（环境工程专业论文）微生物絮凝剂的开发与应用研究.pdf

摘要 p3 5 3 i 0 3 本文主要论述了微生物絮凝剂产生菌的筛选及微生物絮凝剂的应用研究。 从废水、土壤、活性污泥中筛选出絮凝剂产生菌a z o m o n a ss p ，并对絮凝剂 产生的培养条件、絮凝剂对高岭t 悬浮液的絮凝条件进行了研究。絮凝剂产 ，| i 菌a z o m o l t a ss p 的发酵液经离心沉淀后，其上清液经丙酮萃取、乙醚洗涤 和冷冻干燥得到了絮凝剂粗品，并对其组成进行了初步分析。废水絮凝实验 发明该菌种所产絮凝剂不仅絮凝效果明显，而且具有良好的脱色性能。 关键词微生物絮凝剂絮凝活眭废水处理 a b s t r a c t s c r e e n i n go f f l o c c u l a n t - p r o d u c i n gb a c t e r i aa n da p p l i c a t i o no f b i o f l o c c u l a n tw e r er e p o r t e di n t h i sp a p e r am i c r o b i a l f l o c c u l a n t - p r o d u c i n gb a c t e l - i u r nw a si s o l a t e df r o mw a s t e ，s o i la n d s l u d g e ， w h i c h w a s i d e n t i f i e da s a z o m o n a s s p t h e c u l t u r ec o n d i t i o n f o r p r o d u c t i o no f b i o f l o c c u l a n ta n d f l o c c u l a t i n gc o n d i t i o nw e r ea l s os t u d i e dt h e b i o f l o c c u l a n tw a si s o l a t e db yu l u ac e n w i f u g a t i o n , e x u - a c f i o nw i t ha c e t o n e a b s t e n i o nw i t ha e t h e ra n dd e s i c c a t i o n , t h e ni t s c o m p o s i t i o nw a s a n a l y z e d t h ef l o c c u l a t i n ge x p e r i m e n t so fs e v e r a la c t u a lw a s t ew a i e rw i t ht h i sp r o d t 1 c 【s h o w s g o o df l o c c u l a t i n ga n d d e c o l o re f f e c t k e y w o r d sb i o f l o c c u l a n t f l o c c u l a t i n ga c t i v i t y w a s t e w a t e rt r e a n n e n t 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 1 绪论 絮凝剂是一种水处理化学试剂，可使水和废水中不易沉淀的胶状物质和悬 浮颗粒凝聚沉淀，同时也广泛应用于发酵、化工、食品、医药工业等领域的固 液分离过程。鉴于近年来全球环境状况同趋恶化，絮凝剂的用量越来越大，因 此开发高效、价廉、对环境不产生二二次污染的新型絮凝剂就成为水处理领域中 的个研究热点。 1 1 絮凝剂 l 。i 。i 絮凝剂的定义 j 、l 是用来将水溶液中的溶质、胶体或悬浮物颗粒产生絮状沉淀的物质都h q 做絮凝剂”l 。在水溶液中，使用两种或两种以上的物质称作复合絮凝剂。 1 1 2 絮凝剂的分类 根据絮凝剂的组成，目前常用絮凝剂可分为无机高分子絮凝剂及有机高分 子絮凝剂。有机高分子絮凝剂又可分为天然有机高分子絮凝剂和人工合成有机 高分子絮凝荆。 1 1 3 絮凝剂的特点 无机高分子絮凝剂是六十年代以来在传统的铝盐、铁盐混凝剂的基础上发 展起来的，主要为聚铝、聚铁类物质，由于其效果好、价格低，也是废水处理 中使用最早和最多的絮凝剂。有机高分子絮凝剂的应用是以淀粉、明胶等天然 高分子化合物为开端的。同无机絮凝剂相比，有机絮凝剂具有用量少、沉淀速 度快、絮凝能力高、效果好的特点。同时由于其种类繁多，应用范围广，所产 的污泷比较容易处理，因而有机高分子絮凝剂是目前用量最大、品种最多的絮 凝剂。目前常用的人工合成有机高分子絮凝剂主要为聚丙烯酰胺及其衍生物。 1 2 本课题的提出 i j 无机絮凝剂的用量大，因而在使用过程中有大量的铁离子、铝离子、 硫酸根离子以及氯离子作为二次污染两进入环境。实践证明，铝盐浓度过高对 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓刹硕士学位论文 ii i 水中生物及人体均存在毒性效应，高浓度的铁也会对人类健康和环境造成不利 影响。人工合成有机高分子絮凝剂本身虽然无毒性，但合成它们的单体，经实 验和实践证明具有一定毒性。例如，合成聚丙酰胺的单体，具有神经毒性和致 癌效应口i 。并且有机絮凝剂在生产过程中释放的污染物和降解过程中释放的污 染物严重危害人类健康，从而它的应用受到很大的限制。天然有机高分子絮凝 剂虽然无毒性，呵被生物降解，但由于其絮凝活性较低且受到原料的限制而不 能大规模生产。为了克服和避免无机和有机絮凝剂的缺点，人们迫切希望开发 可生物降解、安全、无二次污染又可大规模工业化生产的新代絮凝剂，在这 种市场要求的推动下，微生物絮凝剂的开发及应用研究成为水处理领域中的 个研究热点。 1 3 微生物絮凝荆 1 3 1 微生物絮凝剂的发展历史及研究现状 自b u t t e r f i e l d t 从活性污泥中筛选到絮凝剂产生菌以来，人们对微生物絮凝 剂的研究逐渐深入。七十年代，美国、同本等许多国家对微生物絮凝剂进行了 大量研究，取得了初步研究成果，使微生物絮凝剂的实际应用具有了良好的前 景。j n a k a r n u r z t 4 1 在1 9 7 6 年就对产生絮凝剂的微生物进行了广泛的研究，并成 功地筛选出具有絮凝能力的微生物菌种a j 7 0 0 2 ，还对该菌种产生的絮凝剂进 行了分离纯化及化学分析。1 9 8 5 年ht a k a g i 等人研究了拟青霉素微生物产 ，的絮凝剂，并用乙醇沉淀和凝胶色谱法精制得到称为p f l0 i 絮凝剂1 ”。1 9 8 6 年，rk u r a n e 等土人t 壤中筛选出1 4 种具有絮凝能力的菌种，其中絮凝能力最 好的为红乎红球菌，并成功地开发了n o c 一絮凝剂。同时将n o c i 应用于 废水脱色、建筑工业废水处理、畜产、造纸废水处理，取得了良好的效果：此 外，该絮凝剂对消除污泥膨胀和污泥脱水干化也有良好效果。1 9 8 8 年，n o r i o s c h i m i z u 和v o o j io d a w a r a l 7 1 从具有高b o d 负荷的活性污泥中分离出9 株能产 生絮凝剂的细菌，其中絮凝效果最好的菌株经鉴定为a g r o b a c t e r i u m 菌，并发 现该菌种所产絮凝剂的絮凝能力受金属离子的影响。1 9 9 1 年，k t o e d a 和 r ，k u r a n e l 8 、9 从土壤中筛选出一株草兰氏阴性产碱杆菌，具有良好的絮凝效果。 我国对微生物絮凝剂的研究起步较晚，中科院病毒所的王镇、王孔星i 1 0 7 等 2 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 人从污水处理场活性污泥中筛选到絮凝活性较好的四种絮凝刘产生菌，并对其 性质及应用做了初步研究。此步 ，学者庄源益也在微生物絮凝剂的开发方面做 r 有益的探索，并将其开发的微生物絮撮剂用于处理染料废水。 日前。微生物絮凝剂的开发研究大多处于菌种筛选阶段，且存在着生产成 本较高的缺点，无法适应工业化生产的需要，因此今后的这一方面的研究主要 集中于： ( 1 ) 筛选高产微生物絮凝剂菌种和培养条件优化； ( 2 ) 微生物絮凝剂的化学组成和理化性质的测定及絮凝机理的研究： ( 3 ) 微生物絮凝剂的絮凝活性分布和絮凝能力测定及其影响因素； ( 4 ) 利用高浓度含氮有机废水及廉价原料进行微生物絮凝剂的开发及其削 餐 “艺的研究。 ( 5 ) 利用基因工程和生物工程技术，提高微生物絮凝剂的产率，并研究适 j t j 于r 业化生产的絮凝剂收获提取方法。 微生物絮凝剂受各种因素的影响，但遗传因素是内在依据，随着对微生物 絮凝剂絮凝机理、遗传控制的深入研究及生化：丁程技术的提高，微生物絮凝卉l j 必将显示出巨大的应用价值。 1 3 2 微生物絮凝剂的分类及特点 1 3 2 1 微生物絮凝剂的分类 微q 三物絮凝剂包括直接利用微生物细胞做絮凝剂、从微生物细胞提取的絮 凝剂和微生物细胞代谢产生的絮凝剂。 ( 1 ) 从微生物细胞提取的絮凝剂 微生物细胞是天然高分子絮凝剂的重要来源。如酵母菌细胞壁的葡聚糖、 日露聚糖、蛋白质和n 。乙酰葡萄糖胺等成分均可用作絮凝剂。壳聚糖含有活 h 氨基和羟基，对许多微生物菌体及其他带负电的离子有较强的絮凝能力，因 向近年来在环保中倍受青睐。此外，从某些藻类、霉菌、细菌的细胞壁中也可 提取具有絮凝性能的物质，但由于细菌细胞个体较小，不易收集，目前利用藻 类和霉菌的细胞壁提取物较多，利用细菌细胞壁的较少。 ( 2 ) 微生物细胞代谢产生的絮凝剂 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 微生物细胞分泌到细胞外的代谢产物主要是荚膜和粘物质。除水分外，其 ：要成分为多糖及少量的多肽、蛋白质、脂类及其复合物。这些物质在某种程 度e 都可用作絮凝剂，但贡献最大的还是多糖类物质。 ( 3 ) 直接利用微生物细胞作絮凝剂 直接利用微生物细胞作絮凝剂可以免去提取成本，至今发现具有絮凝性的 微生物多达几十种，某些细菌、霉菌、放线菌和酵母菌的细胞均具有絮凝性， 例如：a s p e r g i l l u ss o j a e ，a s p e r g i l l u so c h r a e u s ，a s p e r g i l l u sp a r a p s e u d o m o n a s “r r u g i n o s a a l c a l i g e n e sc u p i d u s 1 3 2 2 微生物絮凝剂的特点 微生物絮凝剂不仅具有良好的絮凝沉淀作崩，而且对色素等溶解性物质有 较强的吸附脱色作用，与传统的有机、无机絮凝剂相比，具有以下特点： ( 1 ) 絮凝作用强，对无机和有机的微小颗粒都有很强的絮凝作用；同时对 色素等溶解性物质也有较强的吸附脱色作用： ( 2 ) 无毒安全，无次污染，具有生物降解性； ( 3 ) 小受原料限制，可发酵人规模，卜f 。； ( 4 ) p h 应用范围宽。 1 4 本课题的研究目的及意义 本课题属于应用基础研究，旨在开发一种微牛物絮凝剂并对其应用做初步 探索，以填补国内在这方面的空白。通过与其它常用絮凝剂的比较，考察微生 物絮凝剂的性能和实际应用价值。 本课题研究意义重大，微生物絮凝剂可以为市场提供一种高效、无毒的新 代絮凝剂。这种新一代的可降解絮凝剂将会在以下几个方面促进经济和社会 发展。 ( 1 ) 可极大的促进水污染的治理，由于微生物絮凝剂有强的絮凝作用，产 ，| 的沉淀污泥粘性小，对脱除c o d 、b o d 和色素有很好的效果。因而它可以 杓称为当前污染最严重、处理难度最大的皮革、造纸和染料废水中发挥作用。 ( 2 ) 由于无机、有机絮凝剂具有毒性，因而在食品、保健品行业中不能大 4 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 量使用。微生物絮凝剂的开发应用，不仅可以改善这些产品的口感、风味等方 面的品质，还可以降低成本，保障人民身体健康。 ( 3 ) 可以在发酵、酶制剂等生化和医药行业的分离、纯化、浓缩中得到广 泛的应用。 ( 4 ) 酸性微生物絮凝剂的出现，不仅可以克服现有絮凝剂难处理酸性废水 的局限性，而且由于它的无毒副作用，可在饮用水的预处理及废水中回收有价 值的蛋白质、氨基酸方面发挥作用。 微生物絮凝剂的开发及应用仅仅二十几年的时间。在这二十几年l 、日j ，欧美、 同本都投入大量人力物力进行开发研究，并在废水处理中加以应用。但总的来 说，微生物絮凝剂还没有引起人们足够的重视，随着水资源紧张和环境污染的 同益严重，微，士物絮凝剂安全、无毒、易降解的特性必然越来越受到人们的青 睐，并在节约能源和保护环境发挥巨大作用。 1 5 本课题的主要研究内容 ( 1 ) 根据建立的菌种筛选模型，从废水、土壤、活性污泥中筛选产絮凝 刺的微l 物菌种。 ( 2 ) 对筛选出的菌种进行鉴定。 ( 3 ) 絮凝剂产生条件优化。 ( 4 ) 絮凝活性测定及其影响因素的研究。 ( 5 ) 絮凝荆的提取及其组成分析。 ( 6 ) 对比试验及废水处理应用试验。 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 ! ! ! ! 鼍i n nn l ! i i l ! g ! ! ! ! ! ! ! 自! 皇 2 絮凝机理 2 1 胶体的稳定性 胶体和悬浮物是水和废水处理的主要处理对象，大颗粒的悬浮物由于重力 的作用而下沉，可以用沉淀法去除。但是微小粒径的悬浮物和胶体，能在水中 长期保持分散悬浮状态，即使静置数十小时以上，也不会沉降。这是由于胶体 微粒及细微悬浮颗粒具有“稳定性”。 2 。2 胶体稳定理论 2 2 1 胶体表面电荷结构1 2 | 胶体和悬浮物颗粒表面都带有电荷，它们所带电荷的数量和性质，对絮凝 作用有很大的影响。胶体和悬浮物表面带有电荷的原因有四个：是由物质的 电离作用而产生的；二是由于离子的离解：三是由于颗粒吸附离子的结果；四 是晶格中离子取代而带电荷。 胶体和悬浮颗粒表面电荷的结构和双电层示意图如图2 2 1 所示。 oo eo 0 e 。o 一一一一一新特患屡 一一斯转息电垃 一萘恩斯特电位 一一砘位 一一一耐救层 一一- 瞍链半径 图2 2 1 股体表面电荷与烈电层示意图 固体表面电荷通过静电引力和范德华力，将溶液中符号相反的离子牢固的 吸附在固体表面附近，形成一个牢固的内层叫做s t e m 层，也叫吸附层。这层 的反号离子不能脱离固相表面扩散到溶液中去，它的厚度与反号离子半径和水 合离子的半径大小有关。这层中的反号离子是水合离子，但是向着固相的一面， d j | 静电引力和范德华力使反号离子紧紧地吸附在固相表面，将水合的反号离 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 ! ! ! i i1 ：i ! ! 子的水分子排挤掉，因此反号离子面向固相的一面没有水合的离子，而面向溶 液的面则有水合的水分子，造成反号离子的半水合状态，所以s t e r n 的厚度 等于水合离子的半径，而不是直径。从固相面到s t e r n 面电位差叫做s t e r n 电位。 反号离子一部分被固定在吸附层中，其余过剩的部分，在热运动和电场的 作用下，从s t e r n 面扩散到溶液中以指数形式衰减，直至过剩的反号离子为零 为u ，这一层叫扩散层。从固相表面到过剩电荷为零处称为扩散双电位层。 从切面到溶液中的电位差叫z 电位。z 电位表示扩散层的厚度和电荷密度 的特性。扩散层厚度大时，z 电位高，颗粒之问不能互相接近，保持稳定状态。 z 电位能够反映出胶体颗粒的稳定性，并且可以测定出来，在絮凝化学中，z 电位是非常重要的参数。 根据经典理论，电位可用式( 2 1 ) 表示。 z = 4 7 r c r 艿d( 2 1 ) 式中：6 一扩散层厚度； 盯一颗粒的电荷密度： d 水的介电常数。 2 2 2d l v o 理论 d l v o 理论是用胶体颗粒俐的吸引能和排斥能的相互作用，产生的相互作 用能，来解释胶体的稳定性和产生絮凝沉淀的原因。 2 2 2 1 胶体颗粒问的排斥能 胶体颗粒表面带有相同电荷时相互排斥，排斥力和排斥能的大小与颗粒间 的距离和所带的电荷有关。排斥能大，则颗粒不能靠近，不利于絮凝沉淀，而 保持其胶体的稳定状态。加入电解质，能中和颗粒表面电荷和减少扩散层厚度， 降低排斥能，从而颗粒在布朗运动和电场作用下，形成絮凝体。当颗粒的z 电 位不卜分高，颗粒半径比扩散层厚度大得多的时候，颗粒间的排斥能可用式 f 2 - 2 ) 表示： 1 = 去r d “i n f l + e x p ( 一k h ) j ( 2 - 2 ) 式中： 一颗粒间的排斥能； 7 微生物絮凝荆的开发与应用研究柴晓利 硕士学位论文 r 一颗粒的半径： d 一水的介电常数； “一吸附层和扩散层界面上的电位i 1 k 一离子云的厚度： h 一颗粒恻的最短的距离。 随着颗粒间的距离的变化，可以得出排斥能曲线，如图2 2 2 1 所示。 、 、 、 、 一 、巧 一 个 一 i ，访、：、一。一 一一：。p ，7，一，。第二量小能量值 ，v a 舻姐值 图2 2 ，21 排斥能曲线图 p 。吸引能 n 一排斥能y t 相互作用能 v 能蟑d 颗粒表面间距离 由式( 2 - 2 ) 可以得出如下结论： ( 1 ) 排斥能与吸附层和扩散层界面上的电位和颗粒半径成正比。所以吸 附层和扩散层界面上的电位越高，排斥能越大，颗粒不易靠近，越稳定。粒径 小时，排斥能小，颗粒容易靠近，利于絮凝。 ( 2 ) 排斥能随着颗粒问的距离的增加，以指数的形式f 降。 微生物絮凝荆的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 m -i m _ ! i o ! ! ! 自 两个胶体颗粒之间，存在伦敦一范德华引力。它的大小与颗粒问的距 离有关。当两个球形颗粒的体积相等，距离非常小的情况下，它们之例的 吸引能v 。可用下式求出： y 。一啬 ( 2 - 3 ) 式中： a 一范德华常数，a = l o 。2 ( e r g ) ； ，一颗粒的半径( c m ) ： h 一颗粒间的最短距离。 由式( 2 - 3 ) 可见，吸引能与颗粒半径成正比，粒径大的颗粒吸引能也大。 吸引能随着颗粒间的最短距离的减小而增大。 由式( 2 - 3 ) 可以求出吸引能曲线，如图22 ，2 i 所示。 2 2 2 3 胶体颗粒闻的相互作用能( v ，) 颗粒之间的相五：作用能等于吸引能和排斥能之和，即 v 7 = v 十v r 当两个颗粒之间的距离非常小时，颗粒间的相互作用能( v ，) 可用下式计 算： y ，= 圭栅2 ，n 1 + e x p ( - 舳) 】一面a r 式( 2 - 4 ) 可以计算并绘制出相互作用能曲线 从图2 , 22i 中可以得出如下五个结论： ( 2 4 ) 如图2 22i 示。 ( 1 ) 颗粒间的距离很小和很大时，相互作用能以吸引能为主，能够形成 絮凝体。 ( 2 ) 当颗粒闯的距离处于中等程度时，相互作用能以排斥能为主。颗粒 处于稳定状态，不能形成絮凝体。 ( 3 ) 颗粒相距很远时，吸引能和排斥能都等于零。 ( 4 ) 曲线v 有两个最小能量值。颗粒忸j 的相互作用能达到第一个或第二 0 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓刹 硕士学位论文 个最小能量值时，便产生絮凝沉淀。为了使颗粒脱稳，而加入药品( 絮凝剂) ， 其主要作用就是减少或消除处于中等距离上的排斥能，使得以吸引能为主，以 便于颗粒聚集和絮凝。 ( 5 ) 曲线v 存在能量障碍。颗粒间相互作用能曲线v ，有一个能量峰v 。 能量峰v 。是颗粒凝聚和絮凝的能量最大障碍。 只有减少排斥力，降低能量峰v 。，才能缩小颗粒间的距离，增加吸g ( 力， 形成絮凝体。 当布朗运动和紊流变动对颗粒做的功e 大于能量峰v 。时，则能发生凝聚 和絮凝沉淀。因此有： 矿。 e = 昙m 矿2 ( 2 5 ) 式中：m 胶体颗粒的质量； v 胶体颗粒的平均速度； e 胶体颗粒的平均动能。 2 。3 絮凝作用机理 絮凝作用机理f l 有如下四种： ( 1 ) 通过捕集和清扫胶体颗粒： ( 2 ) 压缩双电层，减少表面电荷： ( 3 ) 由于吸咐作用而使电荷中和； ( 4 ) 高分子絮凝荆的桥连。 目前普遍认为无机高分子絮凝剂主要是通过电性中和，压缩双电层，降低 z 电位，减少微粒1 1 日j 的排斥能，从而达到絮凝的目的。有机高分子絮凝荆主要 是利用带有许多活性官能团的高分子线状化合物吸附多个微粒的能力，通过架 桥作用聚集在一起，形成一些较大体积的絮团，从而达到絮凝的目的。关于微 0 j 物絮凝剂的作用机理先后提出过许多学说，目前普遍接受的学说是“桥连作 异j 机理”学说。该学说可以解释大多数微生物絮凝剂引起的絮凝现象，以及一 些因素对絮凝的影响，并被一些试验所证实。该学说认为：尽管微生物絮凝剂 的性质不同，但对液体中胶体、悬浮颗粒的絮凝有相似之处，它们通过离予键、 氰键和范德华力，吸引多个胶体颗粒，在颗粒问产生架桥现象，从而形成一种 1 0 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 _ l 一p m l ! ! ! 目! 网状三维结构而沉淀下来】。 由于絮凝作用是非常复杂的物理、化学过程“桥连作用机理”并不能解释 所有现象。絮凝剂的广谱活性也证明吸附机理也不是唯一的。为了更好的解释 机理，需要对特定絮凝剂和胶体颗粒的组成、结构、电荷、构象及各种反应条 件对它们的影响进行更深入的研究。尽管如此，这四神絮凝机理还是有用的。 并且在研究絮凝作用中，起着重要的作用。它能够帮助我们掌握胶体和悬浮物 的絮凝条件、絮凝剂的性质和用量，降低水和废水的处理成本，提高絮凝和运 转效率。下边分别加以讨论。 2 3 1 胶体的捕集和清扫 在水或废水中加入高浓度絮凝剂，带负电荷的咬体颗粒，暴露在絮凝剂所 产生的阳离子高分子附近，被这些阳离子高分子的电荷所中和。这些高分子化 合物具有三维空间的立体结构，适合于胶体颗粒的捕获。随着高分子化合物体 积的收缩，沉淀物和悬浮物象多孔的网子一样，从水中将胶体和悬浮物颗粒清 扫下来，形成絮状沉淀，沉淀在水底。这就是胶体颗粒的清扫过程。亦是清扫 机理。清扫机理适合用澄清法进行固一液分离。 另个絮凝机理是象“堆积木”一样，胶体颗粒表面电荷被中和后，形成 一块一块的“积木”，然后堆积在水底。每块“积木”表面上的电荷不影响已 经沉积下来的絮凝物的性质。但是，如果每块“积木”能使胶体颗粒体积减小， 表面电荷对已经沉积的絮凝物就有影响。捕集胶体颗粒的主要作用是形成块 块“积木”。并使体积变为最小。 2 3 2 双电层的压缩 水中胶粒能保持稳定的分散悬浮状态，主要是由于胶粒的z 电位。如果使 双电层厚度减少，排斥能( z 电位) 降低到相当小时，颗粒就能够被第二最小 能量值的吸引力所吸引而碰撞聚结，失去稳定性。 ， 当溶液中离子浓度高时，大量正离子涌入胶体甚至扩散层。因为胶核表面 的总电位不变，增加扩散层及吸附层中的正离子浓度，会使扩散层变薄，z 电 位降低。当两个胶体互相接近时，由于扩散层变薄，z 电位降低，因而它们互 卡 | 排斥力减少，胶粒脱稳，产生絮凝沉淀。 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓刹硕士学位论文 2 3 3 吸附电中和作用 吸附电中和作用是指胶体表面对异号离子、异号胶粒有强烈的吸附作用， 由于这种吸附作用中和了它的部分电荷，使z 电位降低到足以克服能量障碍而 产生絮凝沉淀的过程。胶体颗粒表面的电荷被中和时，胶体颗粒间的距离缩小， 疗：范德华引力的作用下，胶体颗粒问的相互作用能处于第一最小能量值，结果 形成稳定的絮凝体。 电荷的中和作用与双电层的压缩是不同的，电荷的中和作用是第最小能 量的吸引力作用的结果，这个吸引力是很强的；而双电层的压缩是第二最小能 量的作用力的结果。这个作用力是比较弱的。这两个作用力的强弱不同，所产 生的絮凝体的性质也不同。强作用力下所产生的絮凝体坚实，体积小，不能再 变为胶体：弱作用力所产生的絮凝体其体积庞大、疏松，能够再变成胶体而消 失。 2 3 4 桥连 桥连是指溶液中胶体和悬浮物颗粒通过絮凝剂架桥连接从而形成絮凝体沉 淀卜来。絮凝剂物质被胶体微粒强烈吸附，因其线形长度较大，它的两端各吸 附胶粒，在相距较远的两胶粒间进行吸附架桥，使颗粒逐渐增大，形成絮凝体。 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 3 菌种筛选及鉴定 3 1 菌种筛选 能产生絮凝剂的微生物有很多种类，细菌 1 2 13 l 、放线菌i “】、真菌【i 、以及 菌类i 等都可以产生絮凝剂，其中研究比较深入的有r h o d o c o c c u sy t h r o p o l i s 6 j a s p e r g i l l u ss o j a e f “”1p a e c i l o m y c e ss p l 9 1 和a l c a l i g e n ec u p i d u s 等，这些已经鉴定的 微牛物絮凝剂产牛菌，大量存在于十壤、活性污泥和沉积物中。 3 1 1 样品采集 为了获得絮凝活性高、絮凝剂产率大的微生物絮凝剂产生菌，我们在无锡 地区采集了不同类型的样品： ( 1 ) 无锡市芦村污水处理厂下水道污泥1 份，曝气池水样l 份； ( 2 ) 无锡肉联if 水道污泥l 份，污泥处理池水样l 份； ( 3 ) 无锡市炼油厂污水处理池污泥1 份，车间旁土样1 份： ( 4 ) 江苏省微生物研究所污水沟泥样1 份： ( 5 ) 无锡市西郊山土样l 份，蔬菜地土样l 份，旱田地土样1 份。 3 1 2 培养基配制 根据在菌种筛选过程中培养基用途的不同分别配制不同的培养基。 分离用培养基 培养基a ： 可溶性淀粉l o g ，k 2 h p 0 40 2 5 9 ，m g s 0 4 7 h 2 00 2 5 9 ，k n 0 3 o ，5 9 ，n a c io2 5 9 ，加水至5 0 0 m t ，p h 为7 。 培养基b ： 牛肉膏0 5 9 ，酵母膏l g ，蛋白胨2 5 9 ，n a c i2 5 9 ，加水至 5 0 0 m l ，p h 为7 。 培养基c ：培养基a 加入2 琼脂。 培养基d ：培养基b 加入2 琼脂。 发酵培养基 酵母膏1 0 9 ，k h 2 p 0 40 5 9 ，m g s 0 4 ，7 h 2 00 5 9 ，加水至5 0 0 m l ，p h 为7 。 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 3 1 3 培养条件 ( 1 ) 固体培养基在3 0 培养箱中培养2 3 天： ( 2 ) 液体培养基用1 5 0 r a l 三角瓶放置5 0 r a l 试样，在温度为3 0 ，转速为 2 0 0 r p m ，时间为7 0 h 左右。 3 1 4 样品制备( 絮凝剂样品制备) 将摇瓶培养液在速率为6 0 0 0 r p m 的离心机上离心5 r a i n ，去除菌体及固形 物，卜清液作为絮凝剂粗制品备用。 3 1 5 絮凝活性测定方法 ( 1 ) 方法 1 0 0 m l 量筒中加入0 4 96 0 目高岭土，加8 0 m l 蒸馏水，5 m l 1 c a c i ! ，2 m l 发酵液，加蒸馏水至1 0 0 m l ，调p h 至7 0 摇匀，静置5 m i n ，同 时以不加发酵液的高岭土做对照，以絮凝出现的时f b 矛n 程度判断絮凝活性的高 低。此法为初筛时使用。 ( 2 ) 方法二0 1 l o o m l 量筒中加入0 4 96 0 目高岭土加8 0 m l 蒸馏水，5 m l 1 c a c l l ，2 m l 发酵液，加蒸馏水至l o o m l ，调p h 至7 0 摇匀，静置5 m i n ，于 7 5 l 型分光光度计5 5 0 h m 处测定上清液光密度，以不加发酵液的卜清液光密度 为刑照，通过光密度减少来确定絮凝程度，用絮凝率来表示絮凝活性。絮凝率 公式如f ： 絮凝率( ) ：丝。1 0 0( 3 1 ) a a ：对照上清液5 5 0 n m 处光密度值： b ：样品上清液5 5 0 n m 处光密度值。 3 1 6 筛选方法 由于菌种的筛选是项细致而又比较复杂的工作，需要有序的合理的安排， j 能在较短的时间内筛选到所需要的菌种。根据以往筛选菌种的经验以及有关 微生物絮凝剂方面的了解，我们制定了以下筛选方法，如图3 1 6 所示。 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 样品采集 上 样品预处理 富集培养 挑选菌落 赢 上 单胞分离 i t 复筛 广 诱变处理 i = 二亡 i复筛i 二二 二二 i堂兰望墨鳖型兰竺堕 i 图3 1 6 微生物菌种的筛选方法 3 1 7 筛选结果 通过数次采样，按图3 i 6 所述方法分离筛选，共获得菌株6 9 8 株。然后 进行初筛，将所获得的菌株分批经过摇床培养，制备样品，观察其对高岭土悬 浮液的絮凝效果，从6 9 8 株中共筛选到有絮凝活性的菌株5 1 株。进一步按照 筛选31 5 节中方法二_ ：进行复筛，共获得活性较高菌株1 2 株，如表3 1 7 1 所示。 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利 硕士学位论文 山于自然筛选的菌种絮凝活性较低，我们对复筛所获得的絮凝活性最高的菌株 进行了物理诱变8 1 ( 紫外线照射) ，并把诱变后的菌种进行复重上述操作的初筛、 复筛，最后得到絮凝活性较高的微生物菌种4 株，见表3 17 2 。 表3 1 7 1具有絮凝活性的微生物菌株 3 1 8 结果与讨论 由表31 7 1 ，表3 172 可知，在1 2 株有较高絮凝活性的菌株中，来自活 。陀污泥样品占大多数，约为5 0 ，其次为土样。而来自活性污泥处理池水样及 污水沟中水样则未筛选到活性较高的菌株。经过多次初筛和复筛并进行物理诱 变后得到的4 株菌株所产絮凝剂活性较高。这一研究结果表明： ( 1 ) 从活性污泥中筛选获得产微生物絮凝剂的菌种是可行和有效的，与国 外学者的研究结果一致。 ( 2 ) 建立的筛选模型行之有效。 3 2 菌种的初步鉴定 3 2 1 鉴定方法 对活性最高的菌种进行菌种纯化后，分别进行平板涂布培养和试管斜面培 1 6 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 荠以观察其特征及形态，并进行革兰氏染色、接触酶、需氧性等生化和生理特 征试验”l 。 3 2 2 鉴定结果 表3 221 菌落及菌体特征 迪蓬缝丝一! 。登鎏壹墨羞j 一 自鱼一! 焦盟二凰璺塑堕一直鳖一一 菡体特征( 试管斜面培养)卵形、无芽孢、周身鞭毛 色素产生 需氧性 无氮培养基螭养牛k 接触酶 葡萄糖利 ；f 甲基红试验 果聚糖产生 好氧 + 发酸、发酵、产酸、产气 + 根据以上试验结果，并参照伯杰氏细菌鉴定手册，初步断定该菌为氮单胞 蔺属2 。1 ( 一z o m o n h s s p ) 。 一1 7 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 4 微生物絮凝剂的产生 4 1 絮凝剂产生有关性质测定 4 1 1 测定方法 将表317 2 所述的4 种菌株中絮凝活性最高的2 种菌株接种于筛选用培养 硅中预培养1 6 h ，然后接种于相同培养基的摇瓶中培养，培养基装量为5 0 m l 瓶接种量为2 5 。并每隔一定时间测定其p h ，菌生长量( 以o d 6 。表示) 及絮凝率( ) ，结果如图4 12 1 、4 1 2 2 、41 2 3 、4 1 2 4 所示。 4 1 2 结果与讨论 絮 凝 率 图4 12 1 菌株r f b 7 3 牛k 及絮凝活性曲线 絮 凝 宰 培养时间( h ) 图4 1 2 , 2 菌株r f b 7 3 p h 变化曲线 培荐日i 间( h 图412 3 菌株r f b 6 1 生长及絮凝活性曲线 光 密 殳 一1 9 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 培养时间( h ) 幽41 2 4 萄株r f b 6 l p h 变化曲线 从2 株絮凝剂产生菌的p h 变化曲线，可以看出：在培养过程中，培养液d h 值先是f 降，并于2 8 h 左右降低到最低点，之后，缓慢升高并趋于稳定，这与 微生物的生长和代谢过程中会产生酸或碱及微生物细胞选择性地吸收阳离子和 | 5 j 离子有关口”。由生长曲线，絮凝活性曲线可以看出培养液的絮凝率则随菌生 k 量的增加而同步升高，絮凝活性与菌生长量成f 相关性2 2 】。在培养早期，絮 凝滔十牛不高，随发酵进行，絮凝活性逐渐增加，在对数期的后期和静【e 期的早 期达到最高值。 以上研究表明： ( i ) 存在于培养液中引起絮凝的物质是产生菌的代谢产物，而不是菌细 胞自溶造成的i 。 ( 2 ) 最好是在细菌对数生长期后期或静止期早期收获微生物絮凝剂，以 ，絮凝活性即使不下降也不会增加。 4 2 絮凝剂在微生物培养液中的分布测定 4 2 1 测定方法 将细菌培养液于9 0 0 0 r p m 离- t l , 机上离心1 5 r a i n ，取其e 清液。菌体用蒸馏 水洗涤后悬浮在与培养液等体积的蒸馏水中，分别测定培养液、去菌细胞上清 夜及菌细胞悬液对高岭土的絮凝率，测定方法同3 1 5 节中方法二 。 2 0 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 4 2 2 结果与讨论 表4 2 2 絮凝活性分布 菌株编号 相对絮凝率( ) 之菌细胞上清液菌细胞恳液 + 以各菌全培养物絮凝率为1 0 0 从表42 2 可以看出，絮凝活性主要存在于去菌细胞上清液中，而菌体基本 l 无絮凝能力，这进一步证明了该絮凝剂是菌分泌到细胞外的代谢产物。 4 3 影响微生物絮凝剂产生的因素 絮凝剂的产乍受到许多因素的影响，如培养基的组成，初始p h 值，培养 温度，通气量等。一般来说，营养丰富的培养基有利于絮凝剂的产生，但各絮 凝剂产生菌之间的营养要求差别很大。 4 3 1 培养基成份的影响 培养基的成份是影响微生物絮凝剂产牛的重要因素，我们根据查找的文献 种发酵产物絮凝剂的特点以及力求培养基简单、廉价的原则，先后利用不同碳 源和氮源进行了摇瓶试验。 43 1 1 试验方法 将r f b 6 1 菌种于含有2 葡萄糖，o 2 酵母膏，0 0 2 牛肉浸出膏的培 养基中培养1 6 h 后，然后接种于盛有1 0 0 m lb l c 培养基的2 5 0 m l 摇瓶中发酵 培养后测定其絮凝活性及菌生长量。 b l c 培养基的成分：碳源1 0 9 ，m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 ，k h 2 p 0 45 9 ，n a c lo 1 9 ， k ，h p 0 42 9 ，氮源o5 9 。 培养条件：培养时间为7 0 h ，培养温度为3 0 。c ，转速为1 6 0 r p m 。 4 3 1 2 结果与讨论 2 1 微生物絮凝剂的开发与应崩研究柴晓利硕j 上学位论文 i l l i l l 表4 3 12j 碳源的影响 从表43 l 2 1 可以看出，在所用碳源中，葡萄糖作为碳源效果最好，利用 葡萄糖作为碳源不仅有利于絮凝剂的产生，也有利于菌生长量。以淀粉作为碳 源虽有利于菌的生长，但不利于絮凝剂产生，这说明只含单糖的培养基有利于 絮凝刺的产生，关于单糖对菌产絮凝剂的促进作用已有文献报导【9 1 。 从表43 12 2 可以看出，尿素作为无机氮源更有利于絮凝剂的产生和菌的 小长，另外n h 。c 1 和州h 。) ：s o 。虽有利于菌的生长，但絮凝活性仅为尿素作为 氧源的6 0 左右。蛋白胨单独做氮源或蛋白胨和无机氮共同做氮源均有利于菌 q 长量，但对絮凝活性的提高无明显提高。 4 3 2 温度的影响 任何微生物只能在一定的温度范围内生存，在适宜的温度范围内微生物能 ，、量繁殖，为确定絮凝剂产生的最适培养温度进行如f 试验。 4 3 2 1 试验方法 利用葡萄糖为碳源、尿素为氮源分别在不同的温度下发酵培养，其它条件 飘，晦 受l ；定其絮凝活性。 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 4 3 2 2 结果与讨论 表4 322 温度的影响 8 5 8 0 7 5 7 0 6 5 6 0 5 5 182 02 22 42 62 83 03 23 43 63 84 04 2 温度f c 幽4 322 温度的影响 从图4 3 2 2 可以看出，培养温度为3 0 。c 时最有利于絮凝剂的产生。3 5 培 养时菌株生长快，对菌生长有利，但絮凝活性降低。由此可见，温度过高不利 絮凝剂的积累。 4 3 3 培养基初始p h 值的影响 微生物的生命活动、物质代谢与p h 值有密切关系。不同的微生物要求不 n 目的p h 值，这是因为p h 的改变会影响微生物表面电荷的改变，进而影响微 q 物对营养物的吸收；此外，微生物酶只有在最适的p h 才能发挥最大活性， 个适宜的p h 值使酶的活性降低，进而影响微生物细胞内的生物化学过程。因 而p h 值对絮凝剂的产生也有一定影响，为确定絮凝剂产生的最适d h 值，进 fj 。如下试验。 丝生塑鍪堑型盟互发与应用研究 柴晓利 硕士学位沦文 4 3 3 1 测定方法 以葡萄糖为碳源、尿素为氮源，在不同的d h 值于3 0 发酵培养，并测定 其絮凝率，测定结果如表43 32 所示。 4 3 3 2 结果与讨论 10 0 9 0 8 0 7 0 6 0 68 d h 佰 图4 332 初始p h 值的影响 由图4 3 3 2 可以看出，培养基的初始p h 值过高或过低都不利于絮凝剂的 产生，菌株r f b 6 1 最适p h 值为7 5 8 5 ，菌株r f b 7 3 最适p h 值为8 0 9 0 ， 倒合成絮凝剂最适p h 值与菌生长最适p h 值并不一致。 4 3 3 3 通气量的影响 通气量对菌生长及絮凝剂的产生是1 个不可忽略的因素i ”。通过控制摇床 的不同转速，在培养温度为3 0 。c 下，发酵培养并测定培养液的絮凝活性。实验 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 发现过量的通气量将导致絮凝率的下降，虽然对菌生长量的影响不大。实验中， 还发现培养初期较大的通气量有利于絮凝剂的合成；在培养后期( 静止期的早 蚶j ) 培养液的絮凝活性最大。 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 5 影响絮凝活性的因素 影响微生物絮凝剂絮凝活性的因素很多， 二要包括温度、p h 值、会属离 f 浓度等。为了测定这些因素的影响，我们选用两株菌株7 2 小时发酵培养液， 许测定不同条件下的絮凝活性。 发酵培养条件：培养温度3 0 ，摇床转速l5 0r r a i n ，2 5 0m l 摇瓶，装量 l o o m l 。 培养基组成：葡萄糖l o g ，m g s 0 4 7 t t 2 0o2 9 ，k h 2 p o 。5 9 ，n a c l0 1 9 ， k 2 h p o 。2 9 ，尿素o 5 9 。 5 1 温度的影响： 5 1 1 试验方法 将r f b 6 1 、r f b 7 3 菌株接种于培养基中发酵培养7 2 h ，培养液经离心沉淀 后，取其上清液在不同温度f n 定絮凝活性，测定结果如表51 2 所示。 5 1 2 结果与讨论 表5 12 温度对絮凝活性的影响 丝尘塑茎墼型箜茎垄：主堡用研究 柴晓利 硕士学位论文 8 0 辞 ；6 0 凑 懿4 0 2 0 温度 图51 2 温腰对絮凝活性的影响 由图5 1 2 可以看出，温度过高或过低对絮凝作用均不利。低温时随着温 度的升高，絮凝活性逐渐增大，这和某些化学反应有相似之处，温度升高，使 反应速度加快：但达到一定温度后，絮凝活性反而下降，这可能是由于这些絮 凝剂的蛋白质成份在高温变性后会丧失部分絮凝活力m 】。 5 2 p h 值影响 5 2 1 试验方法 将r f b 6 l 、r f b 7 3 菌株接种于培养基中发酵培养7 2h ，培养液经离心沉 淀，取其上清液用酸或碱调整在不同p h 值下测定其絮凝活性。 5 2 2 结果与讨论 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 1 0 0 8 0 莲 瓣 6 0 葵 蹦 4 0 2 0 24681 01 21 4 p h 值 图5 22 p h 值对絮凝活性的影响 由图5 2 2 可以看出，絮凝活性随着p h 值的增大而增大，在p h 值为1 2 时 达到最高值后反而下降。实验表明，该絮凝剂在碱性范围内絮凝效果较好。絮 凝过程是胶体颗粒与絮凝剂人分f 相互靠近、吸附，并形成网状结构的过程： 入分f 与胶体颗粒的表面电荷对絮凝有很重要的作用。由p h 值直接影响着絮 凝剂人分子和胶体颗粒的表面电荷，从而影响占们之间的靠近和吸附行为，因 而絮凝剂在不同的d h 值表现出不同的絮凝活性【2 4 、2 ”。 5 3 金属离子的影响 5 3 1 试验方法 将r f b 6 1 、r f b 7 3 菌株7 2 h 发酵培养液离心沉淀后，取其上清液，参照3 1 5 节中测定方法二，分别加入不同的金属离子，并测定絮凝活性，测定结果如表 53 2 所示。 5 3 2 结果与讨论 微生物絮凝剂的开发与应用研究柴晓利硕士学位论文 表5 3 2 金属离子对絮凝活性的影响 由表53 2 可以看出，c a ”、m 9 2 + 的加入可显著提高絮凝活性，而a i ”的加 入则看不出有显著变化。金属离子对絮凝活性的影响主要是由于金属离子能显 著改变胶体的z 电位，降低其表面电荷，促进大分子的吸附和架桥，因而对絮 凝活性有重要影响。但金属离子的浓度不宜过高，否则由于大量离子占据了絮 凝剂分子的活性位置，并把絮凝剂分子与悬浮颗粒分开而抑制絮凝。关于金属 离f 对絮凝活性的影响，特别是关于c a ”的影响报道很多 2 6 - 2 7 l 。 5 4 投加量的影响 5 4 1 试验方法 将r f b 6 1 、r f b 7 3 菌株7 2 h 发酵培养液离心沉