的元素组成符合 2.5 水合培美曲塞二钠 c20h19n5na2o62.5h2o 的分子组成，实验值与理论值误差均在 0.3 %范围内， 说明本品系 2.5 水合培美曲塞二钠，不含其它结晶溶媒。 2.2.2 红外吸收光谱 2.2.2.1 测试仪器：nexus 870 ft-ir 红外光谱仪； 测试条件：kbr 压片； 仪器校正及检查：参照中国药典 2000 版二部附录 iv c 进行； 硕士学位论文 11 样品制备方法：参照卫生部药典会编的药品红外光谱集所述进行； 测试单位：南京大学现代分析中心； 样品红外吸收光谱图见图 2-1，数据见表 2-2。 图 2-1 培美曲塞二钠红外光谱图 fig2-1 ir spectrum of pemetrexed disodium 表 2-2 培美曲塞二钠的红外特征吸收 table2-2 ir spectrum data of pemetrexed disodium 吸收峰(cm-1) 基团 强度 振动类型 3459,3343 oh,nh2,conh 强 n-h, o-h 3343 吡咯的 n-h 强 n-h 3050 ar-h 中强 c-h 2917,2820 -ch2- 弱 c-c 1677 -conh 强 c=o 1623 芳伯胺 强 n-h 1603 羧酸根 强 coo 1569,1531 吡咯环 强、中强 吡咯 1506,1443 苯环 强、中强 苯 1401 -ch2- 强 c-h 第二章 培美曲塞二钠的结构确证 12 1355 ar-nh2 中强 c-n 840,785 芳环上的=c-h 中强 c-h(面外) 749 -ch2-ch2- 中 c-c 719 吡咯环上的=c-h 中强 c-h(面外) 2.2.2.2 解析 由于分子结构中含结晶水，其 o-h 伸缩振动在 2500-3700cm-1范围内呈现一 个宽吸收带，其中 3459cm-1、3343cm-1强吸收，可能为芳伯胺的 n-h 的不对称 和对称伸缩振动吸收；此外仲酰胺的 n-h 伸缩振动吸收也在此处；1623cm-1强 吸收， 为芳伯胺的 n-h 面内变形振动吸收； 1355 cm-1中强吸收， 为芳伯胺的 c-n 伸缩振动吸收；1677cm-1强吸收，为仲酰胺的 c=o 伸缩振动吸收；1569cm-1强 吸收，为仲酰胺的 n-h 面内弯曲振动吸收，这些特征吸收预示分子结构中可能 有芳伯胺、仲酰胺基基团和结晶水存在。 3343cm-1强吸收， 也可能为吡咯的 n-h 伸缩振动吸收； 1531cm-1、 1506 cm-1、 1416 cm-1强吸收，为吡咯环的伸缩振动吸收；677cm-1中强吸收，为吡咯的=c-h 面外弯曲振动吸收，说明分子结构中可能有吡咯环结构基团存在。 2917cm-1、2820cm-1中强吸收，分别为亚甲基的 c-h 不对称伸缩振动吸收和 对称伸缩振动吸收； 1401 cm-1强吸收为亚甲基 c-h 剪式振动； 749cm-1中强吸收， 为亚甲基的 c-h 平面摇摆振动吸收，说明分子结构中可能有亚甲基存在。 3021cm-1中强吸收，为芳环的 c-h 伸缩振动吸收峰，840cm-1、785cm-1中 强吸收，为对二取代苯环上=c-h 面外弯曲振动吸收，说明分子结构中可能有对 二取代苯结构基团存在。 1603cm-1、1443cm-1强吸收，分别为羧酸根的不对称伸缩振动吸收和对称伸 缩振动吸收，预示分子结构中可能有羧酸盐结构存在。 综上所述， 样品红外光谱结果显示样品分子结构中可能有芳伯胺、 仲酰胺基、 吡咯环、 对二取代苯、 亚甲基和羧酸盐等结构基团存在， 另外可能有结晶水存在， 这与文献报道的培美曲塞二钠的结构吻合。 2.2.3 紫外吸收光谱 2.2.3.1 测试仪器：shimadzu uv2401 紫外-可见分光光度计； 测定条件：甲醇，水，0.1mol/l naoh 溶液； 硕士学位论文 13 见图 2-2，2-3，2-4，数据见表 2-3。 图 2-2 甲醇中的紫外吸收图谱 图 2-3 水中的紫外吸收图谱 fig2-2 uv spectrum in methanol fig2-3 uv spectrum in water 图 2-4 0.1mol/l 氢氧化钠溶液中的紫外吸收图谱 fig2-4 uv spectrum in sodium hydroxide solution (0.1mol/l) 表 2-3 培美曲塞二钠的紫外吸收光谱 table 2-3 uv spectrum data of pemetrexed disodium 2.3.3.2 解析 样品在max=227nm 左右有较强吸收峰， 为吡咯并嘧啶环共扼多烯的特征吸 收，这与培美曲塞二钠分子结构相吻合。 2.2.4 核磁共振氢谱 2.2.4.1 测试仪器：bruker drx-500 型核磁共振仪； 测试条件：以 d2o 为溶剂，tms 内标； 测试单位：南京大学现代分析中心； 供试液 max(nm) 吸收带归属 甲醇 224.6 32096 * 水 226.6 31059 * 0.1mol/lnaoh 223 30804 * 第二章 培美曲塞二钠的结构确证 14 样品核磁共振氢谱谱图见图 2-5、图 2-6、图 2-7，数据见表 2-4。 hn nn h on h ocoona coona 2.5h2o h2n 1 2 3 4 5 6 78 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2021 22 23 24 图 2-5 培美曲塞二钠的核磁共振氢谱 fig2-5 1hnmr spectrum of pemetrexed disodium 硕士学位论文 15 图 2-6 培美曲塞二钠的核磁共振碳-氢相关谱 fig2-6 13c-1h nmr spectrum of pemetrexed disodium 图 2-7 培美曲塞二钠的核磁共振氢-氢相关谱 fig2-7 1h-1h nmr spectrum of pemetrexed disodium 第二章 培美曲塞二钠的结构确证 16 表 2-4 培美曲塞二钠的核磁共振氢谱测定数据及解析列表 table2-4 1hnmr spectrum data of pemetrexed disodium 化学位移 (ppm) 多重性 质子数 相关质子 化学位移 (ppm) 相关碳原子 化学位移 (ppm) 归 属 7.56 d, j=8.0hz 2 7.08 126.55 13-h 和 17-h 7.08 d, j=8.0hz 2 7.56 127.93 14-h 和 16-h 6.24 s 1 114.82 8-h 4.25-4.23 q 1 1.94-2.0055.58 20-h 2.72 m 4 26.37、34.9210-h 和 11-h 2.26-2.23 m 2 2.13-2.07, 2.00-1.94 33.90 22-h 2.13-2.07 m 1 2.26-2.23, 2.00-1.94 28.06 2.00-1.94 m 1 4.24,2.72, 2.23-2.26, 2.07-2.13 28.06 21-h 2.2.4.2 解析 4.80 为 d2o 溶剂峰。 培美曲塞二钠分子有 19 个氢原子， 但由于 2-位氨基、 3-位、7-位和 19-位仲胺 n-h 的活泼氢在 d2o 中与 d 原子的快速交换，该样品 1hnmr 谱上述 5 个活泼氢的信号消失， 其余 14 个氢信号分别为在高场的 1 个次 甲基氢信号和 4 个亚甲基氢(8 个 h)信号，在低场的对二取代苯环上的 2 个氢信 号(4 个氢)和吡咯环上的氢信号(1 个 h)，详解如下： 7.56，两个质子，分别与苯环碳相连，分别与 14-位=c-h 和 16-位=c-h 耦 合，d 峰，耦合常数 8.0hz，为 13-位=c-h 和 17-位=c-h 质子； 7.08，两个质子，分别与苯环碳相连，分别与 13-位=c-h 和 17-位=c-h 耦 合，d 峰，耦合常数 8.0hz，为 14-位=c-h 和 16-位=c-h 质子； 6.24，一个质子，与吡咯环碳相连，s 峰，为 8-位=c-h 质子； 4.25-4.23，一个质子，与叔碳原子相连，与 21-位-ch2-两个不同化学位移 的质子耦合，q 峰，耦合常数 4.4 和 4.6hz，为 20-位c-h 质子； 2.72，四个质子两两与仲碳原子相连，m 峰，分别为 10-位-ch2-和 11-位 -ch2-质子； 硕士学位论文 17 2.26-2.23，两个质子，与仲碳原子相连，与 21-位-ch2-两个不同化学位移 的质子耦合，m 峰，为 22-位-ch2-质子； 2.13-2.07 和 1.94-2.00，两个质子，与同一个仲碳原子相连，同碳质子耦 合，并分别与 20-位c-h，10-位、11-位 22-位-ch2-质子耦合，m 峰，为 22-位 -ch2-质子。 综上所述，该样品的 1hnmr 谱及其 h-h 相关谱显示其质子数、化学位移 和偶合裂分情况与文献35-37报道的培美曲塞二钠核磁共振氢谱数据相吻合。 2.2.5 核磁共振碳谱 2.2.5.1 测试仪器：bruker drx-500 型核磁共振仪； 测试条件：以 d2o 为溶剂，tms 内标； 测试单位：南京大学现代分析中心； 样品核磁共振碳谱图 2-8、图 2-9；数据见表 2-5。 hn nn h on h ocoona coona 2.5h2o h2n 1 2 3 4 5 6 78 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2021 22 23 24 图 2-8 培美曲塞二钠的核磁共振碳谱 fig2-8 13cnmr spectrum of pemetrexed disodium 第二章 培美曲塞二钠的结构确证 18 图 2-9 培美曲塞二钠的核磁共振碳-氢远程相关谱 fig2-9 13c-1h nmr long range spectrum of pemetrexed disodium 表 2-5 培美曲塞二钠的核磁共振 13c 谱测定数据及解析列表 table2-5 13cnmr spectrum data of pemetrexed disodium 相关氢 化学位移 (ppm) dept-135 dept-90 归属 c-h c-h 远程 181.88 消失 消失 c23, 季碳 h21, h22 178.63 消失 消失 c24, 季碳 h20, h22 169.50 消失 消失 c18, 季碳 h14, h16 160.59 消失 消失 c4, 季碳 h8 151.47 消失 消失 c2, 季碳 150.22 消失 消失 c6, 季碳 h8 146.24 消失 消失 c12, 季碳 h14, h16, h11 130.19 消失 消失 c15, 季碳 h13, h17 127.93 c13, c17, 叔碳 h13, h17 h17, h13, h11 126.55 c14, c16, 叔碳 h14, h16 h16, h14 117.76 消失 消失 c9, 季碳 h8, h10 114.82 c8,叔碳 h8 h10 98.35 消失 消失 c5, 季碳 h8, h10 55.58 c20, 叔碳 h20 h21, h22 34.92 消失 c11, 仲碳 h11 h13, h17, h10 33.90 消失 c22, 仲碳 h22 h21 28.06 消失 c21, 仲碳 h21 h22 26.37 消失 c10, 仲碳 h10 h8, h11 2.2.5.2 解析 前述 1hnmr 谱化学位移 7.56、7.08 处四个氢只有两个 d 峰，可知对位二取 代苯环上的对称碳在低场中具有相同的化学位移，故而样品分子中有 20 个碳原 硕士学位论文 19 子，但其 13cnmr 谱中只有 18 个信号峰。根据 dept 谱显示样品分子结构中有 4 个仲碳信号、4 个叔碳信号和 10 个季碳信号；在 10 个季碳信号峰中有 4 个碳 信号峰在很低场，化学位移在 160ppm 以上，分别是 2 个羧酸根和 2 个仲酰胺的 羰基碳信号，其余均为芳(杂)环上的季碳信号，在 3 个叔碳信号峰中，有 2 个为 对二取代苯的两对对称碳原子的信号峰，详细解析如下： 181.88ppm，季碳，与 h21和 h22远程相关，为 23