（生物物理学专业论文）冷冻电镜计算机重构病毒的三维显示研究.pdf

柳正中山大学硕士学位论文 摘要 结构生物学在分子层次上从结构角度来研究与解释生物大分子的行为与 功能，是当前分子生物学中的一个重要前沿学科。冷冻电镜计算机重构技术是继 x - r a y 衍射技术，核磁共振技术后，又一发展成熟的生物大分子三维结构测定技 术。三维图像显示是获得冷冻电镜三维重构密度图后，分析与解释结构不可缺少 的一步。本文运用体显示技术编写的显示系统( c r y o e l e c t r o nm i c r o s c o p e 3 - d i m e n s i o n a lv i r u sd i s p l a y a n a l y z i n gs y s t e mc e m 3 d v d a s ) ，显示与分析中蜂 囊状病毒( c s b v ) ，家蚕质多角体病毒单克隆抗体复合物( b m c p v m a b ) ，c 6 3 6 细胞的浓核病毒( d n v ) ，以及家蚕质多角体病毒( b m c p v ) 三维结构。通过显示 与分析获得以下几个成果： 1 ，在不同阈值下进行了几种病毒的显示，摸索出c e m 3 d v d a s 显示系统对不同 病毒三维密度图合适的阈值。 2 ，通过与i r i se x p l o r e r 的显示比较，对系统的一些功能设置，提出增设阈值估计， 光源设置等功能的改进。 3 ，显示中蜂囊状病毒( c s b v ) ，家蚕质多角体病毒单克隆抗体复合物( b f f l c p v b l a b ) 的结构与以往显示的结果相同，对各结构做出解释，进一步验证了显示系统 的准确性。 4 ，c 6 3 6 浓核病毒显示中，发现c 6 3 6 浓核病毒在闽值1 9 0 下，二次轴中心附近出 现有空洞，对此结构的发现提出解释 5 ，家蚕质多角体病毒( b m c p v ) 显示中发现，在其结构表面有1 8 0 个大突起与6 0 个小突起，对此结构的可能组成做了分析。 关键词：二十面体病毒重构体显示中蜂囊状病毒家蚕质多角体病毒单克隆抗 体复合物c 6 3 6 浓核病毒家蚕质多角体病毒 塑垩 主些查兰堡圭兰竺笙苎 a b s t r a c t s t r u c t u r a lb i o l o g yi so n eo ft h en m s tc r u c i a ld i s c i p l i n e si nt h em o d e r um o l e c u l a r b i o l o g y ，w h i c he l u c i d a t e st h ea c t i o n sa n df u n c t i o n so fb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e sa t t h em o l e c u l a rl e v e lo fs t r u c t u r e t h ee l e c t r o nc r y o m i c r o s c o p ya n dr e c o n s t r u c t i o nh a s c o m et ob ea p r o m i s i n gt e c h n i q u ed e t e r m i n i n gt h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f b i o m a c r o m o l e c u l e sf o l l o w i n gx r a yc r y s t a l l o g r a p h ya n dn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ( n m r ) m e t h o d a f t e ro b t a i n i n g t h et h r e e - d i m e n s i o n a l d e n s i t ym a p f r o m r e c o n s t r u c t i o n ，t h et h r e e d i m e n s i o n a li m a g ev i s u a l i z a t i o nb e c o m e sak e ys t e pf o r v i e w i n ga n de x p l o r e rt h es t r u c t u r e ，i nt h i st h e s i s ，t h ed e n s i t ym a po fc 6 3 6d e n s o v i r u s ( c 6 3 6d n v ) ，b o m b y xm o r ic y t o p l a s m i cp o l y h e d r o s i sv i r u s ( b m c p v ) ，c h i n e s e s a c b r o o db e ev i r u s ( c s b v ) a n dt h e c o m p l e xo fb o m b y x m o r i c y t o p l a s m i c p o l y h e d r o s i sv i r u sa n dm o n o c i o n a la n t i b o d y 国m c p v m a b ) w e r ev i s u a l i z e da n d a n a l y z e d w i t h c r y o e l e c t r o nm i c r o s c o p e3 - d i m e n s i o n a lv i r u sd i s p l a y - a n a l y z i n g s y s t e m ( c e m 3 d v d a s ) ，av i s u a l i z i n gs y s t e md e v e l o p e dw i t hv o l u m ev i s u a l i z a t i o n t e c h n i q u e s s e v e r a lr e s u l t sw e r eo b t a i n e dv i av i s u a l i z a t i o na n ds h o w n b e l o w ： l ，t h eo p t i m u mt h r e s h o l do ft h ev i s u a l i z a t i o ns y s t e mf o rv i r u sd e n s i t ym a pw a s o b t m n e db yu s i n gd i f f e r e n tt h r e s h o l d st oe x p e r i m e n t 2 ，b yc o m p a r i s o no fi r i se x p l o r e rs y s t e m ，s o m ef u n c t i o n so fc e m 3 d v d a sn e e d i n g t o i m p r o v ew e r eb r o u g h tf o r w a r d ，s u c ha st h r e s h o l de s t i m a t i o n ，l i g h ts o u r c e l o c a l i z a t i o na n ds oo n 3 ，c h i n e s es a c b r o o db e ev i r u s ( c s b v ) a n dt h ec o m p l e xo fb o m b y xm o i lc y t o p l a s m i c p o l y h e d r o s i sv i r e sa n dm o n o c l o n a la n t i b o d y ( b m c p v - m a b ) w e r ea l s ov i s u a l i z e di n c e m 3 d v d a s a n dc o m p r i s e dw i t ht h er e s u l t sf r o mo t h e rv i s u a l i z a t i o ns y s t e m 。t h e s a m e n e s sa l o n gt h e mc o n f i r m st h ee f f e c t i v e n e s so fc e m 3 d v d a s 4 ，s o m ep o r e sw e r ed i s c o v e r e da l o n gt h e2 - f o l do nt h es u r f a c eo ft h ev i r u sp a r t i c l e s ， u n d e rt h et h r e s h o l d1 9 0 ，v i av i s u a l i z i n gt h ed e n s i t ym a po fd n v , t h e ns o m e e x p l a n a t i o n sw e r eo f f e r e df o rt h i ss t r u c t u r e 5 ，d u r i n gt h e v i s u a l i z a t i o no fb o m b y xm o r ic y t o p l a s m i cp o l y h e d r o s i sv i r u s ( b m c p v ) i tt u r n e do u t1 8 0b i gp r o t u b e r a n c e sa n d6 0s m a l lp r o t u b e r a n c e sa r r a n g e d o nt h es u r f a c eo ft h ev i r u sp a r t i c l ed i f f e r e n tf r o mt h ep r e v i o u sr e s e a r c h s o m ep o s s i b l e e l u c i d a t i o n sw e r ep u tf o r w a r d k e yw o r d s ：r e c o n s t r u c t i o no fi c o s a h e d r a ls t r u c t u r e ，v o l u m ev i s u a l i z a t i o n ，c h i n e s e s a c b r o o db e ev i r u s ( c s b v ) ，t h ec o m p l e xo fb o m b y xm o i lc y t o p l a s m i cp o l y h e d r o s i s v i r u sa n dm o n o c l o n a la n t i b o d y ( b m c p v - m a b ) ，c 6 3 6d e n s o v i r u s ( c 6 3 6d t w ) ， b o m b y xm o r ic y t o p l a s m i cp o l y h e d r o s i sv i r u s ( b m c p v ) n 柳正中山大学硕士学位论文 前言 近年来，作为分子生物学重要组成部分的结构生物学，取得了飞速进展， 在分子生物学研究中已经占据了主流地位，进而成为生命科学的前沿学科。1 9 9 3 年，在英国自然周刊组织每年一次的分子生物学国际学术讨论会上，结构生 物学成为该讨论会的主题。邹承鲁院士亦于t 9 9 5 年在科学导报发表了“结 构生物学的时代已经开始”的论文。 结构生物学的术语早在1 9 7 0 年就被提出来，但它包括哪些研究内容，存 在并不一致的看法从其近些年来研究对象与方法可以归纳出，结构生物学是研 究生物大分子与大分子的复合体、组装体的耪细特定空间结构、结构的特定运动 以及它们与生物学功能间的关系，来阐明生命现象的科学。1 9 5 3 年w a t s o n 和 c r i c k 完成了d n a 双螺旋结构的确定，随后p e r u t z 与k e n d r e w 对血红蛋白三维 结构的阐明，为分子生物学和结构生物学奠定了基础。过去几十年分子生物学技 术的进步，对一些生物的基因结构有了比较详细的了解，基因组图谱得到准确的 绘制。尤其2 0 0 1 年人类基因组计划的完成，使得生物学研究进入了后基因组时 代。在后基因组时代，生命科学的中心任务是揭示基因组及其所表达产物的的功 能，并在此基础上阐明遗传，发育进化，信息调控等基本生物学问题。毫无疑问， 生物大分子结构的研究必定成为生命科学领域的重要的研究内容。 结构生物学的实验研究方法主要是采用物理学方法，辅之以生物化学和分 子生物学的技术。目前采用生物大分子三维结构的研究方法有x 射线晶体衍射技 术、核磁共振技术、冷冻电镜计算机重构技术以及计算机预测模拟技术。随着一 些大分子结构数据的积累，以及计算机运算能力的加强，基于经验的结构预测与 从头预测的研究方法在结构生物学研究中已经占有一席之地。x 射线晶体衍射技 术是当今测定生物大分子主要手段，分辨率可以达到原予分辨率的尺度，但其前 提条件是必须获得高质量的单晶；核磁共振波谱法可以研究在水溶液中接近生理 状态的生物大分子结构，但只适用于分子量小的蛋白质；冷冻电镜计算机重构技 术无需样品结晶，不受样品分子量大小限制，具有独特的优势：可以直接获得分 子的形貌信息，即使在较低分辨率下，也可给出有意义的结构信息：适于解析那 些不适合应用x 射线晶体学和核磁共振技术进行分析的样品，如难以结晶的大 柳正 中山大学硕士学位论文 分子，分子量大的大分子复合体等；适于捕捉动态结构变化信息；易同其他技术 相结合得到分子复合体的高分辨率的结构信息。 近年来，冷冻电镜计算机重构技术被广泛用于测定生物大分子结构，获得巨 大成功。著名结构生物学家d j d e r o s i e r 在n a t u r e 上对这一技术的运用成果 发表了”w h on e e d sc r y s t a l sa n y w a y ? ”的评论性文章，指出。这是一个大的进步， 它( 冷冻电镜三维重构技术) 使分子生物学家不用结晶就可以获得大分子及其衍 生物结构的梦想变为现实( d er o s i e r ，1 9 9 7 ) 。在病毒结构的测定上，由于大多 数球形病毒具有二十面体对称性，冷冻电镜技术应用于对称性生物样品相对于非 对称的样品能获得更高分辨率的图像，因此冷冻电镜计算机三维重构技术在病毒 结构的研究广泛使用。如果三维重构的分辨率达到0 8 a m 左右就可以看到病毒衣 壳蛋白氨基酸的螺旋结构( b o t t c h e re ta 1 ，1 9 9 7 ：z h o uze ta 1 ，2 0 0 1 ：z h o u z h e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。目前分辨率最高的记录是番茄矮缩病毒的0 5 9 n m ( h e e lv a n e ta 1 ，2 0 0 0 ) ，随着电子显微镜成像技术的提高和计算机软硬件技术的飞跃发 展，这个分辨率记录有望进一步提高。 冷冻电镜计算机重构技术通过低温快速冷冻制样，低剂量成像获得病毒颗 粒的二维投影像，运用计算机程序重构出病毒三维结构电子密度图，再对三维结 构电子密度图解析获得病毒结构的信息。电子密度图解析必须运用科学计算可视 化。科学计算的可视化是指运用计算机图形学和图像处理技术，将科学计算过程 中产生的数据及其计算结果转换为图形或者图像在屏幕上显示出来，并进行交互 处理的理论，方法和技术。科学计算的可视化的应用领域非常广泛，尤其在医学， 地质勘探，气象预报，结构生物学领域的应用引起了科学研究者的重视。 三维可视化系统是近年计算机界中最引入注目和发展最快的领域之一。它是 从2 0 世纪7 0 年代中期开始，伴随着影像技术的产生和发展而发展起来的。早 在1 9 7 5 年，k e p p e l 提出用三角面片拟合物体表面的平面轮廓重建形体的切片 表面重建方法。1 9 7 9 年h e r m a n 等提出的立方体方法，即用边界体素的表面拼 接起来去代表物体表面的体素级表面重建方法，初步建立了体视化的基本思想。 在8 0 年代的体视化研究中，人们提出了大量算法：移动立方体法、分解立方体 法、灰度梯度明暗计算方法等。其中最引人注目的是基于体素的显示方法，这种 方法不需要构造物体的表面，而直接对体数据进行显示。在9 0 年代，三维可视 2 柳正中山大学硕士学位论文 化及测量系统的研究走向实用，国内外出现了一批优秀的可视化软件系统，这些 系统主要运行在大型机和工作站上( 如s g i ，s u n 等图形工作站) ，或者为某些 专用设备( 如c t 机、m r i 机、激光共聚焦显微镜等) 的配套软件，价格不菲。 些大的公司如a v si n c ，i b mi n c ，n a gl t d ，k h o r a lr e s e a r c hi n c v i s u a l n u m e r i c si n c 已有了成熟实用的数据场可视化系统，它们的产品分别是a v s ， i b md a t a - e x p l o r e r ，i r i se x p l o r e r ，k h o r o s ，p v w a v e f a s t ( b r o d li ee t a 1 ， 1 9 9 1 ) 。国内可视化研究方面，浙江大学、清华大学、东南大学、中科院自动化 所等均做了大量研究，开发了一些实验系统，另外国内还有一些实验室也开发了 些小型的专用系统。 冷冻电镜计算机重构技术重构出的病毒三维体数据，国外常用i r i s e x p l o r e r ，a v s 平台( s h e e h a ne ta 1 ，1 9 9 6 ：s p e n c e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 进行显 示与分析。i r i se x p l o r e r 是一般的计算机图像处理和图形应用软件，自身提供 了一系列模块，用户可以根据自己的要求来选择组装成自己的应用环境，而且， 还可以利用相应的程序语言来开发自己特殊用途的模块。其主要的功能有数据的 输入，转换，图像处理，操作，与绘制。因而我们可以利用这个平台，自己开发 出一些模块来绘制冷冻电镜单颗粒技术重构出来的三维体数据。同样a v s 也是从 选择和开发不同模块来对三维体数据进行操纵的。 在这些已有的显示系统中存在着一些不足： ( 1 ) 大多数三维显示系统是商用软件，价格不菲； ( 2 ) i r i se x p l o r e r ，a v s 作为通用的显示系统庞大，最早运行于工作站， 即使现在在p c 机上使用，平台的启动运行部占用较大计算机系统和 硬件资源，速度慢； ( 3 ) 交互操作显示的时候，显示参数多，参数设定不便； ( 4 ) 作为通用显示系统，开始并没有设定三维密度图格式的读取与显示， 许多功能未能达到进一步用户自己的要求，还需要用户基于它的平台 开发自主的模块； ( 5 ) 这些显示系统多为g u i 软件，没有公开的原代码，对其进行改造十分 困难，很难进一步基于模块作出更加深入的研究工作。 随着微型计算机图像技术的迅猛发展，计算机可视化硬件的大量出现，特别 柳正中山大学硕士学位论文 是图形处理器( g r a p h i c sp r o c e s s i n gu n i t ，g p u ) 技术不断更新，中央处理器 ( c e n t r a lp r o c e s s i n gu n i t ，c p u ) 的速度不断加快，以及其他相应硬件成本不断 降低等，在微机的w i n d o w s 平台上设计三维可视化软件已经成为可能。 本文研究的工作就是利用体绘制的方法在冷冻电镜计算机重构出的三维体 数据中的应用。主要工作如下： ( 1 ) 运用了v c + + 6 0 编程工具与o p e n g l 程序接口运用光线投射算法和光 线追踪算法分别用于重构出病毒数据的面信息和体信息的显示研 究： ( 2 ) 摸索出c e m 3 d v d a s 在显示文章中四种病毒时最佳阈值； ( 3 ) 分别显示了中蜂囊状病毒( c s b v ) ，家蚕质多角体病毒单克隆抗体复 合物( b m c p v 一胍b ) ，对显示出的结果作出了分析，发现与以往的结 果具有一致性，从而确定了c e m 3 d v d a s 显示的有效性。 ( 4 ) 显示出c 6 3 6 浓核病毒的三维结构，对其中各结构做出分析，与以前 显示的结果做比较，并且发现在阂值1 9 0 下，沿二次轴有孔洞，对此 结构提出可能的解释。 ( 5 ) 显示出家蚕质多角体病毒( b m c p v ) ，对其结构做出分析，并发现表面有 1 8 0 个大突起与6 0 个小突起，与以往结果有不同，对它们作出结构 上的解释。 通过运用采用体显示技术开发出的显示软件，对几个病毒进行了显示，对其 显示参数一些摸索，对结构作出解释，初步建立起冷冻电镜计算机三维重构病毒 结构的三维显示操纵平台，为进一步完善和改进三维显示系统作出摸索，为以后 利用三维结构数据做生物大分子结构分割，二级结构搜索与定位，依据数据密度 图作为边界条件进一步做分子模拟打下基础。另外，为建立病毒三维重构到三维 显示整个平台的建立做了部分工作。 4 柳正 中山大学硕士学位论文 第一章病毒三维结构与结构体数据的获得 1 1 引言 病毒是一种非细胞生命体。除朊病毒和类病毒外，一般说来，病毒是由一 个或几个o n a 或r n a 分子，覆盖有一种或几种蛋白质组成的外壳，有的还披有更 为复杂包膜的感染性因子。荷兰细菌学家贝叶林克( b e i j e r i n c k ) 1 8 9 8 年在前 人的研究基础上，通过实验发现一种比细菌还小的“有传染性的活的流质”并 给之取名为“v i r u s ”。 1 9 3 5 年斯坦利( s t a n l e y ) 首次获得了烟革花叶病毒( t w ) 结晶，k a u s c h e 于1 9 3 9 年在电子显微镜下看到t 蝌，病毒的结构研究随后逐步开展起来，研究 病毒结构的技术不断更新。 负染色电子显微镜技术和传统的病毒结晶技术主要用于病毒形态的研究：x 射线技术虽然看不到病毒内的核酸结构，但可以获得清晰的病毒粒子模型图，可 在接近原子尺度看到病毒的精细结构。原子力学显微镜( a t o m i cf o r c e m i c r o s c o p y ，a f m ) 技术，很好地用来观察病毒结构，可准确测量病毒的大小及 表面结构，揭示衣壳的排列，甚至衣壳蛋白亚单位在衣壳的分布( m a l k i ne ta 1 ， 2 0 0 5 ) 。另外随着分子生物学技术的发展，可以使得病毒亚单位蛋白的基因表达 而获得较高纯度的蛋白，从而可以使用特定的研究方法迸一步从原子水平上研 究病毒亚单位蛋白的结构及功能。冷冻屯镜计算机三维重构技术自上世纪七十 年代发展以来，逐步完善与成熟。现已经成为了一项广泛运用的测定病毒大分子 结构的技术( o r l o v aa n ds a i b i l ，2 0 0 4 ) 。 1 2 病毒的组成与结构 1 , 2 1 病毒分类 病毒按照电镜观察到的形态结构进行分类，可以分为球状，秆状弹状病毒 根据病毒本身形态结构特点和衣壳对称型划分为四种：二十面体对称病毒，螺旋 对称病毒，复合对称病毒，复杂对称病毒。还可根据含有的核酸种类可以分为r n a 柳正中山大学硕士学位论文 病毒和d n a 病毒。r n a 病毒又可分为单链r n a 病毒如艾滋病病毒，流感病毒和 双链r n a 病毒如s a r s 冠状病毒，而d n a 病毒也可分为双链d n a 病毒和环状d n a 病毒。另外病毒也可以按照其宿主分类为植物病毒，动物病毒，以及噬菌体。 1 2 2 病毒的组成 病毒粒子( v i r i o n ) 指形态学上成熟的病毒颗粒，是从细胞到细胞，或从宿 主到宿主的传播形式。病毒壳体( c a p s i d ) 或称衣壳是指围绕着病毒核酸并与其紧 密连接的蛋白质外壳；核衣壳( u n c l e o c a p s i d ) 是指壳体和核酸的结合体；病毒的 结构单位( s t r u c t u r eu n i t e s ) 是指蛋白亚单位( 多肽链) 聚合成病毒壳体所需组 件，一般由蛋白质的亚基组成。聚合单位是由一组亚单位或结构单位，形成更大 结构的重要中间体或者亚聚物，如猿猴病毒4 0 ( s v 4 0 ) 中的v p l 五聚体( k a n e s a s h i e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。病毒壳粒( c a p s o m e r 或c a p s o m e r e ) 或形态学单位( m o r p h o l o g i c u n i t s ) 指在电子显微镜下可以辨认的病毒表面明显的团块，大致相当于壳体亚结 构的表面突出部分；包膜( e n v o l o p e ) 是指由脂类、蛋白质和糖组成的处于病毒最 外层表面的膜状结构，披膜病毒所独有，有些病毒的囊膜与衣壳之间还有一层病 毒特异性的内膜蛋白，称之为m 蛋白。 1 2 3 病毒形态结构 病毒的形态是多种多样的，随着研究技术发展，对病毒的形态结构研究越来 越精细，发现有球状，弹状，砖形，冠状，杯状，轮状，肾形，等多种多样的形 状。从这些千差万别的形态中，病毒取型只有两种基本的形状，一是多面体型， 另外一种是螺旋型。 在病毒感染的细胞中，往往见到中空的或者空瘪形的病毒颗粒，这是由于它 的核酸没有或者含量较少，有学者认为存在这种可能是病毒样品处理过程中，病 毒遭到破坏，核酸丢失造成，另一种可能壳膜装配时核酸还没有装入进去的暂时 形态。病毒的衣膜在其壳膜外表面有一层含有磷脂的农膜，其来源包括有宿主细 胞的质膜或者宿主细胞的核膜如疱疹病毒在核内装配核壳，当它经过核膜时带上 一层外膜，当从细胞质分泌出胞外时又带有另外一层细胞膜。把这类具有来自宿 主细胞的膜性结构称为披膜病毒，在电镜下观察，以及电镜照片的挑取的过程中 柳正中山大学硕士学位论文 应该注意到这些病毒粒子的存在形式。 1 3 正二十面体结构 在立体对称中，除了一些噬菌体具有八面体对称外，c r i c k 和w a t s o n 断定 所有球形病毒时二十面体对称的，现在已经证实许多球形动物病毒都具有二十面 体对称( 王继科等，2 0 0 0 ) 。 1 3 1 二十面体结构结构形成 c a s p a r 和k k l u g 指出：主要是二十面体对称能使得大量最小体积的蛋白 亚单位把病毒核酸覆盖起来( c a s p a ra n dk l u g ，1 9 6 2 ) 。从结晶学角度看，它服 从于”准等价构筑的二十面体原理”。准等价构筑的二十面体原理，是指在少数募 子构成的体系中，大小相近的原子形成孤立的十二次配位体时，二十面体配位在 能量上最有利。因为在二十面体配位中，每个配位原子都是等效的，而且每个原 子周围的原子是均匀分布的，联线交角都是6 0 。这在能量上分布均匀，也最 稳定。对单个原子形成孤立的1 2 次配位来说，这是最理想的形式，因此，这种 配位多面体在晶体中少见。即使存在也是以变了型的方式出现。可是对生物结构 的病毒来讲，却得到了充分体现，这可能是生物结构易变形的缘故。正二十面体 能满足高效的隔断系统，正二十面体符合几何晶体学原理。 一般说来，正二十面体衣壳分两级形态结构；一是由蛋白质原体的短带形成 电镜可见的壳粒结构，二是由壳粒迸一步排列形成的衣壳。原体和壳粒都是通过 非共价键结合在一起，原体间键比壳粒问键要短。这造成在电镜下能够看到区分 壳粒，而不能区分原体。衣壳呈二十面体对称，主要由它的蛋白质一级结构决定， 是原体和壳粒遵循几何晶体集结形成的。空心衣壳在提纯时往往可以解离成完整 的壳粒，在用化学试剂裂解病毒时，可以得到原体和一些寡聚体。 二十面体是由2 0 个等边三角形的面，1 2 个顶点和3 0 条棱所组成( 见图卜1 ) 。 若以相对应的顶点为轴旋转7 2 度其构型不变，旋转5 次复位，称为5 一次对称轴： 若以相对应的三角形面的中心连线为轴，旋转1 2 0 度其构型不变，旋转3 次复位， 称为3 一次对称：若以相对应的棱的中点连线为轴，旋转1 8 0 度其构型不变，旋转 2 次复位，称为2 一次对称轴。 7 柳正中山大学硕士学位论文 1 3 2 二十面体结构中三角剖分数 为了研究球形病毒的形态单位的总数与结构单位的总数之间的关系，描述 各种球形病毒的外壳结构，c a s p a r 和k k l u g 提出“三角形剖分数” ( t r i a n g u l a r i o nn u m b e r s ) 理论( c a s p a ra n dk l u g ，1 9 6 2 ) 。将二十面体的每个 等边三角形面划分成t 个单位三角形，每个二十面体有2 0 个面，所以单位三角 形的总数是2 0 t ，因此可以用t 值表示球形病毒的结构类型。最小的4 个t 值 是1 、3 、4 和7 ( 图1 2 ) 。由于一般结构单位本身结构不具备对称性，所以每个 三角形中至少有三个亚基，所以病毒壳体中至少容纳6 0 t 个亚基。由于二十面 体的三角形表面能再分成单位三角形，因此除了= 十面体本身固有的五次旋转 轴、三次旋转轴和二次旋转轴对称性外，还产生了局部的六次旋转对称性，因此 具有围绕五重旋转轴的五邻体( p e n t o n ) 和围绕六重旋转轴的六邻体( h e x o n ) 两种 形态学单位即病毒壳粒。t 值和病毒壳粒数目关系见表卜l 。 7 卜 g 一一尹。蕉一 ，、 一r ， ， ， i 。攒 汀z 图卜1 、二十面体示意图 广，、j 柳正中山大学硕士学位论文 c d 图卜2 二十面体被划分成三角形表面捧列的常见类型 a 、t = l ；b 、t = 3 ；e 、t = 7 ；d 、t = 4 f i g u r e1 - 2 ，i l l u s t r a t i o no fc o i m r o nt r i a n g l e s u r f a c ea r r a n g e dt y p e so fi c o s a h e d r o n a 、t = l ；b 、t = 3 c 、t = 7 ；d 、t = 4 t 值的计算公式为t = h 2 + k 2 + l ( ，h 是从1 开始，k 是从零开始的任意正 整数，并规定h k ，h 和k 是以从一个五重轴开始经过局部的六重轴转折到相 邻的另一个五重轴所走过的步数来计算的，转折前和转折后的步数分别定义为h 和k 。例如常见的几个对称性类型：若从一个五重轴直接到相邻的另一个五重轴， 则h = i ，k = o ，t = 1 ；若从一个五重轴经过一个六重轴后转折再到相邻到另一个 五重轴，则h = 1 ，k = 1 ，t = 3 ；若从一个五重轴经过一个六重轴后，不转折再 到相邻到另一个五重轴，则h = 2 ，k = o ，t = 4 ；若从一个五重轴经过两个六重轴 后转折，再到相邻到另一个五重轴，则h = 2 ，k = i ，t = 7 。“三角形剖分数”近似 等价理论提供了一个病毒组装的一般原理与研究病毒组装的结构模型。 9 柳正 中山大学硕士学位论文 表卜1 t 值与病毒壳粒数目关系 1 3 3 重构中取向定义 根据二十面体的结构，其取向可以由欧拉角【f ，u ，m ) 来定义。选择二十面体 的中心为原点，二十面体的三条互相垂直的二次轴为直角坐标系的三条轴x 、y 、 z ，定义为二十面体的原始角度坐标( o ，0 ，o ) 。二十面体的取向的定义通过相对 于此原始角度旋转得到。先绕z 轴旋转，旋转角度定义为t ；然后绕新的y 轴旋 转，旋转角度定义为0 ；最后绕新的z 轴旋转，旋转角度定义为仿。经过这样三 个角度旋转后的二十面体的取向定义为( 1 ，吐叫。= 十面体的取向决定了其摆放 的位置。根据二十面体的对称性，二十面体的1 个取向可以找到其它5 9 个欧拉 角不同但是能保证二十面体空间位置完全相同的取向，实际上我们可以定义一个 欧拉角范围，使得该范围中的任一角度定义了二十面体唯一的摆放位置，这样的 一个范围称为非对称单元。通常定义这个范围在以两个临近的五次轴 ( o = 9 0 0 。，f = - + 3 1 7 2 。) 和一个临近的三次轴( 0 2 6 9 9 0 , f2 0 o o ) 的三角形内。 图卜3 的阴影部分为一个非对称单元，实际上这个定义的范围是二十面体一个面 的l 3 ，一个完整的二十面体可以通过该单元做5 9 次对称操作得到。我们搜索 二十面体的取向就可以限定在这个非对称单元中搜索。因为在非对称单元中的一 个取向总可以在其它的一个非对称单元中有唯一的对应取向。一个二十面体由 6 0 个非对称单元构成，所以一个取向有其它5 9 个对应的相同取向。 1 0 柳正中山大学硕士学位论文 ( 9 妒，3 1 7 2 。，0 )，0 0 ) ( 6 9 0 9 0 ，o ，0 ) 图1 - 3 ( a ) 定义欧拉角的二十面体坐标系和一个非对称单元； ( b ) 分别从五、二和三次轴视角的二十面体视图，图下面标明了三个取向的欧拉角 f i g u r el 3 ( a ) c o o r d i n a t es y s t e mu s e dt od e f i n ee u l a to r i e n t a t i o na n da na s y m m e t r i cu n i t a ( b ) i c o s a h e d r o nv i e w e df r o m5 - , 2 一a n d3 - f o l d 1 4 冷冻电镜三维重构的主要原理 病毒的冷冻电镜计算机重构最终结果是病毒的三维结构密度图。冷冻制样 可以使样品保持自然状态，低剂量成像避免电子对样品辐射损伤。采用多幅图像 数据叠加增强信噪比，获得高分辨率需要进行相位衬度传递函数( o f f ) 曲线校 正。 二十面体病毒三维重构算法是二十世纪六十年代末七十年代初由c r o w t h e r 柳正中山大学硕士学位论立 r a 和k l u ga 提出的，其方法是把颗粒在电镜中的投影图像变换到傅立叶空 闻，然后在傅立叶的频率空间内，确定各自投影的取囱和中心，然后按照各自韵 取向和中心拼上去，当得到足够多确定了取向与中心的这样投影时，就可以得到 一个在傅立叶空间中病毒的三维结构密度图。然后通过傅立叶反变换，将傅立叶 空间的物体变换到实空间中而获得病毒的三维结构( c a s p a ra n dk l u g ，1 9 6 2 ： c r o w t h e r ，1 9 7 1 ) 。 1 4 1 中央截面定理 中央截面定理：任何物体的二维投影的二维傅立叶变换与原物体的三维傅 立变换的一个中央截面等价，并且截面的法向与投影方向一致 ( c r o w t h e r ，1 9 7 1 ) 。 设物体的质量密度函数是f ( x ，y ，z ) ，那么它的傅立叶变换为： f 似，y ，z ) 。埘，o ，y ，z ) e x p t 2 耐( x x + y y + z z ) d x d y d z ( h ) 若物体沿z 轴投影，则得到投影为： + o p ( x ，1 ，) 。f f ( x ，y ，z ) 出 ( 卜2 ) 其傅立时变换为： p z ( x ，y ) 。田乙p o ，y ) e x p 【2 面+ y y ) d x d y ( 卜3 ) 由公式( 1 1 ) ，对于傅立叶空间的中心截面z = - 0 ，同时对z 积分得： f ( x ，y ，o ) 。j 3 k 口o ，y ) e x p l 2 m ( x x + y y ) d x d y ( 1 - 4 ) 盯0 ，y ) 即为物体的二维投影。公式( 1 - 3 ) 与( 1 4 ) 得到为中央截面定理。因此可以把 实空间的二维投影像与傅立叶空间的三维结构的中央截面作转换，把三维结构与 二维投影之间的关系建立起来。当有各方向的足够多的二维投影就可获得这物体 三维傅里叶变换各方向的足够多的中央截面，就可合成这物体的三维结构的傅里 叶变换，通过反变换就获得该物体的密度函数三维结构。 搠正 中山大学硕士学位论文 1 4 2 取向与中心的确定 取向与中心的确定是采用等价线搜索的方法。两个在傅立叶空间的二十面 体的中央截面之间必然有一条交线，这条交线分别在两个截面上，也就是说两个 截面上各自有一条这样的线，它们对应点上的值是相同的，所以称为等价线 ( f u l l e re ta 1 ，1 9 9 6 ) 。交互等价线即二十面体在不同方向的二维投影，相当于 三维傅立叶空间垂直于投影方向上的中央截面，两个不同方向上的二维傅立叶投 影产生的一条交线。自身等价线为在原投影像的二维投影对应的中央截面内，经 过对称与反对称操作得到的另外的截面与原截面相交的交线。交互等价线与自身 等价线可见图卜4 与图i - - 5 。每个二十面体的傅立叶变换，沿五次轴方向有1 2 对 自身等价线，沿三次轴方向上有l o 对自身等价线，沿二次轴方向上有1 5 对自 身等价线，合计共有3 7 对自身等价线。二十面体中对于每个顶点有五个对称操 作，对于每个面有三个对称操作，对于每个边有二个对称操作。因此，任何两个 投影的二维傅立叶变换之间就有5 x 3 2 x 2 = 6 0 对交互等价线。 图1 4 自身等价线示意图 f 蟾u r e1 - 4i l l u s t r a t i o no fs e l f - c o m m o n l i n e s 1 3 柳正中山大学硕七学位论文 ! 维l 阳体躺澎 ：维投影的他锺n i “变换 圆国卜 5 9 个列称i t 铖i l l i 羽交瓤等价线 图1 _ 5 交互等价线示意图 f i g u r e1 - 5i l l u s t r a t i o no fc r o s s - c o m m o nl i n e s 等价线的分布和颗粒的取向对应的，我们可以用计算机程序来搜索等价线的 位置来确定病毒颗粒的取向。病毒颗粒中心的初始位置的估计可以通过病毒颗粒 的图像和其旋转1 8 0 度的图像做交互相关来确定( p r a s a de ta 1 ，1 9 8 8 ) 。因为病 毒的电子显微图像的噪声很大，所以一对等价线上的相应的点的值不是象理论上 那样完全相同的。先假定一个取向，我们可以算出这个取向的截面上的等价线位 置，然后计算这个截面上的各对等价线的相应的点的值之间的差异，这个差异称 之为等价线残差，由于傅立叶变换的振幅频谱具有平移不变性，因此我们可以计 算这个截面上所有等价线残差的平均值。以1 度为间隔穷举所有非对称单元中的 角度，平均残差最小的取向被认为是正确的取向。 1 4 柳正 中山大学硬士学位论文 1 4 3 傅立叶- 贝塞尔内插法 获得正确取向和中心的投影面后，由于直角坐标中没有个很好的插值方法， 进行三维重构时不使用直接反傅里叶变换，而是采用柱坐标中的傅立叶变换。即 傅立时一贝塞尔合成来实现从病毒颗粒的傅立叶变换到病毒三维结构的计算( 见 图l 一6 ) 。具体推导过程可以参考文献( f u l l e re ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 v i r u sp a r t i c l el n 擒g 龉 3 df o u r l e rs p a c e3 dr e a ls p a c e 图1 6 三维重构示意图 f i g u r e1 - 6i l l u s t r a t i o no f t h r e e - c l h n e n s i o n a lr e c o n s t r u c t i o n 1 5 三维体数据的获取 1 5 1 获得单颗粒病毒像 首先制备高浓度的( 通常是1 - - 1 0 m g m l ) 高纯度的病毒样品悬液。把悬液滴 到具有微筛膜的电镜铜网上，然后将铜网迅速投入到由液氮冷却的液态乙烷中冷 冻。其次，在电镜下采取低剂量电子束成像一般在中等分辨率下放大倍数是 3 0 k 一4 0 k ，要获得更高的目标分辨率，放大倍数需要5 0 k - 8 0 k ( t h u m a nc o m m i k ea n d c h i u ，2 0 0 0 ) 。获得的图像可以采样底片曝光与数字化仪采集，或者在电子显微镜 上直接利用电荷耦合器件( c c d ) 采集成像( b o o t he ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 获得数字化照片后，就是框取颗粒。先框取大欠焦颗粒的病毒，框取时要 避免选择有污染的颗粒；避免选择有像散和样品漂移的颗粒；避免选择不完整的 颗粒；避免选取亮度不均匀，存在亮度梯度的颗粒。框取颗粒时选择正方形框的 尺寸必须稍大于病毒尺寸，尽可能使得病毒颗粒的中心和框的中心一致。框取完 大欠焦颗粒后，再根据大欠焦颗粒位置，进行小欠焦的病毒颗粒的框取。 搠正中山大学硕上学位论文 1 5 2 重构处理 1 。4 节所述的计算机重构方法原理都已有成熟的计算机程序实现，现今具 有以上功能成熟的软件有i m i r s ( l i a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) ，e m a n ( l u d t k ee t a 1 ，1 9 0 9 ) ，s p i d e r ( f r a n ke ta 1 ，1 9 9 6 ) 等，采用了人机对话的方式即可完成。 处理大欠焦颗粒，利用计算机程序在傅立叶空间中搜索病毒的自身等价线以 初步确定大欠焦病毒颗粒的取向，然后通过最小化所有颗粒之间的交互等价线的 相位残差原理来筛选作原始模板的颗粒，进一步利用原始模板与交互等价线法筛 选正确的取向，循环计算三维结构，投影模板的生成与循环精修大欠焦颗粒，在 循环精修的过