学术论文：嗜酸乳杆菌微胶囊化制备方法的研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 随着人们生活水平的不断提高，健康意识也逐渐增强。乳制品含有促进人类生长发 育及维持健康水平的几乎一切的必须营养成分，被认为是迄今为止一种比较理想的完全 食品。嗜酸乳杆菌是目前乳酸菌家族中极受重视并大力研究与开发的益生菌之一，被视 为第三代酸乳发酵剂菌种。但研究表明，- $ l n 品中的嗜酸乳杆菌数量很难达到国际乳品 协会推荐益生菌产品的最小活菌限量1 0 6 c f u g ，细菌活性下降很快且货架期较短。这给 细菌的实际应用带来了很大的不便，特别是在细菌发酵工业中，随着发酵过程的进行， 细菌新陈代谢的产物浓度升高，高浓度的代谢产物会抑制细菌的生长；同时发酵产物的 分离操作复杂，还会因染菌而引起倒罐损失，限制了嗜酸乳杆菌大规模的应用。采用微 胶囊化技术可以有效的解决上述问题。微生物微胶囊技术是以天然或合成的高分子材料 作为囊壁，通过化学法、物理法或物理化学法将活性囊芯物质包裹起来，形成具有半透 性或密封囊膜的微型胶囊技术。 本文采用两种方法：喷雾干燥法和高压静电法对嗜酸乳杆菌进行微胶囊化研究。喷 雾干燥法旨在保持细菌在微胶囊内的活性，解决产品长期保存问题。而高压静电法则着 重解决发酵工业中细菌的生长，发酵产物在线分离等问题。喷雾干燥法考察了工艺参数 对微胶囊细菌存活率的影响，微胶囊产品的稳定性能；高压静电法考察微胶囊粒径以及 膜强度，嗜酸乳杆菌在载磁海藻酸钙一壳聚糖微胶囊内的生长状况。 利用喷雾干燥法对嗜酸乳杆菌进行微胶囊化，首先通过单因素实验考察喷雾干燥进 风温度、进料流量、壁材配比、抗热保护剂用量等因素对芯材细菌存活率的影响，得出 适宜的操作范围；在此基础上，设计了正交实验，通过对正交实验结果的分析，得出最 佳的实验条件：进风温度为1 4 0 、进料速度为1 2 5 0 m l m i n 阿拉伯胶与麦芽糊精比例 为1 ：1 0 、壁材浓度为1 5 时，嗜酸乳杆菌存活率最高为6 3 。 利用高压静电制备嗜酸乳杆菌微胶囊，通过改变操作条件，得到海藻酸钠浓度为 1 5 ，氯化钙浓度为2 ，f e 3 0 4 浓度为2 9 l - 3 9 l ，高压静电电压为1 0 0 0 0 1 2 0 0 0 v 时 为最佳操作条件，制备的微胶囊球形度良好，粒径分布均匀达到微米级，壳聚糖浓度为 3 9 l ，成膜时间为2 0 分钟时微胶囊膜强度最佳。 嗜酸乳杆菌在载磁海藻酸钙壳聚糖微胶囊内的生长状态良好，经过1 2 h 左右的培 养，微胶囊呈“黑实 状态；嗜酸乳杆菌在磁性微胶囊内的生长曲线呈“s ”形；对数生 长期与稳定期明显；达到稳定期时的菌浓度与游离培养相比，相差很小，表明微胶囊对 细菌的生长没有抑制作用。 关键词：嗜酸乳杆菌；微胶囊；喷雾干燥；高压静电场 嗜酸乳杆菌微胶囊化制备方法的研究 s t u d yo ft h em i c r o e n c a p s u l a t o nt e c h n o l o g yo fl a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u s a bs t r a c t w i t ht h ec o n t i n u o u si m p r o v e m e n to fp e o p l e sl i v i n gs t a n d a r d ，t h ea w a r e n e s so fh e a l t hi s a l s og r o w i n g d a i r yp r o d u c t sc o n t a i na l m o s te v e r ye s s e n t i a ln u t r i e n t st h a tm a i n t a i nh e a l t ha n d g r o w t h l a c i d o p h o l u si so n eo fp r o b i o t i c sw h i c ha r er e s e a r c h e da n dd e v e l o p e d i nt h el a c t i c a c i db a c t e r i u ma tp r e s e n t ，嬲t h e t h i r dg e n e r a t i o nf e r m e n t e dl a c t i cc u l t u r e s ，i sa ni m p o r t a n tg u t m i c r o b i o t a b u tr e s e a r c hs h o w st h ea m o u n to fl ai nd i a r yp r o d u c t si sh a r d l yt ol i v eu pt ot h e m i n i m u ma m o u n to f10 6 c f u gw h i c hr e c o m m e n d e db yi n t e r n a t i o n a ld a i r yf o u n d a t i o n a n d d u r i n gt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s ，t h ec o n c e n t r a t i o no fm e t a b o l i cp r o d u c t sw i l li n c r e a s ea n d w i l li n h i b i tt h eg r o w t ho fl 。a a n dt h es e p a r a t i o no ft h ep r o d u c t sd u r i n gf e r m e n t a t i o ni sq u i t e c o m p l i c a t e d a no ft h e s es e tf ll i m i tt ot h es u b s t a n t i a la p p l i c a t i o no fl a t l l i sp a p e rs t u d i e st h em i c r o e n c a p s u l a t i o no fl ab ys p r a yd r y i n ga n di m p u l s i v e e l e c t r o s t a t i cd r o p l e tt e c h n i q u e t h em a i nc o n t e n to ft h i ss t u d yi st h ei n f l u e n c eo ft h ek e y o p e r a t i o n a lp a r a m e t e r so fs p r a yd r y i n ga n di m p u l s i v ee l e c t r o s t a t i cd r o p l e tt e c h n i q u eo nt h e b a c t e r i as u r v i v a lr a t e d i a m e t e ra n dm e m b r a n ep r o p e r t ya n di t sg r o w t hc o n d i t i o n s o m ek e yo p e r a t i o n a lp a r a m e t e r s s u c ha st h ei n l e ta i rt e m p e r a t u r e ，t h ef e e df l o wr a t e , t h er a t i oo ft h ew a l lm a t e r i a la r ed e t e r m i n e dt os o m ee x t e n tb yt h es i n g l ef a c t o ra n a l y s i s f u r t h e r m o r e , t h eo p t i m u mc o n d i t i o no fs p r a y - d r y i n gi sa c h i e v e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t , i i l c l u ( 1 i n gi i l l e ta i rt e m p e r a t u r eo f14 0 ，t h ef e e df l o wr a t eo f12 5 m l m i n ，t h er a t i oo f1 ：1 0 f o rm a t e r i a l sg u ma r a b i ca n dt h eb a c t e r i as u r v i v a lr a t er e a c h e s6 3 t h e m i c r o c a p s u l e sp r e p a r e d w i t h1 5 a l g i n a t e ， 2 c a l c i u m ，2 9 l - 3 9 l f e 3 0 4 ，10 0 0 0 12 0 0 0 vv o l t a g eh a v ef i n es p h e r e ，p a r t i c l e s i z ea n ds m o o t hs u r f a c e t h e e m b e d d i n gr a t eo ff e 3 0 4i s8 8 - 9 1 t h em i c r o c a p s u l e sm e m b r a n ei sm o s ts t e a d yw h e nt h e c o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a ni s3 9 l a n dt h em e m b r a n ef o r m a t i o nt i m ea t2 0r a i n s t h eg r o w t ho fl ai nm i c r o c a p s u l e sa r ew e l l ，t h em i c r o c a p s u l e sb e c o m eb a l c ka n ds o l i d a f l e r l2 h sc u l t u r i n g t h eg r o w t hc u r v eo fl as h o w s “s ”s h a p e t h es t e a d ys t a g ei se a s i l y o b s e r v e d t h ec o n c e n t r a t i o no fl ab e t w e e nf r e ec u l t u r ea n db ym i c r o e n c a p s u l a t i o ni sm i n o r t h e r ei s1 1 0i n h a b i t a t i o ne f f e c to nt h eg r o w t ho fl ai nr n i c r o c a p s u l e s k e yw o r d s ：la c i d o p h i l u s ；m i c r o c a p s u l e ；s p r a yd r y i n g ；i m p u l s i v ee l e c t r o s t a t i ct e c h n i q u e i i 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 学位论文题目：里叠塑坌兰竺暨! 亟垫! 堡：重垒塑垒坌墨塑互笙 作者签名： ! 寥j 复生箜日期：二坚生年上月兰- 日 大连理工大学硕士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间 论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有 权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文题目： 作者签名： 导师签名： 7 钟 日期：抛夕年 月多曰 彳才况 日期；沙。年j 月尘目 大连理工大学硕士学位论文 己l吉 丁lf j 近年来含有益生菌( p r o b i o t i e ) 的微生态制剂正作为一个新的领域被研究和开发。 随着人们对嗜酸乳杆菌健康促进作用研究的不断深入，含有嗜酸乳杆菌的发酵乳及其他 产品陆续问世，嗜酸乳杆菌越来越成为第三代发酵品中的佼佼者。在产品中保持一定量 的活菌数对于发挥益生作用是至关重要的，国际乳品协会推荐益生菌产品的最低活菌数 限量为1 0 6 c f u g 。但大量研究表明，很多产品中嗜酸乳杆菌的活菌数很难达到这一规定 值。另外，在大规模制备嗜酸乳杆菌发酵过程中，代谢产物对细胞生长代谢的抑制作用， 发酵过程中的细胞活性，简化发酵产物的分离操作并降低在此过程中的能量损耗，因发 酵过程中的染菌引起的倒灌损失等问题，也是制约着嗜酸乳杆菌广泛应用的重要因素。 本课题嗜酸乳杆菌微胶囊化制备方法的研究主要针对上述的问题首先利用喷雾 干燥技术进行微胶囊化，保证嗜酸乳杆菌在微胶囊内的活性，并对微胶囊产品中的细菌 存活率以及微胶囊的稳定性进行研究，确定其存储期。 高压静电技术制备载磁海藻酸钙一壳聚糖微胶囊载体，测定微胶囊的膜强度，模拟 发酵过程，观察嗜酸乳杆菌在微胶囊内的生长状况，解决发酵过程中代谢产物对细菌生 长的抑制作用以及与代谢产物的在线分离问题。 微生物微胶囊化的研究目前主要集中在食品、药品行业。国内做的比较好的是华南 理工大学的杨汝德等学者，他们将三种双歧杆菌、高效活菌保护剂和双歧促生因子一起 作为核心物质，采用流化床包膜法制备得到耐酸肠溶微囊益生菌。微囊在人工模拟胃液 h 1 5 2 0 ) 中处理4 h ，双歧杆菌活菌数仍保持在4 4 以上，由加速实验得到在3 7 下 可保存5 个月1 2 天，并能保持1 0 以上的活菌存活率。国外关于微生物微胶囊欧美所 作研究较多，p o y n t o n 等用含有抗生素蛋白等配体结合的磁性微球，进行骨髓中t 细胞 的分离，用于治疗白血病。j o s e p h s o n 将戊二醛活化的硅烷磁微胶囊用于人血中淋巴细 胞的分离。b j e r k 用来分离并纯化人血中的嗜碱细胞；d u r c o v a 使用磁性微胶囊从体细胞 分离纯化干细胞，得到纯度为8 3 的干细胞。 本文旨在通过喷雾干燥技术得到较高的细菌存活率并能在微胶囊内保持较高的活 性，同时微胶囊具有良好的稳定性能。利用高压静电技术制备出粒径均一，球形度良好 的微胶囊载体，并且在模拟发酵过程中，细菌在微胶囊载体内繁殖生长良好，即细菌活 性良好，达到与代谢产物的在线分离的目的。 嗜酸乳杆菌微胶囊化制备方法的研究 1 文献综述 1 1 嗜酸乳杆菌 嗜酸乳杆菌属乳杆菌科，乳杆菌属，为格兰氏阳性菌，其d n a 中g + c 含量少于 3 4 一3 7 ，形态成细长杆状，杆的末端呈圆形，以单个或成对的短链形式存在，不运动， 无鞭毛，无芽孢，过氧化氢酶阴性，不产生细胞色素，不液化明胶，细胞壁肽聚糖为 卜赖氨酸一d 一天冬氨酸盐型，通常缺乏磷壁酸，细胞中一般不含有任何可以鉴别的戊糖 和己糖，广泛存在于人及一些动物的肠道中【l 】，是有益微生物菌群，对维持胃肠道的生 理功能有重要作用。嗜酸乳杆菌是兼性厌氧菌，无氧或低氧分环境下在固态基质表面生 长，5 一1 0 浓度的二氧化碳可以促进嗜酸乳杆菌的繁殖。最适生长温度为3 5 3 8 ， 最适p h 值为5 5 6 0 耐酸性强，能在其它乳酸菌不能生长的环境中生长繁殖1 2 】。营养要 求复杂，需要氨基酸、肽、核酸衍生物、盐类脂肪酸和可发酵的碳酸化合物，能利用葡 萄糖、果糖、乳糖、蔗糖进行同型发酵，发酵产生d l 型乳酸；蛋白质分解力弱。嗜酸 乳杆菌生长繁殖需要一定的维生素等生长因子，最适宜生长温度下培养生长缓慢，生产 周期长；在乳中产酸速率偏低，主要是由于其不完全的蛋白分解酶系、氧化还原电势和 微量元素所致。 1 1 1 嗜酸乳杆菌的健康促进特性和生理功能 健康促进特性是指对人体有益细菌所产生的细菌素、多糖、特殊酶系等，通过改善 机体的微生态平衡，刺激特异性或非特异性的免疫机制，达到增强机体健康、防止某些 疾病的作用。2 0 世纪二三十年代，人们用能在人体胃肠道内存活的嗜酸乳杆菌制备酸奶 并进行临床尝试，发现对便秘、痢疾等疾病产生暂时的缓解作用【3 1 ，嗜酸乳杆菌其健康 促进特性如下： ( 1 ) 生物屏障作用【4 1 嗜酸乳杆菌与肠粘膜上皮细胞相互作用、密切结合，构成了生物屏障；同时，通过 其自身及其代谢物与其它细菌之间的相互作用，调整菌群之间的关系，维持和保证菌群 最佳优势组合以及组合的稳定，阻止了致病菌的定殖和入侵，拮抗致病菌和有害微生物 的生长及其毒素的粘附引。 ( 2 ) 营养作用【6 】 乳酸菌发酵后产生的乳酸，可提高胃内食物的预消化，提高钙、磷、铁的利用率和 维生素d 的吸收。乳糖分解产生的半乳糖，是构成脑神经系统中脑苷脂的成分，与婴幼 儿出生后的生长有密切的关系；产生的大量维生素b 群能促进人体神经细胞的发育；提 大连理工大学硕士学位论文 高人体肠内的d 一半乳糖苷酶的活性，促进奶质中乳糖的吸收，从而缓解乳糖不耐症。 能分泌蛋白酶，促进蛋白质的消化吸收。 ( 3 ) 抗癌作用【7 】 流行病学研究表明，腐败性细菌作用于食物成分和胆汁酸盐类，能生成亚硝基化合 物、胆固醇及胆汁酸的代谢物、氨基酸代谢物( 酚类、吲哚、硫化氢) 等有机致癌物质。 与这些致癌物质有关的肠内细菌酶有p 一葡萄糖醛酸酶、巯基还原酶、偶氮还原酶等。嗜 酸乳杆菌能改善肠道菌群，抑制了致癌物质的产生【8 】；同时，嗜酸乳杆菌及其代谢物活 化了免疫功能，抑制癌细胞的形成和增殖 9 - i 1 1 ( 4 ) 降低胆固醇水平 普遍认为，高胆固醇症是引起心脏发病的主要原因之一，因此降低胆固醇水平意味 着减少心脏病发作的风险，g i l l i l a n d 1 2 , 1 3 等、l i n t l 4 1 等、t h o m p s o n ”1 等对嗜酸乳杆菌降 低胆固醇的能力作了研究，他们指出，在厌氧和胆汁盐存在的情况下，嗜酸乳杆菌能够 明显的降低培养介质中胆固醇的含量。有关乳酸菌降低胆固醇的机理尚不清楚。目前存 在两种看法：一种看法认为，乳酸菌拥有能够修饰胆固醇的酶系，胆固醇能够被细菌细 胞同化；另一种认为，某些乳酸菌种具有使牛磺胆酸和甘氨氮酸两种胆汁酸脱结合的能 力，结合后的胆汁酸影响肠道内脂类物质的吸收，进而导致胆固醇的吸收能力降低。影 响胆固醇的水平。 ( 5 ) 延缓衰老效应 人的衰老与肠内有害细菌产生的氨、胺、硫化氢、吲哚、酚、粪臭素等有害腐败产 物有很大关系。嗜酸乳杆菌代谢产生的乳酸能够抑制这些腐败物，使机体衰老的过程变 得缓慢。 1 1 2 嗜酸乳杆菌的应用 ( 1 ) 在乳品中的应用 乳是乳酸菌良好的天然培养基，含有能促进人类生长发育及维持健康水平的几乎一 切的必须营养成分，被认为是迄今为止一种比较理想的完全食品。乳中含有4 6 一4 9 乳糖【1 6 】，是乳酸菌代谢中重要的碳水化合物来源。因此乳酸菌的应用首先体现在乳制品 上。公元前6 4 1 年就有“酸奶 的记载，诺贝尔医学奖得主梅其尼科夫在2 0 世纪初就提 出“酸奶长寿说 。嗜酸乳杆菌在乳品中应用最多的是发酵乳产品。用于传统酸奶的发 酵菌种主要是保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌。普通酸奶生产所用的发酵菌 种为前两种。前两种菌具有优良的发酵性能并能赋予酸奶良好的风味，但是耐受胃酸和 胆汁酸的性能差，其存活率仅有0 0 1 - 0 6 5 ，也不能在肠道内定殖，所以有益作用受 到很大限制。嗜酸乳杆菌产酸和产黏能力强，但是风味差。与前两种菌结合使用，既能 嗜酸乳杆菌微胶囊化制备方法的研究 获得良好风味，又能发挥其生理功能使发酵乳具有很好的益生作用。s a n d e r 1 7 】( 1 9 9 4 ) 报 道，在法国，含有双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的新型乳制品占整个乳消费量的的4 ，在瑞 典则占2 5 ，而且在产品名称前加“b i o ”即“生物性”。s a n d i n e 报道，利用超滤乳制 得类似于普通乳制品中，含有1 0 8 个m l 活性嗜酸乳杆菌。n i l s o n 1 8 】等报道，在印度，嗜 酸乳杆菌已应用于冰激凌中，这种产品是将嗜酸乳杆菌的细胞制剂加入到冰激凌中，制 成可口、具有疗效的冰冻产品。目前，嗜酸乳杆菌已经用于酸奶、奶酪、酸奶油、马奶 酒等常见的发酵乳制品。基于人们的健康需求看乳品市场前景，嗜酸乳杆菌是理想的第 三代发酵剂。 ( 2 ) 在医药上的应用 嗜酸乳杆菌在医学上的应用主要是由于其所具有的保健作用。自2 0 世纪5 0 年代以 来，抗生素得到了广泛的应用，然而给人们带来的危害也越来越多，长期使用抗生素会 导致肠道菌群紊乱，造成肠道功能失调和耐药菌株增加【1 9 】，因此，人们试图求助于生物 防治疗法。国外嗜酸乳杆菌制剂的研究较为普及，产品种类繁多。德国的m a l u t k a ，法国 的s y n e r l a c 等适用于不同生理，病理人群，具有明显的医疗效果。我国对嗜酸乳杆菌的 研究应用相对较少，如能采用现代的生物技术筛选出具有优良性能的菌株，开发出具有 明显疗效的作用的产品，必将受到消费者的青睐，获得良好的社会、经济效益。 ( 3 ) 在工业上的应用 目前嗜酸乳杆菌在工业上的应用主要是生产乳酸。乳酸是具有重要的工业价值的有 机酸，广泛应用于食品、医药、化工纺织业、电镀等。目前全世界乳酸的产量为3 0 k t 。 我国在1 9 9 4 年于重庆率先生产药用乳酸钙。随着技术的发展，国内外对乳酸菌的发酵、 回收和精致等一系列技术进行了很多研究，以便为嗜酸乳杆菌产乳酸的发展找到一条更 为便捷、经济的方法【2 0 】。 1 1 3 细菌的保存方法 为了使菌种较长时间的存活，并且长期保持其稳定的性状，前人开创了不少保存方 法，原理是根据细菌的生理生化特性，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物 的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长细菌生命以及 使细菌保持原有的性状，防止变异【2 1 1 。 1 。定期移植保存法定期移植保存法又叫传代培养保存法。该法包括斜面培养、液体培 养和穿刺培养等。它是最早使用并且现在仍普遍使用的一种细菌保存方法。该法是将在 适宜培养基上生长良好的培养物，放置低温处保藏，使其停止或者缓慢生长。按细菌在 此条件保存的不同存活期限进行定期移植。 ( 1 ) 半固体穿刺保存法 大连理工大学硕士学位论文 用穿刺接种法将细菌培养物接种于半固体培养基内，在3 7 c 下经1 8 - 2 4 h 培养后 加一层无菌液体石蜡，厚度约l c m ，置冰箱保存，一般可保存3 - 6 个月。 ( 2 ) 斜面保存法 这是最简便最普通的保存方法。即将菌丝生长良好的斜面细菌，置于冰箱内；在4 。c 左右低温下保存，但此后需每隔2 - - - 一3 个月转管移接一次。 ( 3 ) 砂土管保存法 适用于产芽孢的细菌。将过筛后的中性细砂烘干，装入小试管内约l e n a 高，塞以棉 塞，1 6 0 。c 2 h 灭菌烘干备用。用无菌生理盐水洗下培养基上的细菌培养物，制成菌悬液。 吸取此菌悬液约o 5 m l 注入砂土管内，以砂土全部浸湿为准，塞好棉塞，放入干燥器内 抽干，然后放在装有氯化钙( 吸水剂) 的干燥瓶内，置4 。c 冰箱保存备用【2 2 】 2 冷冻干燥法 冷冻干燥法又称真空冷冻干燥，简称冻干。它是将拟保藏的微生物细胞或孢子悬浮 液处于低温冷冻的状态，在真空条件下使其升华，最后达到干燥。低温、隔绝空气和干 燥是保藏菌种的几个重要因素。 以上保存方法，通常用在实验室或研究中心中使用，造价高，如冷冻干燥法虽然保 存时间较长，可以达到几十年，但要求有昂贵的低温设备，条件要求苛刻，以上方法均 要求在无菌条件下操作。本课题所用细菌应用乳制品以及微生物保健品上，为了方便使 用，以及便于工业化生产，需要探索一种新的细菌保存方法。 1 2 微胶囊技术 1 2 1 微胶囊的概念 微胶囊是一种能包埋和保护某些物质的具有集合物壁材的半透性或密封性的微型 “容器”或“包装物。微胶囊的粒径大小因制备工艺的不同而不同，粒径范围通常在 o o l u m 1 0 0 0 u m ，囊壁的厚度一般在0 2 u m 至几微米内。工业上的微胶囊粒径一般在 3 u m 一8 0 0 u r n ，微胶囊可呈现多种形状，如球形、粒状、块状等【2 3 1 。微胶囊技术是一种广 泛的，发展迅速的用壁材包埋芯材制备微胶囊的过程。即利用性能稳定的天然或合成的 高分子物质为壁材，将性能不稳定的固体、液体、气体等芯材物质包埋在其中的过程。 1 2 2 微胶囊制备的主要材料 。 ( 1 ) 芯材【2 4 】 微胶囊内部装载的物料称为芯材。在生产中，其中必要的成分或添加的材料，如需 要改变液体的原性状并且保持其稳定性能，都可以作为芯材物质。它是开发和利用微胶 嗜酸乳杆菌微胶囊化制备方法的研究 囊技术的目的物质。被包覆的芯材可以是油溶性、水溶性化合物或者是其两者混合物， 其状态可以是固态、液态或气态。芯材与壁材的溶解性能必须是不同的，即水溶性的芯 材只能用油溶性的壁材包覆，同理油溶性的芯材必须也得用水溶性的壁材包覆。目前已 知用作芯材的物质如表1 1 所示 表1 1 微胶囊芯材【2 5 】 t a b 1 1t h ec o t em a t e r i a lo fm i c r o e n c a p s u l a t i o n 类别 可作芯材的物质 色素 食品 药物 香料 溶剂 助剂 酸碱 增塑剂 胶粘剂 农用品 生物品 燃料 记录材料 其他 染料颜料无碳复写纸的无色染料 油脂肪调味品香料 阿司匹林维生素氨基酸 香精薄荷油专用组分 醚类酯类醇类石蜡类苯甲苯环己烷甘油水 固化剂阻燃剂发泡剂氧化剂还原剂引发剂 硼酸硝酸苛性碱胺类 邻苯二甲酸酯类磷酸酯类己二酸酯类硅烷类氯代联苯氯化石蜡 胺类环氧树脂类异氰酸酯类多硫化物类热敏较粘剂 杀虫剂除草剂肥料 细胞细菌酶酵母血红蛋白病毒动物胶 核燃料火箭燃料 复印色粉墨水定影剂显色剂卤化银磁性材料液晶光变色材料 相变材料无机粉体金属粘土纤维素等 其中：香料、香精都具有较强的挥发性，易被氧化而改变风味，将其微胶囊化则 可以避免以上缺点；某些液体反应性物质在涂料和黏合剂等中用作固化剂或混合催化 剂，使用前需将两种或三种液体混合，由于它们的使用寿命受到限制，所以在连续生产 流水线上未被应用，如将其微胶囊化，则其应用将不再受到限制；维生素、营养素类 材料等遇到空气易氧化变质的物质，将其微胶囊化是比较理想的选择。对于酸性或碱性 添加剂，为使其不相互发生反应或控制在体内适当的部位释放，最好的方法就是将一种 或几种添加剂微胶囊化。微量元素及其矿物质成分中会含有某些苦涩味或易与其他物质 反应的成分，为防止上述现象的发生，可将其微胶囊化。酶制剂、微生物的微胶囊化可 以提高酶的利用率，节约成本，并有效的保持生物特性【2 6 】。 ( 2 ) 壁材【2 4 】 大连理工大学硕士学位论文 壁材是指用于包裹、制作微胶囊所需的材料，它是决定微胶囊性能的关键因素之一 【2 刀。可以作为微胶囊壁材的物质很多，主要分为天然高分子材料、半合成高分子材料、 全合成高分子材料及无机材料。一般对其要求主要有：成膜性好、性质稳定、无毒、无 刺激性、能与芯材配伍且不影响芯材的作用及含量、对芯材有合适的释放速率、对芯材 无毒、有一定的强度及可塑性，具有符合要求的粘度、渗透性、亲水性和溶解性等；对 于生物环境中应用的微胶囊，壁材还应具备良好的生物相容性【2 引。 表1 2 微胶囊制备的主要壁材【2 5 】 t a b 1 2t h em a i nm a t e r i a lo f t h ep r e p a r a t i o no f m i c r o c n c a p s u l a t i o n 类型材料 天然高分子材料主要包括碳水化合物、蛋白质类、蜡与类脂类等。碳水化合物， 如淀粉、乳糖、纤维素、壳聚糖、海藻酸钠和各种植物胶类( 阿拉伯胶、卡拉胶、角叉 胶、黄原胶、果胶等) ；蛋白质类，如大豆蛋白、明胶、玉米蛋白、乳清蛋白等。 采用蛋白质壁材是由于其乳化性质，能形成具有良好弹性界面膜，且蛋白质本身也有营 养价值，多用于微囊微生物等有生命活性的芯材；蜡为白色或微黄色片状固体，溶于 盐酸等大多数有机与脂类物质，如蜂蜡、石蜡、油脂、脂质体等。最常用的天然高分子 材料为明胶、海藻酸钠和壳聚糖。 ( 1 ) 明胶：明胶是氨基酸与肽交联形成的直链聚合物，通常是m a v ( 平均相对分 子质量) 在1 5 0 0 2 5 0 0 之间不同m r ( 相对分子质量) 的混合物，可生物降解，几乎无 抗原性，用作微囊的用量为2 0 l 1 0 0 9 l ，用作微球的量可达2 0 0 9 l 以上。 ( 2 ) 海藻酸钠：分子式为( c 6 h 7 0 6 n a ) n ，白色或淡黄色不定形粉末，无臭，无味， 易溶于水，吸湿性强，不溶于酒精、氯仿等有机溶剂，其黏度因聚合度、浓度和温度的 不同而不同。海藻酸钠属于一种天然多糖，具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、 黏性和安全性。 嗜酸乳杆菌微胶囊化制备方法的研究 ( 3 ) 壳聚糖( c h i t o s a n ) ：也称几丁聚糖，是甲壳素( c h i t i n ) 经浓碱加热处理脱去n 一乙酰基的产物。为白色或微黄色片状固体，溶于盐酸等大多数有机酸，不溶于水和碱 溶液，易挥发【2 9 1 。壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有来源广泛、无毒、易化学 修饰性、生物相容性，以及具有良好的吸附性、成膜性和可生物降解性等特点。由于其 优越的功能性质和独特的分子结构，壳聚糖作为可生物降解材料用于新型给药系统，通 过改变给药途径可大大提高药物疗效，具有控制释放、增加靶向性、减少刺激和降低毒 副作用，以及提高疏水性药物通过细胞膜、增加药物稳定性等作用特点【3 叩1 1 半合成高分子材料，是常用的一些纤维衍生物，它的特点是毒性低，粘性大，成盐后 溶解度增加，但易水解，因此不宣高温处理，且须现配先用，常见的半合成高分子材料有： 羧甲基纤维素钠( c m c ) 、邻苯二甲酸醋纤维( c a p ) 、甲基纤维素( m c ) 和乙基纤 维素。全合成高分子材料是一类成膜性和化学稳定性均良好的包囊材料，最新合成的体 内可生物降解的壁材现已引起了高度重视。常见的全合成高分子材料有：聚乙二烯 ( p e g ) 、聚乙烯乙醇( p v a ) 和聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 等。 1 2 3 微胶囊技术的研究现状 微胶囊化技术是用特殊手段将固体、液体、气体等物质包埋在一个微小封闭的胶囊 内的技术。在微胶囊技术领域里d e w u r s t e r 和b k g r e e n 可以说是先驱，他们通过一 种巧妙的机械微胶囊化方法，用流化床与干燥箱将悬浮液在空气中细分包覆，开创性的 改进了药物包衣过程。2 0 世纪5 0 年代g r e e n 和美国的n r c 公司利用微胶囊技术于1 9 5 4 年成功研制了第一代无碳复写纸微胶囊，并投放市场实现工业化【3 2 1 。微胶囊技术的的研 究和应用从2 0 世纪3 0 年代开始。1 9 3 6 年大西洋海岸渔业公司在液体石蜡中制备了鱼肝 油明胶微胶囊。1 9 4 9 年，w u r s t e r 发明了微胶囊的空气悬浮法，改进了药物的包衣过程。 1 9 5 4 年g r e e n 3 3 , 3 4 成功的将微胶囊技术应用于无碳复写纸的生产，从而开始了微胶囊 技术的工业化。7 0 年代后，微胶囊技术在世界范围内有了重大突破，各种微胶囊化方法 相继出现，并得到广泛应用。日本在6 0 - 7 0 年代也逐渐赶了上来，日本在8 0 年代中期 开始对双歧杆菌微胶囊化进行探索且发展迅速，取得很多相关专利。丸山哲彦等在1 9 8 5 年申请的一份专利中，将双歧杆菌菌液及淀粉等保护剂与海藻酸钠混合，通过喷嘴喷入 c a c l 2 固化液中，干燥后再用熔点油质喷涂于颗粒表面，制得的产品室温保存6 个月后 存活率在5 0 p a 上【3 5 1 。横田丰一等在1 9 9 2 年采用喷雾冷却法加工双歧杆菌微胶囊，双 歧杆菌菌粉分散于硬化油中，搅拌均匀后喷雾，得粒径4 0 岬6 0 1 a m 的胶囊，产品在胃 液中( p h = 3 ) 存活率9 0 以上【3 6 1 。8 0 年代以来，微胶囊技术的研究取得更大的进展， 不仅发表了许多微胶囊合成技术新专利，而且开发出粒径在纳米范围的纳米胶囊。微胶 囊的应用范围已从最初的药物包覆和无碳复写纸扩展到医药、食品、农药、饲料、涂料、 大连理工大学硕士学位论文 油墨、粘合剂、化妆品、洗涤剂、感光材料、纺织等行业，取得了较广泛的应用【37 1 。近 年来，又出现了许多功能性微胶囊，如近期出现的相变材料微胶囊( m i c r o e n c a p s u l a t e d p h a s e c h a n g em a t e r i a l sm e p c m ) ，就是应用微胶囊技术在固液相变材料微粒表面包覆 一层性能稳定的膜而构成具有核壳结构的复合相变材料，能随环境条件的改变来吸收或 释放出热量，在纺织、建筑、军事、日用品和农业等方面都有较好的应用前景【3 8 印1 ；功 能性生物细菌微胶囊，可实现微胶囊的选择性释放及控制释放，在医药、食品、农药等 各方面也得到了广泛的应用【4 0 1 。微胶囊化方法已经在不同技术领域得到了发展，并越来 越深入到生产、生活的各个方面，作为一项高新技术，已经成为各国学者竞相研究的热 点。 在生物医学领域中，微胶囊技术已在细胞固定化、微生物和动植物细胞的大规模培 养、蛋白质等物质的分离等方面得到广泛的应用。微胶囊化固定技术是最近二三十年才 发展起来的。微胶囊人工细胞是一种超薄球形聚合物膜，膜内可将解毒吸附剂、多酶和 辅酶体系、抗体和抗原等物质包囊固定化，形成与人体细胞相似的“人工细胞 。人工 细胞的膜约0 0 5 9 r n ，具有半透性，能模拟细胞的天然功能，进行与低分子渗透剂的交换反 应，进入人体后，不会被免疫系统识别，能防止免疫反应或其他引起失活或排斥的反应。 临床研究已被微胶囊化的有蛋白质、酶、激素、肽类，甚至应用于活细胞，而不引起活性 损失或变性。具体的类别有固定化活性炭、固定化酶、固定化免疫吸附剂、固定化细胞 及生物组织、人造合成血液、人工合成器官等。近几年，用海藻酸盐一聚赖氨酸一海藻酸 盐作为囊壁材料包囊胰细胞的人工胰可以存活1 年的时间；包囊肝细胞的人工肝可以存 活2 个月的时间；包囊嗜铬细胞可以让受体鼠的镇痛作用持续2 7 0 天，8 0 的病人的镇痛 作用可达到6 0 天【4 1 1 。我国的研究起步较晚，虽然近几年，我国在微胶囊技术上的应用方 面有了很大进展，但同国外相比，仍处于起步阶段，进口微胶囊再生产中仍起着主导作 用。根据市场的需求及我国目前的状况，在国内开展微胶囊技术的研究，特别是在进一 步开发微胶囊技术的应用范围以及深化微胶囊理论基础的研究具有重大意义。 1 2 4 微胶囊的作用 微胶囊之所以被广泛地应用于工业，是由于通过对物质进行胶囊化可以实现许多目 的。无论物质具有亲水性还是具有亲油性，大多数气体、液体、固体、甚至具有生命活 性的细菌、酶等均可以被包囊。广义地说，微胶囊具有改善和提高物质外观及其性质的 能力。具体地讲，微胶囊化主要有以下5 个方面的作用： 1 改变物质的状态、质量、体积和性能 改变物质的状态。将液态物质或气态物质微胶囊化后，可得到微细的粉质，在外 形及使用上具有固体特征，但其内部仍然是液体或气体，因而仍具有原液体或气体的性 嗜酸乳杆菌微胶囊化制备方法的研究 质。例如液态药物f 4 2 】溶解在缓冲溶液中， 存和携带。将放射性药物微胶囊化后， 控制更方便。 微胶囊化后，可制成口服剂或颗粒剂，便于保 可保持放射作用不变，用于诊断、治疗时取用 改变物质的质量、体积。物质的表观密度经微胶囊化后可以变小，也可制成含有 空气或空心的微胶囊而使体积增大。例如透光性微胶囊就是将颜料和部分空气作为芯材 进行包覆得到的，这种微胶囊涂于纸基上，由于含有空气使其密度降低，既达到透光目 的，又不增加纸的质量【棚。 改变物质的性能。通过微胶囊化可以改变物质对所处介质的亲合性，常用方法是 将疏水性药物用亲水性壁材微胶囊化，使其变得亲水。在化妆品中，将不溶于水的物料 微胶囊化后，可分散在水介质中，易于配料和使用f 4 5 】。 2 控制释放：通过选择不同的壁材组合与配比，使芯材在适当的条件下缓慢或立即 释放。控制释放可以产生以下三方面的作用。 隔离活性成分，微胶囊化后囊壁可以将囊内外物质隔离，故能阻止活性物质之间 发生化学反应。在医药中，可将药物与其他敏感物质隔离，例如红霉素遇酸易变质，微 胶囊化后可在一定时间内避免与胃液接触，从而使其保持活性f 4 6 j 。 缓释：主要的应用于医药、农药等领域，将一些药物或活性物质制成微胶囊后， 不但方便口服或注射，更重要的是能使药物缓慢释放，使药效持久，从而可减少服用次 数和服用量，减少生理副作用。例如将乳链菌肤制成微胶囊后，可以延长释放时间，提 高抗菌能力【4 7 1 。杀虫剂、除草剂【4 9 】等农药制成微胶囊后，可提高生物活性，控制释 放速率，减少用药量延长施药周期，减少对农作物的侵害和环境污染。 自动调节物质的含量：用聚苯乙烯包囊聚丙烯酸钠，将此微胶囊引入涂料中，涂 于室内墙面上，由于囊壁是多孔的，而聚丙烯酸钠是吸湿性的，当室内湿度大时，囊芯 的聚丙烯酸钠就吸收并储存水分，湿度下降时，又能将水分释放出来，使涂料具有了湿 度调整的功能【5 0 1 。 3 改善稳定性，保护芯材物质免受环境影响 易挥发、易氧化、光敏性和热敏性的物质经微胶囊化后，可避免直接与光、热或空 气接触，抑制其挥发、氧化、降低光热敏性。有些物质很容易受氧气、温度、水分、紫 外等各种环境因素的影响，通过微囊化，使囊心物与外界环境相隔离。在食品、化妆品 和洗涤剂行业中，经常将香料、香精微胶囊化，以降低其挥发性，保持长久散发香气【5 。 4 降低对健康的危害，减少毒副作痛 如硫酸亚铁、阿司匹林等药物包囊后可以通过控制向消化系统的释放速度来减轻肠 胃副作用。长期服用氨苄青霉素对人体有严重的副作用，微胶囊化可弥补这一缺点。例 大连理工大学硕士学位论文 如抗癌药物化疗剂一般用甲基乙二醛，对人体毒性大，微胶囊化后可以迅速使其从体内 排出，降低副作用。制药工业可以采用微胶囊技术来制造靶制剂，达到定向释放的效果。 5 屏蔽味道和气味 微胶囊化可以用于掩饰某些化合物的难闻味道。抗生素磺胺类药物苦味太大，微胶 囊化可掩盖其苦味；氨基酸有维持机体生长发育的氨平衡功能，能治疗肝病及乙基砷、 苯中毒，但其奇特的臭味使人难以接受，微胶囊化后，就可掩盖其臭味。将有色泽和气 味的中草药液微胶囊化后，可以掩蔽服用时的不良味道，或配制到化妆品中，制得无色 无味的优质化妆品【5 2 】。 1 2 5 徽胶囊的制备方法 微胶囊的制备技术，经历了从传统技术向现代技术的转变。微胶囊制备方法通常根 据其性质、囊壁形成的机制和成囊条件分为物理法、物理化学法、化学法等3 大类【5 3 1 。 在每类方法中依据不同的操作工艺又可进一步分成若干种制备方法。各种制备方法都具 有各自的特点适用范围和适用对象。 ( 1 ) 物理法 物理法是利用物理和机械原理的方法制备微胶囊，具有设备简单、成本低、易于推 广、利于大规模连续生产等优点，在商业领域特别是药品、食品工业经常利用这种方法 来制备微胶囊。目前比较成熟的方法为喷雾干燥法、包络结合法、挤压法、空气悬浮成 膜法等。 喷雾干燥法 5 4 , 5 5 ：工艺特点是芯材均匀分散于壁材溶液中，经雾化器雾化成小雾 滴，使溶解壁材的溶剂迅速蒸发凝固而形成微胶囊。具有处理量大，适宜工业化生产的 优点。缺点是包埋率低、设备大、价格高、耗能大等。这种方法适于热敏性、疏水性、 亲水性及与水反应的物质。 空气悬浮成膜法【5 6 】：工艺特点是悬浮的芯材固体在含有微胶囊壁材成膜液的流化 床中表面形成胶囊。具有壁材层厚度适中且均匀的优点。这种方法适合包埋固体芯材。 包络结合法【5 7 】：工艺特点是将疏水性芯材制成包结络合物，从而形成分子水平上 的微胶囊。具有干燥产品稳定的特点，即使2 0 0 微胶囊也不分解，流动性好，不吸湿， 生产成本较低的优点。缺点是在湿润条件下芯材易释放，要求芯材是非极性，且分子大 小一定，包络量低。这种方法适合油脂、香料和风味料、酸味剂和细胞的胶囊化。 挤压法 5 8 , 5 9 ：工艺特点是先在惰性保护气下使芯材与糖类物质分散，然后通过压 力将其挤入冷却介质中，迅速脱水降温，形成玻璃态微胶囊。具有防止风味物质挥发的 作用。缺点是产率低。这种方法适于热敏感性芯材。 ( 2 ) 物理化学法 嗜酸乳杆菌微胶囊化制备方法的研究 物理化学法主要有水相分离法、油相分离法、熔化分散冷凝法。物理化学法的共同 特点是改变条件使溶解状态的成膜材料从溶液中聚沉出来，并将芯材包覆形成微胶囊。 即通过改变温度、p h 值、加入电解质等，使溶解状态的成膜材料从溶液中聚沉，并将芯 材包覆形成微胶囊。 水相分离法，水相体系中的相分离法可分为复凝聚法、单凝聚法。单凝聚法咖j 的工艺特点是用高分子壁材，将芯材分散于其中后加入凝聚剂，由于大量水分子与凝聚 剂结合，使壁材溶解度下降而凝聚成微胶囊。具有工艺简单，易控制，包埋率较高，可 制成粒径不同的微胶囊等优点。缺点是成本较高。这种方法适于油脂和精油。复凝聚法 【6