（环境科学专业论文）活性艳红x3b与生物大分子相互作用.pdf

a b s t r a e t a b s t r a c t t h ei n t e r a c t i o n so fr e a c t i v eb r i l l i a n tr e dx 一3 b ( 1 m r ) a sar e p r e s e n t a t i v eo fa n i o n i c a z oc o m p o u n d sw i t hb o v i n es e r u ma l b u m i n0 3 s a ) ，l y s o z y r n ca n dh u m a ns e r u m a l b u m i n ( h s a ) w e r ei n v e s t i g a t e db y ac o m b i n a t i o no fu v - v i ss p e c t r o m e t r y , f l u o r o p h o t o m e t r y , c i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d ) a n di s o t h e r m a lt i t r a t i o nc a l o r i m e t r y ( i t c ) t e c h n i q u e t h eb i n d i n gi n t e r a c t i o n so f r b ra n d p r o t e i n sw e r ed e t e r m i n e db ys p e c t r a l c o r r e c t i o nt e c h n i q u ea n dc o r r e s p o n d e dt ot h el a n g r n u i ra d s o r p t i o ni s o t h e r m a l i o n - p a i ra t t r a c t i o np l a y st h ep o s i t i o n - f i x i n g a c t i o no fr b rw i t hp r o t e i n sa n d w h e r e a f t e ri ti n d u c e dac o m b i n a t i o no fm u l t i p l en o n - c o v a l e n tb o n d si n c l u d i n g h y d r o g e nb o n d s ，h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n s a n dv a nd e rw a a l sf o r c e t h ep o s s i b l e b i n d i n gs i t e s ，b i n d i n gt y p e sa n dt y p e so fn o n - c o v a l e n tb o n d s o fr b rw i t hp r o t e i n s w e r er e v e a l e db yi t cs t u d i e sa n dc o r r e s p o n d e dt ot h er e s u l t so fu v - ss p e c t r o m e t r y c o n f o r m a t i o n a lc h a n g eo fp r o t e i n sw e r ed e t e r m i n e db ym e a n so fc ds p e c t r o m e t r yi n p r e s e n to fr b r r b rb i n d i n gr e s u l t e di na ni n c r e a s i n go f t l - h e l i xa n dad e c r e a s i n go f i - s h e e t a n dt h ec o n f o r m a t i o n a lt r a n s i t i o no fp r o t e i n sw e r eh y p o t h e s i z e da n d i l l u s t r a t e d e f f e c t so fp n ，e l e c t r o l y t ea n dt e m p e r a t u r eo i lb i n d i n gi n t e r a c t i o n sw e r e d i s c u s s e d a tt h es a m et i m e ，e f f e c t so fr b ro ne n z y m ea c t i v i t yw e l ed e t e r m i n e d t h i sw o r kp r o v i d e san e ws i g h ti n t ot h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np r o t e i ns t r u c t u r e a n df u n c t i o no nm o l e c u l e a rl e v e l ，w h i c hc a nb cf u r t h e ru s e dt oi n v e s t i g a t et h et o x i c m e c h a n i s mo fo r g a n i cp o l l u t a n t s a tt h e 鞠a l l et i m e ，t h i sw o r kp r o d u c e dan e w a p p r o a c hf o rc h a r a c t e r i z i n gn o n - s p e c i f i ci n t e r a c t i o n so c c u r r i n gi nc e l l sa n do r g a n i s m s i tc a nb cf u r t h e re x t e n d e dt os t u d yt h ee n z y m et o x i c i t yo fe x o g e n o u sc h e m i c a l s u b s t a n c e se g a r o m a t i cp o l l u t a n ta n dd r u g ，a n dt h eh e a l t hr i s km e c h a n i s m k e yw o r d s ：r e a c t i v eb r i l l i a n tr e dx 一3 b ；b o v i n es e r u ma l b u m i n ；l y s o z y m e ；b o v i n e s e r u ma l b u m i n ；n o n c o v a l e n tb i n d i n g ；m o l e c u l a rs p e c t r o m e t r y ；i s o t h e r m a lt i t r a t i o n c a l o r i m e t r y i i 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：m 考芳 洲年 变化：溶液中r b r 的浓度 为0 0 2 5m m o ll - 1 ，随着b s a 的浓度不断增人，吸光度值比不断减少，最后达剑平衡。最 终所有的r b r 都结合到蛋白质上，溶液中不再存在游离态的r b r 。 2 3 3 电解质和温度的影响 为了研究电解质对b s a o r b r 溶液中非共价键的影响，在体系中加入n a n 0 3 ， 结果如图2 3 所示，随着离子浓度的增加，在不同的p h 条件下，r b r 的y 值 总是减少，当离子浓度超过0 2m o ll - 1 时，y 值仅为无离子溶液的一半。离子强 度增大会使亲脂性基团发生自聚，从而使b s a 内部的空间位阻效应增强，这将 不利于r b r 与b s a 的结合。 i ( m 叫l ) t ( o c ) 图2 3 电解质( a ) 与温度( b ) 对y 值的影响：其中r b r 的浓度为0 0 2 5m m o ll 1 ，b s a 的浓度 1 9 第二章活性艳红与牛血清蛋白相互作用 为1 2 0m gl q ：p h 条件：l - p h2 0 3 ，2 - p h3 2 5 ，3 - p h 4 3 5 。 高温可能会对非共价键产生两种相反的影响。一方面，温度的升高会使b s a 分子展开，这种展开效应有利于削弱b s a 分子的三维空间效应，从而有利于有 机分子的结合。另一方面，多肽链的展开效应会导致临近的多肽链之间的距离增 加，导致r b r 的有效结合位点减少，使r b r 更加容易从多肽链上解吸附。这两 种相反的作用决定了温度对非共价作用的最终影响。图2 3 中曲线1 显示丫值变 化较小，这表明在p h 为2 0 3 时这两种效应基本相等；曲线2 显示随着温度的升 高丫值明显减少，说明在p h3 2 5 时，以第二种效应为主；然而，在p h4 3 5 时， 丫值随着温度的增加而增加，该p n 接近b s a 的等电点，在室温下仅有少量的碱 性氨基酸残基能够与r b r 结合，其他碱性氨基酸残基与酸性氨基酸残基以非共 价键的形式结合，随着温度升高，这种非共价键被破坏并释放出氨基酸残基， r b r 才能够通过与碱性氨基酸残基和b s a 结合。 2 3 4b s a - - r b r 复合物的光谱表征 图2 4a 显示了r b r 在b s a 溶液中丫值的变化。由图可知，在r b r 浓度小 于2 5p r n o ll 1 时，丫值总是随着r b r 值的增加而增加，越来越多的r b r 分子结 合到b s a 上，丫值在不同p h 条件下的最大值分别为：p h2 0 5 时，丫= 1 0 5 ；p h3 2 5 时，7 = 8 2 ；p n4 3 5 时，7 - - 3 8 。如果r b r 的浓度大于2 5i x r n o ll 1 ，则表明r b r 与b s a 的结合达到饱和，此时，继续增大r b r 的浓度y 值不会增加。通过等式 ( 5 ) 计算每一种溶液的c l ，溶液的r 1 c l 1 关系参见图2 4b ，这些都具有良好的 线性，因此r b r 与b s a 的聚合遵从l a n g m u i r 等温吸附方程。通过图2 4b 中曲 线的斜率和截距计算r b r 的值和r b r b s a 复合物的k 值，结果如表2 1 。在 不同的p h 条件下，的值总是和值相近。特别是在p h 为2 0 3 时，等于 m 腑，这表明在p h 为2 0 3 时，b s a 值的1 0 2 个氨基酸残基完全质子化，并且 每一个都和r b r 结合在一起直到达到饱和状态。因此，离子对静电吸引作用在 r b r 接近碱性氨基酸残基的过程中扮演分配作用，然后在静电吸引作用下诱发 非共价键结合完成r b r 和b s a 的结合。曲线2 和3 中，值均低于氨基酸残基 的数量，说明只有部分氨基酸残基与r b r 结合。由表2 1 可知k 值在p i t 为2 0 3 时达到最大，说明多肽链在该p h 条件下拥有最多的结合位点。r b r 的潜在结合 位点包括：可以形成氢键的1 - 个- - n = n 基团，1 个- o h 基团，2 个0 3 。基 团，可以形成疏水键的萘基和苯基等。 墨三茎堑丝丝堑量些煎堑旦塑兰堡旦 图2 4 r b r 与1 2 0 m g r 。b s a 溶液在p h2 0 3 ( 1 ) 3 2 5 ( 2 ) 和4 3 5 ( 3 ) 时的y 值变化图 - - h c c 0 7 c h 2 0 蓼“。 豁一 弋 。一“一“ 2 ( 0 h 2 ) 3 二 l c h 一 o ，o4 。叫 图2 5r b r 与氨基酸残基的非共价多位点结合作耳 模拟圉 o n c 叱叱0 o 吣c c c 6，1i 第二章活性艳红与牛血清蛋白相互作用 表2 1b s a r b r 复合物的光度因子的测定 m l e n g t h ，)p h ，萄j 、，3 kx 1 0 5 c o m p l e xf o r m e d b s a6 0 7 1 0 2 2 0 31 0 211 02 1 5 b s a r b r t 0 2 3 2 58 29 01 6 2 b s a 。r b r 娩 4 3 53 84 01 5 0 b s a r b r 3 8 ，) 酉甄西湮写丽西医舔蓊甄甄f 啊两甬豕河万两丽手i 函瓦一 2 3 5 蛋白质二级结构变化 蛋白质独特的空间结构和功能取决于氨基酸残基之间的共价键和非共价键 作用，如果加入有机物，如污染物，药物或者毒物，蛋白质内部的非共价作用将 会被破坏引起原有结构的变化，强的结合配体将会导致结构的不可逆转化并导致 原有功能的丧失。 通常使用c d 光谱来评估蛋白质的二级结构，如蛋白质的p 折叠，o r , 螺旋， d 转角和无规卷曲。在有r b r 存在的情况下，b s a 的二级结构测定结果如表2 2 在没有r b r 的情况下，b s a 的p - 折叠随着p h 值的增加( 2 0 3 1 4 3 5 ) 而减少，而 仅螺旋增加。溶液酸性的增加导致氨基酸残基的质子化并且破坏了原有的内部氢 键。随着e b r 浓度的增加( 0 至0 1 0m m o ll 一，p h2 0 3 ) ，b s a 的1 3 折叠迅速减 少，与此相反的是，o r , 螺旋增加，同样的现象也出现在p h3 2 5 和4 3 5 的条件下。 由此可知r b r 的加入使b s a 的1 3 折叠转化成螺旋构象。可能的原因是带有两个 负电荷的r b r 与1 3 折叠上两个碱性氨基酸残基的对角侧基相结合。静电吸引导 致p 折叠两个侧基围绕r b r 分子旋转，这样，形成p 折叠的两个多肽链之间的 氢键被破坏，然后形成螺旋结构。毫无疑问，呈自由态的碱性氨基酸残基也能够 与r b r 结合。在高浓度( 0 1 0 0m m o ll 1 ) r b r 的溶液中，所有的p 折叠和1 3 转 角都转化为a 螺旋结构，如表2 2 。螺旋卷区与无规卷区之间的间隔缩短，r b r 能够将无规卷区和螺旋卷区的碱性氨基酸残基桥连在一起，从而将无规卷区和螺 旋卷区连接起来，在这个过程中，可熊会有部分无规卷区转化成螺旋卷区。 第二章活性艳红与牛血清蛋白相互作用 表2 2 不同p h 条件下r b r 对b s a 构象的影响 f r a c t i o n ， p h f a c t o r r b r ( m m ol - 1 ) 0 0 00 0 4 0 0 60 0 80 1 0 2 4 小结 本章通过b s a - r b r 相互作用实验证明，非共价结合支持r b r 在b s a 上的 l a n g m u i r 等温吸附，而且在反应最灵敏p h 介质中的结合数与b s a 碱性氨基酸 的个数相符合。由于离子对吸引诱导r b r 与b s a 的结合，其配合物的稳定性取 决于b s a 上活性结合位点的个数。虽然许多蛋白质的晶体结构和可能的结合域 已经测定出来【1 4 4 1 ，但是我们并无法区分蛋白质配体的结合方式和非共价键的键 能。因此，本章中l a n g m u i r 等温吸附与光谱修正技术的联合使用为蛋白质配体 的结合提供了一种新的实验手段。 第三章活性艳红与溶菌酶相互作用 第三章活性艳红与溶菌酶相互作用 了解有机配体生物大分子相互作用对理解细胞内反应包括信号转导、基因调 节、酶动力学有重要意义1 1 4 5 1 ，例如蛋白质蛋白质，蛋白质配体结合【1 4 6 , 1 4 7 1 、酶 催化和抑制反应。生物物理技术可以检测结合的种类并准确表征，因此传统的分 子光谱方法如荧光探针、紫外( u v ) 、圆二色谱( c d ) 等是酶学、药物设计和 毒理学研究的重要工具。最近利用x 射线晶体学、核磁共振【1 4 引、等温滴定微量 热法( i t c ) 【1 伽1 5 5 1 、表面等离子体共振( s p r ) 生物传感器等方法来研究生物大 分子配体的结合机制【l 刈。 溶菌酶( l y s o z y m e ，e c3 2 1 1 7 ) 是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶， 又称细胞壁溶解酶。人们对溶菌酶的研究始于二十世纪初，英国细菌学家弗莱明 发现在人的眼泪和唾液中含有溶解细菌细胞壁的酶，因其具有杀菌作用，故命名 为溶菌酶。此后人们在入和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发 现了溶菌酶的存在，其中鸡蛋白中含有高浓度的溶茵酶。由x 射线衍射分析溶菌 酶含有一条由1 2 9 个氨基酸残基组成的单链 1 5 7 j 。在正常的生理条件下溶菌酶折叠 成紧密的球状结构，在其表面具有一个长的裂缝。溶菌酶由于具有杀菌的作用， 又具有生物相容性好、对组织无刺激、无毒性等特点，在临床上得到了广泛应用， 在治疗五官科的各种炎症、多种皮肤病等方面具有很好的疗效，另外在人体中的 溶菌酶的水平还可以作为多种疾病的临床诊断指标。近年来，人们研究发现，在 免疫球蛋白a 、补体的参与下，溶菌酶还可以水解革兰氏阴性菌如大肠杆菌等 【1 5 8 】，这说明溶菌酶可以和革兰氏阴性细菌的外壁结合，而外壁的主成分为脂多 糖，有可能在某种特定的条件下，溶菌酶也可以分解脂多糖。溶菌酶还可以促进 血液循环和增强人体免疫力。但是外源物质的结合可能影响其水解活性，如果外 源物质可以增加其活性则具有潜在的医学意义1 1 5 9 1 ，如果抑制则可能具有毒性 【1 6 0 1 o r b r 是一种典型的芳基偶氮染料，广泛用于纺织染色。由于其鲜艳的颜色和 快速着色能力，有些不法商贩将其加入食品或化妆品中，因此其可能通过口服或 皮肤吸收进入人体。芳基偶氮化合物可被肠内细菌分泌的偶氮还原酶降解，然后 进一步被胞液酶或肝脏的微粒体降解产生致癌的芳香胺i l 渊。尽管这些偶氮化合 物并非直接的致癌物质，但是它们可能通过分子反应结合并聚集在蛋白质或酶的 表面【1 2 8 1 6 1 ，改变蛋白质功能或酶活性并产生毒性。因此如果r b r 暴露于食品或 化妆品中可能对人体健康产生潜在毒性。本章工作的主要目的是通过u v - v i s 、 c d 和i t c 等技术研究阴离子芳香化合物r b r 对溶菌酶的非共价结合所导致的溶 菌酶结构与活性的影响，这对我们了解有机污染物引起酶毒性和人类健康风险的 第三章活性艳红与溶菌酶相互作用 一般原理具有一定意义。 3 1 材料与方法 3 1 1 实验材料 溶菌酶( e g g w h i t el y s o z y m e ) ：b r ，国药集团化学试剂有限公司。o 1g 溶 茵酶溶于5 0 0m l 水中得到o 2g l 溶液，于4o c 下保存。 活性艳红x - 3 b ( r b r ) ：9 8 ( 乙醇重结晶三次) ，上海染料厂。配s u o 3 5 0 m m o l lr b r 溶液，于4o c 下保存。 n a n 0 3 ：g r ，国药集团化学试剂有限公司。配制5m o f l 溶液，用于离子强 度测定。 b r ( b r i t t o n - r o b i n s o n ) 缓冲溶液：磷酸，乙酸，硼酸( 各o 0 4m o l l ，a r ， 国药集团化学试剂有限公司) ，加入一定体积的n a o h ( o 2m o l l ，a r ，国药集 团化学试剂有限公司) 溶液，得到一系y 0 p h 值的缓冲溶液。p h 值分别为2 0 3 、 2 2 l 、2 7 8 、3 2 5 、3 8 8 、4 3 5 、5 0 4 和5 6 8 ，用以调整溶液酸度以选择高灵敏度 的溶菌酶r b r 配合物。 溶菌酶检测试剂盒：南京建成生物科技有限公司。 以上溶液均使用去离子水配制。 3 1 2 主要仪器 紫外可见分光光度仪：p e r k i ne l m e r 公司，l a m b d a2 5 ，美国； 等温滴定微量热仪：m i c r o e a l 公司，v p i t c ，美国； 圆二色光谱仪：j a s c o 公司，j - 7 1 5 ，日本； 荧光分光光度计：h i t a c h i 公司，f - 4 5 0 0 ，日本； p h 计：上海精密科学仪器有限公司，p h s 2 5 ，上海； 电子天平：m e t t l e rt o l e d o 公司，a l l 0 4 ，瑞士； 电热式恒温水浴锅：上海精衡仪器仪表有限公司，d k - 8 d ，上海； 超声清洗器：上海科导超声仪器有限公司，k u i ) o s ，上海； 冰箱：合肥美菱股份有限公司，b c d 1 9 6 ，合肥； o 5 一l0 止，5 - 5 0 此，2 0 - 2 0 0 i t l ，10 0 - 10 0 0 p l 移液枪：t h e r m of i n n p i p e t t e ， 美国； 1 2 x 5 具塞1 0 m l 比色管：崇明县斜桥玻璃仪器厂，上海。 第三章活性艳红与溶菌酶相互作用 3 2 实验过程 3 2 1 光谱修正法表征 所有实验均在1 0m l 比色管中完成。加入lm lb r 缓冲溶液( p h2 0 3 、3 2 5 和4 3 5 ) ，一定体积的溶菌酶溶液和一定体积的r b r 溶液( 0 3 5 0m m ) 于1 0m l 比色管中，然后用去离子水定容到1 0m l 并混匀。待反应5m i n 后，分别在5 3 9 n n l ( 九2 ) 和5 7 1n l l l ( 九1 ) 下以水为参比测定试剂空白和样品溶液的吸光度值a 、 a 气l 、a x 2 和a 九l 并计算光谱修正参数氏、t 1 和丫。 3 2 2 热力学参数测定 v p v i e w e r2 0 0 0 软件控v p - i t c 微量热仪。i t c 实验操作如下：溶菌酶溶液 ( o 0 1 0m m ，含b r 缓冲液) 置于样品池( 1 4 6 8 5m l ) 中并保持在2 5o c 。r b r 溶液( 1 7 5m m ，含b r 缓冲液) 置于注射器( 2 7 0l a l ) 中并以4p l 每滴的速度， 以3m i n 为时间间隔滴定6 7 次，搅拌速率3 1 0r p m 。为了校正空白溶液的稀释热， 以r b r 滴定样品池中的b r 缓冲液。 3 2 3 溶菌酶二级结构测定 加入1m lb r 缓冲溶液( p h2 0 3 、3 2 5 和4 3 5 ) ，一定体积的溶菌酶溶液 ( 0 0 1 0m m ) 和一系列体积( 分别为0 、0 4 0 、0 6 0 、0 8 0 、1 0 0m l ) 0 5m m o l l 的r b r 溶液于5 个1 0m l 比色管中，然后用去离子水定容到5m l 并混匀。c d 测定采用0 1c m 比色皿，测量波长为1 9 0 2 5 0n l l l ，计算溶液的平均残基椭圆率 ( m l 砸) ，同时以不含r b r 的溶菌酶溶液作为试剂空白校正溶菌酶的m r e 值。 测定时每个样品测定三次并取三次测定的平均值，并计算出每个样品中溶菌酶的 四种二级结构的相对百分比。 3 2 4 溶菌酶活性测定 在p h 2 0 3 ， 3 2 5 和4 3 5 时以传统浊度法【16 2 1 测定r b r 存在条件下溶茵酶 活性的变化根据溶菌酶检测试剂盒使用说明配制试剂：5n a gm i c r o c o c u s l y s o d e i k t i c u 菌粉与2 0 0m l 菌粉溶剂混合配制成菌粉悬浊液( o 2 5m g m l ) 标 准溶菌酶溶液( o 0 1 0m g l ) 和含r b r 的样品溶菌酶溶液配置好后于3 7 0 c 恒温 水浴放置5r a i n 然后取恒温后的样品o 2m l 和2m l 菌粉悬浊液立即加入比色 皿中，并分别于5 秒和1 2 5 秒时以水为参比读取吸光度值( t s o 和瓦2 是标准溶 菌酶的吸光度值，死和乃是含r b r 的样品溶菌酶的吸光度值) 使用说明建议 测定波长为5 3 0n n l ，但是由于在此波长下r b r 有强烈光吸收，故采用7 0 0n n l 为测定波长。样品溶菌酶活性( a ) 以下方程计算： 第三章活性艳红与溶菌酶相互作用 彳：孚1 0 龇2 0 ( 6 ) 菇：一 ”7 3 3 结果与讨论 3 3 1p h 对r b r - 溶菌酶相互作用的影响 r b r 作为一种芳香偶氮化合物，溶于水形成明亮红色溶液，能够与溶茵酶 反应生成紫色产物，该产物的吸收光谱具有明显的红移。图3 1a 是不同p h 条 件下溶菌酶r b r 溶液的吸收光谱。在中性条件下，波峰与波谷之间的差值非常 小，随着酸性的增加，波峰和波谷之闾的差值增大。 可能的原因是酸性氨基酸残基( g l u 与a s p ) 被结合，在蛋清溶菌酶的1 2 9 个 氨基酸残基中有9 个酸性氨基酸残基，18 个碱性氨基酸残基( l y s h i s 和a r g ) 【1 5 7 1 。侧基r 的离解常数如下分别为：l y s - 1 0 5 3 ，h i s - 6 0 0 ，a r g 1 2 4 8 ，a s p - 3 6 5 ， g l u - 4 2 5 。当p h 4 ，- r a s p h 一r 粥p - ，此时几乎所有的碱性氨基酸残基都带 正电，有利于r b r 阴离子与溶菌酶结合。与此相反，当p h i 4 2 5 时，r 6 0 i k , d - i 以及一r a s p - r a s p h 4 ，由于电荷排斥作用，结合速率阻抗将迅速增加。r b r 在碱性条件下以l 2 形态存在，中性条件下转化为h l 。，酸性条件下转化为h 2 l ， p h 值 3 0 ，丫最大值约为1 8 ：当c l 0 c m 0 5 0 ，丫最大值约为1 5 ； 当c l 以 1 0 0 后，丫最大值约为1 2 这表明r b r 与溶菌酶的结合达到饱和。这 些值将在接下来的i t c 实验中检测和校正。在更酸的溶液中，不利于酸性氨基酸 残基( g l u 和a s p ) 形成阴离子侧基，从而使r b r 和多肽链的结合较为容易； 与此相反，形成阴离子侧基将会阻止r b r 分子进入。因此，r b r 的n 值在酸性 溶液中降低。有趣的是，p h2 0 3 时，r b r 的值恰好和溶菌酶中的碱性氨基酸 残基数量相等，这表明r b r 离子和带正电荷的侧基的离子对作用可能就是诱发 第三章活性艳红与溶菌酶相互作用 r b r 与溶菌酶结合的作用力，因此离子对吸引作用可能起位置固定作用。 c j c u o 图3 2 丫值的变化图：溶菌酶浓度2 0 0m g l ，r b r 浓度值不断变化，l p h2 0 3 ，2 - p h3 2 5 ， 3 - p h 4 3 5 。 3 3 3r b r - 溶菌酶反应的热力学参数测定 为了研究溶菌酶- r b r 反应的机理和酸度对反应特征和稳定性的影响，需要 获取详细的热力学参数。i t c 能够通过直接测定反应热提供有关热力学量的参数 【1 5 3 ，1 6 5 1 ，如摩尔焓变。在2 5 。c ，三个不同的p h 值，含0 0 1 0m m 溶菌酶的i t c 反应 池中，注入1 7 5m mr b r 溶液，得到如图3 3 所示的曲线。 由曲线x 1 阱，b ，c ) ，每次滴定之后都能检测到放热，放热量逐渐减少， 直到达到平衡，此时放热等于b r 缓冲液的稀释热，结合达到饱和。每次滴定的 反应热都扣除稀释热得到校正值，稀释热通过将r b r 溶液加入至r j b r 缓冲液中单 独测定。对每一个峰的面积进行积分并校正，作为反应的焓变值( 如图3 3x - 2 ) 。 r b r 与溶菌酶的结合在各个p h 条件下都表现出多级反应的特征，可以推断为二 步反应。当c l d c m 6 ，则释放的热量随着c l d e u o l k 值而增加；第一步总焓变为p h 2 0 3 ，1 7 0k c a l ；p h3 2 5 ，1 5 8k c a l ；p h4 3 5 ，1 4 6k c a l 。由图3 2 中的曲 线l 可知，当c l d c u o - - 6 时，r b r 的实际结合数为p h2 0 3 ，2 ：p l - i3 2 5 ，l ；p h4 3 5 ， l ，因此，p h2 0 3 ，3 2 5 ，4 3 5 时，r b r - 溶菌酶的焓变a h l 为8 5 0 ，一1 5 8a n d 1 4 6 k c a l m 0 1 曲线x 2 表明溶菌酶与r b r 在这一步骤的结合导致熵变减少，溶菌酶 在第一个步骤发生复折叠，这样，r b r 分子就有可能进入溶菌酶的疏水腔内 t 6 6 1 ( 3 4 ，例如，一个r b r 分子通过离子对作用和氢键与溶菌酶上的h 1 5 的侧 第三章活性艳红与溶菌酶相互作用 基结合，通过疏水性的兀兀作用与w 2 8 桥接，其他的r b r 分子可能会通过离子键、 氢键与k 9 6 和i c 0 7 作用，并通过托一1 6 7 l ( 图3 4c ) 与w 6 3 桥接。这些作用能够改 变溶菌酶的结构并导致熵变减少。当c t o c m o 6 时，图3 - 3 中曲线x 2 被拟和为一条 非线性最小平方的s 型。当c 出m 0 6 时，肠，和a h 都能够通过曲线拟合直接由 o r i g i n 软件获得，吉布斯自由能和s 则能够通过等式计算： a g = - r t i n ( k b ) = a l l - t z i s ( 7 ) 其中堤开氏温度，尺是理想气体常数，8 3 1 4jm o l 4k - 1 。r b r 溶菌酶第二步反 应的热力学参数见表1 和图3 5 。与光度法比较发现两种方法获取的值基本一致。 由于a h - l 。i i 以_ ：6 乏r s p y r s p h 4 ，由于电荷 排斥作用，结合速率阻抗将迅速增加。r b r ( l ) 在碱性条件下以l 2 。形态存在， 中性条件下转化为h l 酸性条件f 转化为h 2 l ，p h 值低于i 将会不利于r b r 与蛋白质形成复合物。由图4 la 中曲线i ，可知、p h2 1 9 时，r b r 与蛋白质 的结合最强。为了比较r b r 与h s a 在不同p h 媒介中的反应，本实验使用了三 个口h 缓冲液，分别为p h2 1 9 ，28 6 和33 9 。从图4 1 a 实线得到结合存波长5 7 7 ( k ) 和5 4 2 l q m ( x i ) 时最强，所以选定这2 个波长为工作波长。 实际上人体各组织处的p h 有很大差异，如：胃液p hl - 3 ，阴道液p h3 - 4 ， 十二指肠p h4 5 皮肤p h5 ，血液p h7 4 。从图4 i a 中可得，r b r 与h s a 的 结合虽强的p h 范围与胃液的p h 值相近，因此当r b r 被用作食品添加剂时对胃 中蛋白质或酶的活性影响最为严重。当使用含有果酸或水杨酸的化妆品或接触酸 雨都可使皮肤酸性增加接近以上r b r2 7 蛋白质结合的最佳p h 。当r b r 被用作 化妆品漆加剂时可能对人类健康有更大风险。 w a v e l e n g t h ( n m ) ucoloo( 第四章活性艳红与人血清白蛋白相互作用 图4 1 ( a ) h s a r b r 溶液的吸收光谱图：其中r b r 浓度为0 0 3 5m m o g l ，h s a 浓度为0 0 2 m g m l 。l 一8 ：p h 分别为1 9 6 、2 1 9 、2 5 1 、2 8 6 、3 0 6 、3 3 9 、3 9 0 和4 1 4 ，所有光谱均以 不含h s a 的试剂空白为参比测定； ( b ) h s a - r b r 溶液的吸光度比值( a s 4 2 a m a s r l 衄) 变化： p h2 1 9 ，r b r 浓度为0 0 3 5m m o l l 。 4 3 2h s a - r b r 复合物的光谱表征 r b r ( l ) 与h s a ( 的反应式如下： r 王- nr b r4 - h s a ；= 兰= h s ai r b r ) n i n i t i a t i o n c l e ( a 。地) 钳o 0 e q u i l i b r i u mc l = c t o - n c m o ( a x ，a 妨 钿0 c m o 乱。与c m o 分别是r b r 和h s a 的初始浓度，c l 是r b r 的平衡浓度，凰是以m - 1 为单位的结合常数，是r b r 在h s a 上的饱和结合数，么忿和么朋分别是在如 和九l 两个波长下测定的h s a r b r 溶液的吸光度值。彳。是结合产物的吸光度值， 由公式( 3 ) 计算获得。r b r 的反应结合效率( t 1 ) 以及r b r 与h s a 的摩尔结合比( 丫) 可由公式( 1 ) 、( 2 ) 计算。 测定h s a r b r 溶液在5 7 7 和5 4 2n m 处的吸光度比值，如图4 1b ，随着 h s a 浓度的增加a 5 4 2 m a s 7 7 枷的值减少，h s a 浓度大于0 7 5 i _ t m 后，a 5 伽 a 5 7 7 砌趋于常数1 5 1 。这表明越来越多的r b r 分子结合到h s a 上，直到溶液中 不存在自由态的r b r 分子，因此，最小值就是结合产物的o 【值，在没有h s a 的 情况下，r b r 的d 值与a s 7 7 啪a 5 4 2 姗比值相对应，如曲线b 的开始部分所示。 通过测定一系列包含已知浓度的h s a 的r b r 溶液，使用公式( 1 ) - ( 3 ) 计算可得彳。、 1 1 和丫值。图4 2 中给出了r b r 的y 变化情况，丫随着r b r 浓度的增加而增加，此 外，当e l 抵0 3 5 ，丫趋于以下最大常数：8 3 、7 3 、6 4 ，这表明r b r 与h s a 的 结合达到饱和。h s a 包含9 9 个碱性氨基酸，如：赖氨酸、组氨酸、精氨酸【1 9 s 】 和9 8 个酸性氨基酸，如：谷氨酸和天冬氨酸。如果两个碱性氨基酸位置相邻， 由于空间位阻效应，则r b r 只会与其中一个碱性氨基酸相结合，如：h 9 和r 1 0 、 h 1 0 5 和k 1 0 6 。在p h2 1 9 时r b r 的理想最大结合数接近碱性氨基酸的数目， 这表明r b r 离子和带正电荷的侧基的离子对作用可能就是诱发r b r 与h s a 结 合的作用力。离子对吸引作用起位置固定作用，赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬 氨酸和谷氨酸侧基( r 5 ) 的离解常数( p k r ) 分别为l o 5 3 、6 o o 、1 2 4 8 、3 6 5 、 4 2 5 。当p h 小于6 o o 时几乎所有的碱性氨基酸侧基都带正电，例如：- n h 3 + ， = n h 2 + 和 n h 2 + 。因此有利于r b r 阴离子的与其发生静电结合。但是只有当 p h 远小于3 6 5 时天冬氨酸的侧基才会以- c h 2 c o o h 形式存在。一c h 2 c o o 离子 第四章活性艳红与人血清白蛋白相互作用 在h s a 中占很大一部分比例，它们会排斥r b r 阴离子的结合。因此随p h 的增 大值减小。当c l d c u o 1 0 0 时我们观察到h s a 的沉淀现象，如果震荡比色管 使其混匀的话沉淀又会消失，这可能是由于过量的r b r 分子通过静电作用桥连 在h s a 上形成了一个超分子的聚合物，因此本实验中采用的c l 0 c u 0 比值均小于 1 0 0 。 0 l o ( t t m o l i ) 图4 2y 值的变化图：h s a 浓度2 0 0m g l ，r b r 浓度值不断变化( 0 3 5 7 0t t m o l l ) ，1 p h 2 1 9 ，2 - p h2 8 6 ，3 p h3 3 9 4 3 3 电解质和温度的影响 非共价键作用的稳定性总是受到多种环境因素的影响，例如p h 、离子强度 和温度【1 7 伽”2 1 。p h 的影响在前文中已经有详细论述。离子强度对h s a - r b r 反应 中r b r 的丫值的影响如图4 3a ，随着离子浓度的增加，不同p h 条件下的丫值都 减少。例如p h 分别为2 1 9 ，2 8 6 ，3 3 9 时，在1 0m o f l 的离子强度下，7 仅为 没有电解质时y 的3 0 。这可能是因为德拜休克尔效应，德拜长度与离子强度的 平方成反比【1 7 3 ，7 4 1 。从图4 3a 中曲线1 3 可得，在0 1 5m o l l n a c i 生理条件下， 1 r 值在7 0 和8 0 之间，因此血液中离子强度会阻碍r b r 与h s a 的结合。 我们同时也研究了温度对结合作用的影响。从图4 3b 中可以看出，在生理 温度3 7o c 时的丫值与2 0o c