（生物医学工程专业论文）纳米金对聚合酶链式反应的影响及其机制研究.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) i so n eo ft h em o s tp o p u l a ra n di m p o r t a n t t e c h n o l o g i e si nb i o l o g ya n dm e d i c i n e d n am o l e c u l e sc a nb ea m p l i f i e db yt h i st e c h n i q u e ， a n dc a nb eu s e df o rf u t h e ra n a l y s i s w i t ht h ed e v e l o p e m e n to fn a n o t e c h n o l o g ya n di t c o m b i n e sw i t h b i o l o g i c a lt e c h n i q u e s ，i t m e e tw i t hac h a n c ef o rr a v e lo u ts o m e i n c o n v e n i e n c e si n b i o l o g i c a lt e c h n i q u e s i n t h i s p a p e r , w es t u d yt h ee f f e c to fg o l d n a n o p a r t i c l e so nt h ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( p c r ) a n di n v e s t i g a t ei t sm e c h a n i s m t h e r e s u l t ss u g g e s tt h a t ： 1 g o l dn a n o p a r t i c l e st e n dt oi n h i b i tt h ep c r ，a n dt h ei n h i b i t i o nd e p e n do nt h ea m o u n t o fg o l dn a n o p a r t i c l e s t h em o r et h ea m o u n t a m p l i f i c a t i o ny i e l d sw e r eh a r v e s t e d 2 i n c r e a s i n gt a qd n ap o l y m e r a s ec a n i n c r e a s i n ga n yo t h e rp c ri n g r e d i e n t s ( m d + 、 o fg o l dn a n o p a r t i c l e sw a su s e d ，t h el i t t l et h e e l i m i n a t et h ei n h i b i t o r ye f f e c to fp c r ，w h i l e d n t p 、p r i m e r 、d n at e m p l a t e ) c a nn o tw o r k 3 a l t h o u g ht h ei n h i b i t o r ye f f e c tc a nb er e v e r s e db yi n c r e a s i n gt a qd n ap o l y m e r a s e ， t h ep c ri ss u p p r e s s e da g a i nb ya d d i t i o no fm o r eg o l dn a n o p a r t i c l e s w h e ni n c r e a s i n gt a q d n a p o l y m e r a s e ，t h ei n h i b i t o r ye f f e c tc a nb er e m o v e do n c ea g a i n t h u st h ei n h i b i t o r ye f f e c t i sc a u s e db yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ng o l dn a n o p a r t i c l e sa n dt a qd n a p o l y m e r a s e 4 t h ei n h i b i t o r ye f f e c tc a nb er e v e r s e db ya d d i n gb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) i t i n d i c a t e st h a tb s aa n dt a qd n a p o l y m e r a s ei n t e r a c tw i t hg o l dn a n o p a r t i c l e sc o m p e t i t i v e l y 5 t h er e s u l t so fu v - v i ss p e c t r u m ，d i s t r i b u t i n gs p e c t r ar e s p e c t i v e l ys h o w st h a tt h e a b s o r p t i o ns p e c t r u ms h i f t sf r o m5 18 n mt o5 2 7 n m ，t h eg o l dn a n o p a r t i c l e sb e c o m e l a r g e r , a n d a n dx - r a yp h t o e l e c t r o n i cs p e c t r u m ( x p s ) a p p e a r sa ua n dnp e a k ，t h o s ei n d i c a t e dt h a tb o t h b s aa n d t a qd n ap o l y m e r a s ei n t e r a c t e dw i t hg o l dn a n o p a r t i c l e s 6 t h ec i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d ) d a t as h o w st h a tt h ec o n f o r m a t i o no fb s ai sc h a n g e d a f t e rc o n j u g a t i o n ，a n dt h ec o n f o r m a t i o nc h a n g ei sb i g g e ra th i g h e rc o n c e n t r a t i o n so fg o l d n a n o p a r t i c l e s 7 w ep r o p o s et h ep o s s i b l em e c h a n i s mt h a t g o l dn a n o p a r t i c l e s e f f e c tp c r ：t h e c o n f o r m a t i o no f t a qd n ap o l y m e r a s ec o u l db ec h a n g e db yg o l dn a n o p a r t i c l e s ，t h ea c t i v i t yo f p o l y m e r a s em a yb ed e c r e a s e d ，l e a d i n gt os u p p r e s s i o no fp c r k e yw o r d s ：g o l dn a n o p a r t i c l e s ；p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ；p c r ；i n t e r a c t i o n 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为() 课题( 组) 的研究成果，获得() 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在() 实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签名) 鸯癣 砂0 8 年7j qf o 日 l 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 ( ) 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“”或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) 套辉 怠、，o 薄7 月r ee l 第一章绪论 1 1p c r 技术简介 第一章绪论 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 是2 0 世纪8 0 年代发展起来的 一种体外核苷酸扩增技术【卜5 1 。1 9 8 5 年m u l l i skb 等首先建立了p c r 方法并成功体外 扩增了d n a 序列，但是他们使用的大肠杆菌d n a 聚合酶i 不能耐受使d n a 变性的 高温，所以每一轮反应都需添加新的酶，产量不高且操作繁复，使得这种实验方法难 于推广。1 9 8 8 年s a i k ir k 【4 】等将一种热稳定的d n a 聚合酶( t a q 酶) 引入到p c r 体 系，大大提高了p c r 的扩增效率，并且使p c r 方法易于自动化进行。到了1 9 8 0 年末， p c r 已经成为遗传与分子生物分析的根本基石。由于p c r 技术可以简易、快速、高效 的扩增出目的d n a 片段，为d n a 测序和其他分子生物学研究带来了前所未有的希望 和曙光，因此它被广泛的使用并且得以迅速的发展，至今已成为生物医学领域最常用、 最重要的技术之一。 虽然p c r 技术可以快速特异的在体外扩增目的d n a 片段，但是其工作原理【6 】( 见 图1 1 ) 并不复杂，主要包括：1 ) 变性( 9 0 9 5 ) 双链d n a 模板在热作用下，氢 键断裂，形成单链d n a 模板；2 ) 退火( 4 0 - 6 5 ) 系统温度降低，引物与d n a 模 板结合形成局部双链；3 ) 延伸( 7 0 - 7 5 ) 在t a qd n a 聚合酶( 在7 2 左右具有 最佳活性) 的作用下以d n t p 为原料，靶序列为模板，从引物的5 端到3 端延伸，合 成一条与模板互补的d n a 链。 厦门人学硕十学f 寺论文 第 双链模板 iilfllllllllllllllllllllllllllllllll11|t 笆 j 变性 h i i i i i i i i i i 兀1 i 丌丌r i 丌几n l i i i 兀几丌几r r u ul j ul j u u u 山u u u u u u ul j u 山 次 l退火 循皿皿皿皿 环面商= 延伸 圃皿皿皿皿皿姗i 皿皿圃皿圃皿圃 变性 貉r 循 i 环= 盂! 皿匝皿珊匝皿皿皿皿皿皿皿皿皿 丁一退火 一 卫田 田叮皿 延伸 图1 - 1 聚合酶链式反应( p c r ) 原理示意图1 6 i f i g u r e1 - 1p r i n c i p l eo fp c r p c r 以其巧妙的设计原理表现出如下特剧舡8 】：1 ) 高特异性。p c r 扩增严格遵守 碱基配对原则的半保留复制，其新合成的子链与模板形成完全互补的结构，从而充分 保证了复制的准确性。另外，由于碱基互补原则，只有当引物与目的基因完全互补时， 反应体系中的引物才能与模板产生复性，引物的延伸才得以进行，因此引物与模板的 互补是复制的最基本条件，这从另一方面决定了p c r 反应的高特异性。2 ) 高灵敏度。 在p c r 反应中，每一轮反应模板拷贝数都增加一倍，理论上n 次循环后，扩增产物拷 贝数为2 n - 1 。但在p c r 反应后期由于底物的消耗、t a q 酶活力的下降、p c r 抑制物的 增加，p c r 反应的指数形式逐渐转化为线性形式进入扩增的平台期，实际上经过3 0 3 5 个循环，扩增倍数仍然可达百万倍以上。3 ) 简便快捷。t a q 酶的使用和各种高效p c r 仪的相续问世，使p c r 操作可以在常规实验室中顺利完成。在实际应用中，许多技术 得到改进，如扩增反应体积减少、多种成分预先混合，大大简化了加样步骤，一般在 1 2 小时完成扩增反应，满足了快速诊断等方面的要求。 1 1 1 p c r 技术存在的问题【6 - 8 】 尽管p c r 已发展成为一项相当成熟的技术，但在实际应用中，p c r 技术尚存在一 些需要改进的问题：1 ) 污染问题。由于p c r 具有高灵敏度，因此操作不当或其他污 2 第一章绪论 染容易造成假阳性结果出现；而如果d n a 模板处理不好，导致p c r 抑制物进入反应 体系，又会出现假阴性结果。2 ) 非特异性扩增问题。非特异性扩增在后续的电泳检 测中表现为，出现与目的片段大小不一致的条带或者出现片状拖尾带或涂抹带。尤其 当扩增富含g c 的d n a 片段4 1 、长片段d n a 1 5 1 或者从复杂的基因组中扩增低拷贝数 的d n a 片段h ，1 6 ，1 7 1 时这一现象尤为明显。近年来，生物医学的发展又为p c r 技术提 出了新的要求，例如复杂基因组的筛查、疾病的预防及早期诊断、法医鉴定、生物反 恐等要求p c r 技术在保持高度特异性的基础上，还应具有高度的灵敏度和更高的检测 速度。 1 1 2 p c r 常用优化方法1 6 - 8 1 为了能够获得高产量的特异性产物，常需对p c r 进行优化，常用的优化方法有： 1 ) 调整p c r 各组分的用量，如m 9 2 + 浓度、t a q 酶的浓度、引物的浓度和三磷酸脱氧 核苷酸( d n t p ) 的浓度等。2 ) 调整p c r 的反应条件，如时间、温度、循环数等。3 ) 在p c r 体系中引入添加剂，如甲酰胺、二甲基亚砜、甘油、甜菜碱等。 1 1 3 p c r 各组分对p c r 的影响1 6 。8 i ( 一) 反应缓冲液对p c r 的影响 反应缓冲液提供p c r 反应所必需的合适的酸碱度和某些离子。目前，最常用的缓 冲液是 i r i s h c i ( p h8 3 8 8 ，2 0 ) ，其一般体系为：1 0 0m m o l l t r i s h c l ( p h8 3 8 8 ， 2 0 ) ，5 0m m o l lk c l 。 i r i s h c l 用于调节反应体系的p h 值，因为p h 的高低直接影 响t a q 酶的活性和保真性能1 8 】，而合适浓度的k c l 有利于引物与模板退火。 ( - - ) m 9 2 + 浓度对p c r 的影响 所有的热稳定d n a 聚合酶都要求有游离的二价阳离子，通常是m 9 2 + 用于激活， 因此它的浓度对于p c r 反应具有至关重要的影响。如果m g + 浓度过低，就会降低t a q 酶的活性，使扩增产物减少；如果m 9 2 + 浓度过高，则易出现非特异性扩增产物，降低 反应的特异性【1 9 。2 2 】。此外，p c r 反应体系中的d n a 模板、引物和d n t p 磷酸基团均可 与m 9 2 + 结合，从而降低m 9 2 + 的实际浓度，因此在p c r 系统中确定m g + 的最适浓度是 必要的。最适m 9 2 + 浓度可通过比较多个系列p c r 反应试验所获得的产物量和特异性 厦门人学硕十学位论文 来确定，缓冲液中m 9 2 一浓度从0 5m m o l l 丌始，以0 5m m o l l 的增幅逐步增加，选 出最适的m g + 浓度。 ( 三) t a qd n a 聚合酶对p c r 的影响 t a qd n a 聚合酶的相对分子质量为9 4k d ，其最适的活性p h 值为8 3 8 5 ，最适 的活性温度是7 2 ，而且这种活性有明显的温度依赖性。通常1 0 0 1 t l 的反应体系中， t a qd n a 聚合酶的用量为o 5 - - 5 个单位，浓度过低则扩增产物量较少，浓度过高则易 导致非特异性扩增，这主要与t a qd n a 聚合酶缺乏3 一5 核酸外切酶活性有关【2 3 ，2 4 1 。 ( 四) 三磷酸脱氧核苷酸( d n t p ) 对p c r 的影响 标准p c r 反应体系中，包含4 种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即d a t p 、d t t p 、 d c t p 和d g t p 。d n t p 的质量与浓度和p c r 扩增效率密切相关。d n t p 原液在冷冻与 融化时，容易损坏d n t p 的结构而丧失生物学活性，因此购得的d n t p 原液最好分装成 小份，贮存于- - 2 0 冰箱内，避免反复冻融。若长期在- - 2 0 下冻存，储存液中的 少量的水分会蒸发，然后凝结在小管内壁上，因此储存d n t p 溶液的小管在融化后应 在离心机中离心数十秒，以减少d n t p 浓度的变化。在p c r 反应中，4 种d n t p 的摩 尔浓度要相等，如其中任何一种浓度不同于其它几种时，则会引起错配。低浓度的d n t p 虽然可提高精确性，但会降低反应速度和扩增产物的量；高浓度的d n t p 会对扩增反 应起抑制作用，可能是d n t p 与m 9 2 + 螯合所致【2 5 1 。 ( 五) 模板对p c r 的影响 p c r 反应的模板可以是d n a ，也可以是r n a 。当用r n a 作模板时，需先经过逆 转录生成e d n a 后才能进行p c r 反应。含有靶序列的模板d n a 可以单链或双链的形 式加入p c r 反应体系中。闭环d n a 模板的扩增效率略低于线性d n a 。尽管模板d n a 的长短不是p c r 扩增的关键因素，但当使用高分子量的d n a ( 1 0k b ) 作模板时， 如用限制性内切酶先进行消化，则扩增效果更好。模板d n a 的数量与纯度，是p c r 成败与否的关键环节之一。一般而言，哺乳动物、酵母、细菌与质粒d n a 作为p c r 模板时，每个反应中典型的模板数量依次为lug 、1 0n g 、1n g 和1p g ，即可获得满 意的扩增效果。传统的d n a 抽提方法通常采用s d s 、蛋白酶k 、苯酚和氯仿等试剂。 s d s 、苯酚、氯仿可以使蛋白质变性，如果纯化不当，残留的上述物质也可使t a q 酶变 4 第一章绪论 性，从而导致扩增产率过低或扩增失败【2 6 。蛋白酶k 能水解消化蛋白质，如果有较多 的残留，也可消化t a q 酶，从而导致扩增产率过低或扩增失败。模板d n a 中含有的污 染物或残留的其他成分如亚铁血红素【2 7 】、肝素【2 8 3 1 1 、巩膜和玻璃体成分旧等也可抑制 p c r 的扩增。因此，在进行p c r 扩增之前，对模板d n a 纯化，是必不可少的一环。 ( 六) 引物对p c r 的影响 尽管有多种因素可以影响p c r 扩增的效率与特异性，但最关键的因素要数寡核苷 酸引物的设计。精心设计的引物可以获得高产率的特异性产物，便于扩增产物的后续 操作。理想的引物应当具有如下特点：1 ) 长度。引物与模板互补的区域应该1 5 3 0 个核苷酸长度，上下游引物的长度差别不能大于3b p 。2 ) 碱基组成。g + c 含量应在 4 0 和6 0 之间，4 种碱基要在引物中分布均匀，避免多聚嘌呤和多聚嘧啶的序列，并 且没有二核苷酸重复序列。3 ) 引物的特异性。引物应与核酸序列数据库的其他序列 无明显同源性，否则会出现非特异性扩增。4 ) 上下游引物的互补性。避免两条引物 间互补，特别是3 端的互补，否则容易形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带，并 且抑制目的d n a 的扩增。5 ) 解链温度( t m ) 。计算出来的两个引物的t m 筑栩茬1 i 能 人j ：5 ，扩增产物的t m 值与引物的t m 值相差不能大于1 0 ，这些特性保证了扩 增产物在每个p c r 循环可有效地变性。6 ) 3 末端特性。3 末端的性质非常关键，如 果可能的话，每个引物的3 末端碱基最好为g 或者c ，但是不推荐使用x x g c 或x x c g ，因为末端g c 碱基高的自由能容易形成发夹结构，还可能产生引物二聚 体。标准p c r 反应体系中，每条引物浓度的一般为o 1 0 5p m o l l ，这一浓度足以扩 增l k b 的d n a 片段至少3 0 个循环。引物浓度过低则使扩增产物的产量较低，引物浓 度过高可能会引发错配，导致非特异性扩增。 1 1 4 反应条件对p c r 的影响。锚l p c r 是种级联反复循环的d n a 合成反应过程。一般由三个步骤组成：模板的热 变性，引物复性到单链靶序列上以及由热稳定d n a 聚合酶催化的复性引物引导的新生 d n a 链延伸的过程。 ( 一) 变性温度与时间对p c r 的影响 双链d n a 模板的复性温度由其g + c 的含量决定。g + c 的含量越高，模板d n a 厦门人学硕十学位论文 的熔解温度( t m ) 也越高。在选择的变性温度下，d n a 分子越长，两条链完全分丌所 需的时间也越长。如果变性温度过低或时间过短，模板d n a 解链不完全，容易导致 p c r 扩增失败。在使用t a q 酶进行p c r 反应时变性往往在9 4 9 5 条件下进行，这是 t a q 酶进行3 0 个或3 0 个以上p c r 循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最高温 度。对于g + c 含量为5 5 或更低的线性d n a 模板，常规的变性条件是9 4 9 5 变性 4 5s 。 ( 二) 退火温度与时间对p c r 的影响 复性过程( 即退火) 采用的温度至关重要。退火温度与时间，取决于引物的长度、 碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。如果退火温度过高引物不能与模板很好的 复性，扩增效率将会非常低。如果退火温度过低，将产生非特异性的扩增产物。退火 温度通常比理论计算的引物和模板的熔解温度低3 5 的条件下进行，也常通过对复 性温度比引物的熔解温度低2 1 0 的范围内进行系列预实验优化复性条件。通常在 t m 值允许范围内选择较高的复性温度以提高p c r 反应的特异性。 ( 三) 延伸温度与时间对p c r 的影响 p c r 反应的延伸温度一般选择在7 0 - 7 5 之间，因为在此温度范围内t a q 酶具有 最佳的活性，常用温度为7 2 。在最适反应温度下，t a q 酶的聚合速率约为2 0 0 0b p m i n 。 一般情况下，每1 0 0 0b p 的扩增产物的延伸时间被设计为1m i n ，以此类推。延长延伸 的时间并未使p c r 的产量得到明显的改观。 ( 四) 循环数目对p c r 的影响 p c r 扩增所需的循环数目决定于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩 增的效率。一旦p c r 反应进入几何级数增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分 成为限制因素。从这一点来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物，而非 特异性的扩增产物应该低到难以检测到的程度。用t a q 酶( 效率为0 7 ) 在一个含有1 0 5 个拷贝数的靶序列的反应体系中进行3 0 个循环后，往往可以做到上述的理想情况。循 环次数太多，由于底物的消耗、t a q 酶活力的下降、p c r 抑制物的增加，将会出现非 特异性扩增产物。而且循坏次数太少，扩增的产物会太少。 对于大多数的p c r 反应，通过调整上述参数，就可以成功的扩增。但是对于富含 6 第一章绪论 g + c 的模板和含有相对稳定二级结构的模板来说，单独调整上述参数，依然存在扩增 效率低下，甚至不能成功扩增的现象。为了解决上述问题或者提高p c r 的扩增效率， 经常在p c r 体系中引入一些添加剂，比如二甲基亚砜( d m s o ，1 1 0 ) 3 3 - 3 5 】、甘油 ( 1 1 0 ) 3 6 , 3 7 】、甲酰胺( 1 2 5 1 0 ) 1 4 , 3 8 】、氯化四甲胺( t m a c ，6 0m m ) t 3 9 , 4 0 】、非离 子去垢剂( 比如t w e e n2 0 和t r i t o nx 1 0 0 ，o 0 5 0 1 ) 4 1 】和甜菜碱( 1 3m ) 【9 ，4 2 , 4 3 】 等。但是许多高浓度的添加剂甚至可以抑制p c r ，因此对于不同浓度的引物和模板d n a 组合，应通过经验来确定其最适浓度。 1 2纳米金的背景知识介绍 纳米金( n a n o g o l d ) 是指直径在1 - 1 0 0n n l 范围之内金微小颗粒。由于表面原子数、 表面能和表面张力随粒径的下降急剧增加，纳米粒子表现出表面效应、量子效应、小 尺寸效应和宏观量子效应等特征，从而导致纳米粒子在光学、磁学、电学、热学、力 学以及化学活性等方面的性质与本体物质有显著的差异。 1 2 1 纳米金的特性 纳米金一般为分散在水溶液中的溶胶，故又称胶体金，它具有如下特性【4 4 ，4 5 】：1 ) 光吸收性。纳米金在5 1 0 5 5 0n l n 可见光谱范围之间有一吸收峰，最大吸收波长随着 金颗粒直径的增大而增加。2 ) 呈色性。即不同粒径的纳米金表现出不同的颜色。小 粒径的纳米金( 2 5n m ) 呈现黄色，中等粒径的纳米金( 1 0 2 0n m ) 呈现酒红色，较 大粒径的纳米金( 3 0 - 8 0n m ) 呈现紫红色。依据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色 可粗略估计金颗粒的大小。3 ) 具有胶体的性质。由于纳米金为微小金颗粒稳定地、 均匀地、单一地分散在溶液中的胶体，因而具有胶体的多种特性，特别是对电解质的 敏感性。电解质能破坏胶体金颗粒的外周永水化层，从而打破胶体的稳定状态，使分 散的单一金颗粒凝聚成大颗粒，从溶液中沉淀下来。某些蛋白质、d n a 等大分子物质 有保护胶体金、增强其稳定性的作用。4 ) 表面吸附特性。 纳米金多许多生物大分子 都有很强的吸附作用，而且吸附后不会使生物大分子变性，利用纳米金的这一特性可 将其用作生物标记物和药物释放载体。此外，d n a 经巯基化后可以固定在纳米金的表 面，制备成d n a 探针，将其浸入待测液中，即可测定待测液中的靶d n a ，利用这一 特性可将其制作成生物探针或生物传感器。 厦门大学硕十学位论文 1 2 2 纳米金的制备 金纳米微粒的制备方法分为化学法和物理法【4 叭。化学法是以金的化合物为原料， 利用还原反应生成金纳米颗粒，通过控制还原剂的用量控制粒子的大小。氯金酸 ( h a u c l 4 ) 是常用的还原材料，常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、 硼氢化钠等。根据还原剂的类型、还原作用的强弱以及还原剂的用量，可以制备不同 粒径的纳米金。物理法是利用各种技术如电阻加热法、等离子体加热法、激光加热法 等将块状固体金分散为金纳米微粒。 1 2 3纳米金的表征 为了检测纳米金的粒径大小和分散均匀度，常用下列方法进行表征：扫描电子显 微镜( s e m ) 、透射电子显微镜( t e m ) 、扫描隧道显微镜( s t m ) 、原子力显微镜( a f m ) 、 粒径分析仪、紫外可见吸收光谱等。对于纳米金的表征有时也会用到其他的方法，比 如x 射线衍射( x r d ) 、电子衍射、电子自旋共振( e s r ) 、核磁共振( n m r ) 、红外光谱 ( i r ) 、表面增强拉曼散射( s e r s ) 、光电子能谱( x p s ) 、z e t a 电位仪、荧光光谱等。 1 2 4 纳米金在生物医学领域的应用| 4 4 l ( 一) 纳米金在生物标记领域的应用 纳米金被当作生物标记物使用始于2 0 世纪7 0 年代初，这主要是因为纳米金可以 迅速的吸附蛋白质，而蛋白质的生物活性无明显改变，因此被用于标记细胞表面和细 胞内的的蛋白质、多肽、抗原等生物大分子，纳米金标记技术己成为现代四大标记技 术之一。纳米金标记技术具有如下优点：1 ) 纳米金颗粒在电子显微镜下具有很高的电 子密度，颗粒清晰可辨，且不影响原有超微结构的观察。2 ) 通过计量被检部分的金颗 粒，可以对被标记物质进行定量研究。3 ) 可以采用不同粒径的纳米金进行双重或多重 标记，能在一张电镜图片上同时显示两种或多种被检测物质的超微结构。1 9 7 1 年，f a u l k w p 等将纳米金颗粒与兔抗沙门氏菌血清结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌 的表面抗原，开创了纳米金标记技术。1 9 8 9 年，s p i e l b e r gf 等发展了以纳米金为标记 物用于检测艾滋病病毒抗体的渗滤试验，确立了纳米金免疫渗滤法的基本技术。这种 技术具有简便快捷、灵敏准确、成本低廉等特点已被广泛使用，至今已经可以检测人 绒毛膜促性腺激素( h c g ) 【4 7 1 、乙肝表面抗原( h b s a g ) 4 8 1 、肉毒杆菌神经毒素d 【4 9 1 、 8 第一章绪论 黄曲霉毒素b l 5 0 】、流感病毒a 和b 、呼吸道合胞病毒旧等。 ( - - ) 纳米金在生物传感器领域的应用 生物传感器由生物识别元件和信号转换器组成，它能够选择性地对样品中的待测 物发出响应，通过信号转换器把待测物质的浓度转换为可检测的其他信号，通过信号 的大小测出待测物质的浓度。生物传感器具有专一性强、灵敏度高、样品用量小、响 应速度快、操作简单易自动化、经济简便等特点，同益受到推广使用】。纳米金由于 具有优良的光学和电学性能，因此在此领域被广泛的研究。美国西北大学教授c h a d a m i r k i n 领导的工作小组【5 3 - 5 8 在此领域做出了卓越的贡献。他们实验的基本原理如下： 将巯基化的d n a 固定于纳米金颗粒的表面，然后将d n a 杂交技术和金纳米粒子间距 不同所呈现的颜色不同的特性巧妙地结合，通过检测杂交体系的颜色和紫外可见吸收 光谱的变化，实现d n a 错配的检测。基于纳米金的生物传感器被广泛用于检测葡萄糖 【5 9 1 、1 3 牛乳糖删、乙酰胆碱酶【6 l 】、刀豆蛋白“6 2 1 等物质。 ( 三) 纳米金在药物释放系统中的应用 药物制剂的给药途径与方法对药物作用至关重要。传统医学中的口服给药，由于 首关效应的影响，药物的利用率低下。注射给药，药物分布于全身循环系统，只有少 量的药物才能到达病灶，而且时常伴有毒副作用。提高药物的利用率和疗效、降低药 物的副作用一直是医药领域的重要研究课题，纳米药物载体的研究有效的解决了这一 问题。纳米金对蛋白质、d n a 等有很强的吸附功能，而且不会改变被吸附物质的性质， 作为性质优良的药物载体也被广泛的研究【6 3 。6 8 1 。“jy 等【6 8 】的研究发现，用3 巯基丙 酸修饰的纳米金作为抗肿瘤药物载体，可以有效的提高抗肿瘤药物的药效。p h a d t a r e ，s 等晔】的研究发现，将胃蛋白酶固定于纳米金膜后，胃蛋白酶在反应介质中仍易于分离， 且其催化活性未受到影响，重复使用1 0 次后，仍保持良好的生物活性。 1 3纳米金对p c r 的影响 传统方法改善p c r 技术的空间越来越小，近年来，随着纳米技术的蓬勃发展，以 及与生物技术的相互融合渗透，为解决p c r 中存在的问题提供了新的思路和方法。2 0 0 5 年，l ihk 【6 9 1 、l im 等将纳米金作为新型的添加剂引入到p c r 体系，为改善p c r 技术丌创了新局面。 9 厦门人学硕十- 托论文 “h k 等的研究发现，台适浓度的纳术会( 0 2 - 0sn i i l o l l + ) 对于改善巢式p c r 的 非特异| 生扩增具有显著的作用。他们将p c r 的扩增产物作为模板采用相同的引物进 行扩增。通常情况下，第二轮扩增非常容易产! e 非特性产物。坦是在该体系中加入合 适浓度的纳米金，原有的非特异性扩增得到了是著的改善，结果如圈i 2 所示，泳道 m 代表m a r k e r ，泳道1 和泳道2 为没有加入纳米会的对照组，泳道3 和泳道4 为加入 纳米金的优化组，其中纳米盒的浓度为0 4n m o l l ，直径为1 0n m 。 2 0 0 0 1 0 0 0b d 71 5 , o 呻 f , o ob d 2 呐 如o b 口 图1 - 2 纳米金对p c r 特异性的影响 f i g u r e l - 2 t h ee f f e c to f g o l dn a n o p a r t i c l e so n t h es p e c i f i c i t yo f p c r 他们在文中对纳米金浓度与p c r 特异性的关系进行了研究结果发现，当纳米金浓 度在合适的范围内( 02 - - 08n m o l l ) 时，其非特异性产物越来越少，然而较高浓度的 纳米金( 10n m o l l ) 对p c r 扩增具有抑制作用。结果如图1 - 3 所示泳道m 表示m a r k e r ， 泳道i “纳米金的浓度依次为；0 6 、0 、0 2 、0 4 、0 8 、1 0m n o l l 。 对于传统的p c r 扩增来说，为了提高目标产物的产量通常需要降低退火温度而 要得到高特异性的产物，则需要常需要提高退火温度，这是一对很难调和的矛盾。l ih k 的研究发现，在p c r 扩增体系中加入纳米金能够在较低的退火温度下依然保证p c r 扩增产物的特异性。结果如图1 - 4 所示，泳道m 表示m a r k e r ，泳道l 、3 、5 、7 表示 j 乜火温度分别为2 5 、3 0 、3 5 ，4 0 时没有加入纳米金的对照组泳道2 、4 、6 、8 表 示退火温度为2 5 、3 0 、3 5 、4 0 时加入纳米金的优化组，其中纳米金的浓度为0 4 n m o l l 。 第一章绪论 图1 - 3 不同浓度纳米金对p c r 特异性的影响删i f i g u r e l - 3 t h ee f f e c to f t h ec o n c e r t r a t i o no f g o l d n a “0 p a 州c k s o n t h es p e d f i c i t y o f p c r t | o o o b p 5 0 0b o 2 嘶 图l - 4 不同退火温度对p c r 特异性的影响例 f i g u r e l - 4 t h ee f f e c t o f t h ea n n e a h n g t e m p e r a t u r eo n t h es p e c i f i c i t yo f p c r “hk 等对这一现象做出了如下解释：纳米金具有与单链结合蛋白相似的功能， 特异性的与单链d n a ( s i n g l es t r a n dd n a ，s s d n a ) 结合提高了p c r 的特异性。他们 认为虽然四种碱基( a 、g 、c 、t ) 含有的氮原于可以与纳米金相互结合，但是双链 d n a ( d o u b l es t r a n dd n a ，d s d n a ) 带有较多的负电荷，与被柠檬酸根离子包裹带有 负电荷的纳米盒容易互相排斥。同时d s d n a 具有较强的刚性，不易缠绕在纳米金的表 面，而s s d n a 则具有较低的电荷密度和一定的柔性，则易于和纳米金结台。 “m 等l 刈也将纳米金作为新型添加剂引入p c r 体系，他们的研究发现，纳米金不 但提高了p c r 的扩增效率，而且可以把p c r 反应所需时间缩短到原来的1 6 。另外， 他们还使用快速热循环p c r 仪( 升降温速度为2 0 c s ) 和普通热循环仪( 升降温速度 器黧 厦门人学硕十学位论文 为2 。c s ) 扩增不同大小的d n a 片段，结果发现，在纳米金存在的条件下快速热循坏 仪p c r 扩增效果明显优于普通热循环p c r 仪。用实时p c r 仪检测p c r 的扩增效率， 结果发现，加入纳米金后p c r 的扩增效率可以提前6 1 2 个循环，而与d n a 聚合酶没 有太大的关系。基于以上实验l im 等认为，纳米金提高p c r 扩增效率是因为纳米金 具有优良的导热性能，改善了p c r 体系的热传导性，缩短了到达热平衡所需的时间， 有利于模板和引物的有效配对，从而提高了p c r 的扩增效率。 v ubv 等【7 l 】研究了纳米金对于多重p c r 反应的影响，其中扩增的d n a 长度分别 为5 3 7 b p 、2 8 3 b p 和1 5 1 b p 。他们的研究发现，随着纳米金浓度的增加，扩增产物中5 3 7 b p 、 2 8 3 b p 和1 5 1 b p 的条带依次消失说明，纳米金对于p c r 反应具有抑制作用，而且对于 长片段的d n a 扩增具有更强的抑制作用。他们通过检测紫外吸收光谱和电泳迁移率证 明，纳米金可以吸附d n a 聚合酶，从而显著降低d n a 聚合酶的浓度，导致p c r 反应 被抑制。 1 4本课题的提出 如前文所述，纳米物质所展现出来的独特性能，以及纳米技术的蓬勃发展与生物 技术的融合，为解决生物技术中的缺陷或不足提供了新的思路和方法。虽然已有人将 纳米材料作为新型添加剂引入p c r 体系，但是所添加的纳米物质种类还比较少，研究 的结果也有分歧，而且纳米物质影响p c r 扩增效果的机制还不清楚，因此，对这些方 面有待进一步的研究。本研究将纳米会加入到p c r 体系研究其对p c r 反应的影响，并 对其机制进行了探讨。 1 2 第二章纳米金对p c r 的影响及其机制探讨 第二章纳米金对p c r 的影响及其机制探讨 2 1纳米金的制备与表征 2 1 1 实验材料 表2 - 1 主要实验材料与试剂 t a b l e2 - 1m a i nm a t e r i a l sa n dr e a g e n t s 表2 - 2 主要仪器 t a b l e2 2m a i ni n s t r u m e n t s 厦门人学硕士学位论文 2 1 2 实验方法 所有玻璃仪器都按下列步骤清洗：( 1 ) 用洗洁精清洗，然后用大量自来水冲洗。( 2 ) 用新配制的王水( 浓硝酸与浓盐酸的体积比为1 ：3 ) 浸泡3 0m i n 左右，用大量自来水 冲洗。( 3 ) 分别用蒸馏水和超纯水润洗三次。干燥箱烘干备用。 将氯金酸、柠檬酸三钠配置成1 的储液备用。 纳米金参照文献中【7 2 j 的方法制备。取一2 5 0m l 锥形瓶，分别加入9 4m l 超纯水、 1m l1 的氯金酸溶液和5m l1 的柠檬酸三钠溶液，室温下混匀，放入微波炉中， 高火加热1m i n 左右，使之快速沸腾，再调至中火，继续加热，保持沸腾状态5m i n 后， 取出锥形瓶，自然冷却至室温，溶液颜色呈透亮的酒红色。4 冰箱内保存备用。 2 1 3 结果与讨论 ( 一) 透射电镜( t e m ) 观察结果 透射电子显微镜是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品 中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度 相关，因此可以形成明暗不同的影像。电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并 且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。电 子枪发射出来的电子束( 直径仅几微米) 在阳极加速电压的作用下，经过聚光镜( 2 3 个电磁透镜) 会聚后均匀照射在要观察的样品上。入射电子与样品物质相互作用，产 生弹性和非弹性散射，从而使穿过样品的电子携带了样品本身的大小、形貌、组织和 结构信息。透射出试样的电子经物镜、中间镜、投影镜的三级磁透镜放大投影在观察 图形的荧光屏上，荧光屏把电子强度分布转变为人眼可见的光强分布，于是在荧光屏 上显示出与样品大小、形貌、组织、结构相应的图像。高放大倍数成像时，样品经物 镜放大后在物镜和中间镜之间成第一级实像，中间镜以物镜的像为物进行放大，在投 影镜上方成第一级放大像，投影镜以中间镜像为物进行放大，在荧光屏或照相底板上 成终像，可以获得高达2 0 万倍的电子图像；中放大倍数成像时，调节物镜的励磁电流， 使物镜成像于中间镜之下，中间镜以物镜像为“虚像”，在投影镜上方形成缩小的实像， 经投影镜放大后在荧光屏或照相底板上成终像，可以获得几千至几万倍的电子图像： 低放大倍数成像时，关闭物镜，减弱中间镜励磁电流，使中间镜起着长焦距物镜的作 用，成像于投影镜之上，经投影镜放大后成像于荧光屏上，获得1 0