（食品科学专业论文）动物性食品中磺胺残留的分析技术.pdf

摘要 编尊 j - v ；， 动物饲养中抗生素的使用非常普遍，例如磺胺类抗生素就被广泛用于预防和治疗食源性 动物疾病。随着公众对食品安全越来越关注，动物源食品中的抗生素残留问题引起重视。由 于在动物饲养中不合理的使用抗生素，会导致食用动物产品中的残留，影响人类的食品安全 性，并有可能污染环境，因此建立动物源食品中磺胺抗生素的残留方法是必要的基于此需 要，本研究主要进行了以下几方面的研究工作： 1 利用g b t 4 7 8 9 2 7 - 2 0 0 3 ，评价微生物法检测牛乳中磺胺残留时的实用性程度该方 法简便、易于操作、不需昂贵的仪器和设备，但该方法费时、不能进行定量分析；最重要的 是，该法对磺胺类检验的灵敏度很低，检出限高于国内外对其残留的控制标准。实用性差 2 建立了以二氯甲烷为提取溶剂，采用加速溶剂萃取、超声波辅助提取和匀浆提取等动 物组织中六种磺胺残留的提取方法，以及相应的高效液相色谱( h p l c ) 分析方法。提取液 通过正己烷净化。在h l 1 c 上采用反相c l s 柱分离、二极管阵列检测、外标定量。 对于加速溶剂萃取，以样品添加回收率为指标，探索了各种提取参数的影响，优化提取 条件，优选出加速溶剂提取法的最适条件为：系统提取压力5 0 0 唧，温度4 0 1 2 ，静态提取5 m i n ，循环3 次，清洗体积为提取池体积的3 0 采用加速溶剂萃取、超声波辅助提取和匀浆提取法分别处理样品，在添加量为o 1m g k g - 时，六种磺胺回收率范围分别达到8 0 - 1 2 0 ，7 0 一1 4 0 ，6 3 - 1 3 0 ，相对标准偏差均小 于9 2 六种磺胺的最低检出限为1 0 峪k g 1 - 1 2 孵l 【g 1 。 通过三种提取方法的比较发现，加速溶剂萃取是一种快速、高效的提取方法，样品处理 时间约为2 3r a i n ，整体分析时间约为1 5h ，适合于动物组织中抗生素残留分析 3 建立了用h p l c 法测定鸡蛋中磺胺类抗生素残留的方法。确定了热加工过程对磺胺残 留的影响行为 样品用乙酸乙酯为提取溶剂、超声波辅助提取两次，正己烷去脂净化处理后进h p l c 分 析，仪器分析条件为：大连依利特h y p e r s i lo d s 2 ( 4 6m m x2 5 0 ，5v i m ) 色谱柱；流动 相为甲醇：0 0 8 乙酸( 3 8 ：6 2 ，v ) ，流速为0 7 0m l m i n 1 ，检测波长为2 7 5n t n ，迸样董 1 0 皿，柱温为室温。在添加量为0 1m g - k g 1 时。六种磺胺的添加回收率达到7 8 8 - 1 0 3 o ， 相对标准偏差在8 5 以下，分析时间大约在2h ，表明该法适用于禽蛋中六种磺胺类抗生素 的同时检测，并且是一个准确、快速和灵敏的手段分析结果表明，随着热处理时间的延长 和温度的提高，鸡蛋中磺胺残留星明显降低趋势，说明它们是影响磺胺类残留量的重要影响 因素之一 关键词：磺胺残留：食品；高效液相色谱；提取；分析材料与方法 a n a l y s i so fs u l f o n a m i d e sr e s i d u e si na n i m a ld e r i v e d f o o d a b s t r a c t t h er i s eo fa n t i b i o t i cd r u g si sp r e v a l e n ti na n i m a lb r e e d i n g , s u l f o n a m i d e sa l ew i d e l yu s e dt o p r e v e n ta n dt r e a td i s e a s co fa n i m a ld e r i v e df r o mf o o d w i t ht h ep u b l i c si n c r e a s i n gc o u c e mw i t h t h ef o o ds a f e t y , r e s i d u e so fa n t i b i o t i cd r u g si na n i m a ld e r i v e df o o ds h o u l da r o u s er e g a r d s t i l e m i s u s eo fa n t i b i o t i cd r u g si na n i m a lb r e e d i n gc 姐c a u s er e s i d u e si na n i m a ld e r i v e df o o d , t h e s e r e s i d u e sc a ni n f l u e n c eh u m a nf o o ds e c u r i t ya n dp o l l u t ee n v i r o n m e n tp o s s i b l y t h e r e f o r e , i ti s n e c e s s a r yt oe s t a b l i s ht h ea n a l y s i sm e t h o df o rt h ed e t e c t i o no fs u l f o n a m i d e sr e s i d u e si na n i m a lf o o d p r o d u c t s t h em a i nr e s e a r c ha r e ai nt h i st h e s i sc a nb ei n c l u d e da sf o l l o w s ： 1 t h em e t h o do fg b t4 7 8 9 2 7 - 2 0 0 3w a se m p l o y e dt oe v a l u a t et h ep r a c t i c a b i l i t yo ft h e m i c r o b i o l o g i c a lm e t h o dt h a tw a su s e dt oa n a l y s i so fs u l f o n a m i d e sr e s i d u e si nm i l k t h i sm e t h o d w a ss i m p l e , e a s yt oo p e r a t ea n da o t 嗍u i r i n ge x p e n s i v ea p p a r a t u so re q u i p m e n t s w h i l e t i m e - c o n s u m i n g , t m q u a n t i t a t i v ew e r ei t ss h o r t a g e ；t h em o s ti m p o r t a n tw a st h a tt h es e n s i t i v i t yo f t h i sm e t h o dw a sv e r yl o w , t h ed e t e c t i o nl i m i tw a sh i g h e rt h a nm a x i m mr e s i d u el i m i t a t i o no f s u l f o n a m i d er e s i d u e si nm i l ka n dt h em e t h o dw a s p o o ri np r a c t i c a b i l i t y 2 e s t a b l i s h e dt h ee x t r a c t i o na n dc o x r e s p o n d i n ga n a l y t i c a lm e t h o do fs i xm l f o n s m i d e s 缸 a n i m a lt i s s u e ，t h ee x t r a c t i n gs o l v e n tw a sd i c h l o r o m e t h a n ea n dt h es a m p l ew a se x t r a c t e db y a c c e l e r a t e ds o l v e n te x t r a c t i o n ( a s e ) ，u l t r a s o n i c - a s s i s t a n t 既妇c 妇a n dh o m o g e n i z a t i o ne x t r a c t i o n r e s p e c t i v e l y , a n dc l e a n e du pw i t hl l - - h e x a n e ，s e p a r a t e do uat t p i cr e v e r s e dc o l u m n ( c ”c o l u m n ) a n dd i o d ea r r a yd e t e c t o ro ) a d ) d e t e c t i o n ，e x t e r n a ls t a n d a r dm e t h o dw a sq u a n t i t a t i v ea n a l y t i c a l m e t h o d f o ra c c e l e r a t e ds o l v e n te x t r a c t i o n , a si n d e xf o rt h ea d d e dr e c o v e r yo fs u l f o n a m i d e s , v a r i o u s e x t r a c t i n gp a r a m e t e r sw e r ei n v e s t i g a t e dt oo p t i m i z et h ee x t r a c t i n gc o n d i t i o n st h a t a f f e c t e dt h e r e c o v e r yo fs u l f o n a m i d a sd u r i n ga s e , t h es u i t a b l ec o n d i t i o n so fa s e 惴a sf o l l o w s ：t h e o p e r a t i n gp r e s s u r ew a s5 0 0p s i , t h et e m p e r a t u r ew a s4 0 c ，t h es t a t i ce x t r a c t i n gt i m ew a s 5m i l la n d t h r e ec y c l e s t h es a m p l et r e a l m a n t 伽a c c e l e r a t e ds o l v e n te x u a c t l o n u l t r a s o n i c - a s s i s t a n te x t r a c t i o na n d h o m o g e n i z a t i o ne x t r a c t i o n ，w h e na d d e dc o n c e n t r a t i o n w a s 0 1 m g - k g 1 ，t h er a n g e o fr e c o v e r y o f t h e t h r e em e t h o d sw a s8 0 - 1 2 0 ，7 0 - 1 4 0 ，6 3 一1 3 0 r e s p e c t i v e l y , a n dt h er e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o nf r s d ) w e r el e s s 也a l l9 2 t h em i n i m l l l nd e t c 3 t i o ul i m i t sf o rt h es i xs u l f o n a m i d e sw a s 1 0 l g 培1 t 0 1 2 陴k g - + 东北农业大学工学硕士学位论文 i tw a sf o u n dt h a tt h ea s ew a saq u i c k l ya n de f f e c t i v e l ye x t r a c t i o nc o m p a r e dw i t ht h eo t h e r t w oe x t r a c t i o n , t h ee x t r a c t i n gt i m ew a s2 3r a i na n dt h et o t a la n s t y s i st i m en e e d e d1 5h t h ea s e w a sf i tf o rt h ed e t e c t i o no f a n t i b i o t i c sr e s i d u e si na n i m a lt i s s u e s 3 ah l g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ym e t h o df o r t h ed e t e c t i o no fs u l f o n a m i d e s r e s i d u e si ne g g sw a ge s t a b l i s h e d ，a n de f f e c to fs u l f o n a m i d e sr e s i d u e si ne g g sd u r i n gt h eh e a t i n g p r o c e s sw a sa l s od e t e r m i n e d t h ee g gs a m p l e sw e r ee x t r a c t e dw i t he t h y la c e t a t eb yn i t r a s o n i c - a s s i s t a n te x t r a c t i o n , p u r i f i e d f r o mf a t sw i t hd - - h e x a u e , t h e na n a l y z e di nh p l c t h ca n a l y s i sc o n d i t i o n sf o s u l f o n a m i d e si ne g g s w e r ea c q u i r e d h y p e r s i lo d s 2c o l u m n ；m o b i l ep h a s e ：m e t h a n o i o 0 8 a c e t i ca c i ds o l u t i o n , v n - - 3 8 6 2 ；w a v e l e n g t h ：2 7 5 n m ；f l o w i n gr a t e ：0 8m l - m i a l ；c o l u m nt e m p e r a t u r e ：r o o m t e m p e r a t u r e ；埘e c t i o nv o l u m e ：1 0 lw h 蛐a d d e dc o n c e n t r a t i o nw a s0 1m g k 旷1 ，t h er e c o v e r i e s o fs i xs u l f o n a m i d e sw e r e7 8 8 一1 0 3 o a n dt h ei t s dw e r el e s st h a n8 5 t h et o t a la n a l y s i st i m e w a s2h s ot h eb u l i tm e t h o dw a sf i tf o rt h ed e t e c t i o uo fs u l f o n a m i d er e s i d u ，a n di tw a saa c c u r a t e ， r a p i da n ds e n s i t i v e i n e a s u f e 1 玉er e s u l ta l s oi n d i c a t e dt h a ts u l f o n a m l d e si ne g g so b v i o u s l y d e c r e a s i n gw i t ht h ep r o c e s s i n gt e m p e r a t u r ea n dt i 卫吟i n c r e a s i n 岛t h i ss h o wt h a tt h et h e r m a ls t a b i l i t y o f s u l f o n a m i d e s 辎i n f l u e n c e db yt h ep r o c e s s i n gt e m p e r a t u r ea n dt i m e k e yw o r d s ：s u l f o n a m i d er e s i d u e s ；f o o d ；h i g hp e r f o m m c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( s p l c ) ； e x t r a c t i o n ；a n a l y s i s c a n d i d a t e ：w up e n g s p e c i a u t y ：f o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o lz h a ox h t h u a 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼；垫遣直甚丝盂重挂型直明鲍：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：善岛日期：1 砗月e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名； 景鹏 日期：豳印年歹月日 导师签名：怂寸i 己日期刁年5 月f 日 引言 1 引言 近2 0 年来，随着我国畜牧业的繁荣和发展，兽药( 包括药物添加剂) 的使用日益广泛， 在降低发病率与死亡率、促进生长、提高饲料利用率和改善产品品质等方面起到十分显著 的作用，己成为现代畜牧业不可缺少的物质基础但是，兽药的使用无疑会导致菩药及其 代谢产物在动物体内的滞留或蓄积，并以残留的方式进入人体及生态系统。兽药残留问题 不仅涉及到广大人民群众的生命安全与健康，还涉及到生产经营企业的经济利益和国家经 济的发展。近年来，我国出口到美国、日本和欧盟等国家的肉类、鱼虾、蜂蜜等农产品因 出现药物残留超标问题，被进口国拒收、扣留、退货、索赔甚至终止贸易的事件时有发生 欧盟于1 9 9 6 年中断我国对其畜禽产品的出口，2 0 0 1 年短暂恢复了我国上海、山东部分企 业的畜禽产品出口，但2 0 0 2 年1 月又宣布全面禁止我国畜禽产品出口欧盟，主要原因之一 就是畜禽产品中的兽药残留闯题( 程冰，2 0 0 4 ) 。据美国f d a ( 食品、药品监督管理局) 透露，去年8 月至今年1 月，美国f d a 共扣留了6 3 4 批中国进口食品，其中的一个重要原 因就是兽药、药物添加剂和黄曲霉毒素等化学物质的污染。此外，我国出口的畜禽产品还 多次出现含安眠酮类、雌性激素、抗生素等药物残留超标而被取消出口的事件( 李凯年， 2 0 0 3 ) 目前，我国肉蛋奶的出口形势仍相当严峻。我国已经加入世界贸易组织，今后发达 国家低价、低残留的动物源性食品势必大量涌入我国，如果不积极采取有效措施，不但我 国的动物源食品出口不畅，而且连在国内市场的地位也会受到严重冲击，更不利于养殖业 的健康发展( 侯为道，2 0 0 4 ) 因此，为保障人类及子孙后代的健康，保护环境卫生以及保 障我国的正常出口贸易，控制兽药在畜禽产品中的残留问题已成为我国的当务之急。 发达国家很早就开始关注兽药残留的问题，欧美等发达国家于7 0 年代即开展了食品中 兽药残留的监测工作，现已形成了非常完善的监测体系? 包括法律法规体系，检测机构、 技术队伍和技术标准体系( 李婷婷，2 0 0 5 ) 。1 9 8 6 年，世界卫生组织( w h 0 ) 和联合国粮 农组织( f a o ) 联合发起成立了食品中兽药残留法典委员会( c c r v d f ) ，中国为4 0 多个 成员国之一该委员会主要宗旨是：控制食品中兽药残留，筛选并建立适用于全球兽药及 其他化学残留分析方法和取样方法；对兽药残留进行毒理学评价；制定动物组织及产品中 兽药残留的最高残留限量及休药期。我国农业部从1 9 9 7 年以来，先后发布了。动物性食品 中兽药最高残留量”的规定，“关于开展兽药残留检测工作的通知”，成立了全国兽药残留 专家委员会，这是我国对药物残留监控、保证动物源性食品安全可靠的有力举措。 1 1 磺胺类抗生素的发展概况 1 9 3 2 年，德国化学家i g a r e r 和m i e t z s c h 首先合成偶氮染料红色百浪多息。1 9 3 5 年， d o m a g k 报道了它对小白鼠溶血性链球菌感染有很强的治疗作用，当时亦有人证明它对人 体的葡萄球菌感染有治疗作用。周年，法国t r e f o u e l s 、n i n i 、b e v e t 和f o u r n e a t t 等研究这 类偶氮化合物的抗菌作用时，发现有效的化合物都含有对氨基苯磺酰胺结构，随后英国学 者c o l e b r o o k ，k a e n m y 等于1 9 3 6 年证明了对氨苯磺胺是百浪多息的有效抗菌成分，并由此 衍生出的一系列化合物，统称为磺胺类药物( s u l f o n a m i d e s , s a s ) ，其分子结构见图1 。 东北农业大学工学额士学位论文 n 心s 啦n 图1 - 1s a s 分子结构式 f i g 1 1c h e m i c a ls t r u c t u r eo fs a s 磺胺类抗生素的发展，一般可分为五个阶段： 第一阶段( 1 9 3 3 年一1 9 3 8 年) 即氨苯磺胺时期：以氨苯磺胺为代表，疗效不高，毒性 很大。 第二阶段( 1 9 3 8 年一1 9 4 2 年) 即磺胺噻唑磺胺嘧啶时期：以磺胺嘧啶为代表，这类抗 生素毒性较大，疗效很高。由于明嘹了药理作用与化学结构之间的关系，各国研究合成磺 胺的工作达到了高峰，合成出来疗效优良的磺胺药这阶段合成的磺胺化合物在当时防治 疾病中起了重要作用，直至今日仍不少应用于临床( 戴自英，1 9 9 2 ) 。 第三阶段( 1 9 4 2 年一1 9 5 5 年) 即磺胺异唔唑和磺胺二甲基异嚼唑时期：以磺胺异嗯唑 为代表，亦称高级磺胺时期，其抗菌活性很强，溶解度及在体内分布得到显著改善：同时 乙酰化率低，对泌尿道毒性极小，但维持药效时间不长，有频繁给药的缺点在这一时期 里，青霉素和其他抗菌素相继发现，并开始用于临床，而原有的磺胺类在抗菌谱和抗菌作 用强度方面都略有逊色，因此磺胺类的发展进入了低潮时期，它在临床上的应用受到一定 影响，合成新磺胺药的研究工作渐趋减少( 沈建忠，2 0 0 0 ) 第四阶段( 1 9 5 5 年一1 9 6 9 年) 长效磺胺药时期：以发展疗效高、毒性低和药效时间长 的磺胺药为方向，代表物为磺胺二甲氧嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶。人体给药，每天一次即可 维持有效血浓度( 戴自英，1 9 9 2 ) 。 第五个阶段( 自1 9 6 9 年开始) 超长效磺胺时期：如周效磺胺，对人和某些灵长类动物 能维持有效血浓度一周，但在多数畜禽体内仅能维持药效1 以天。1 9 6 9 年抗菌增效剂甲氧 苄胺嘧啶( t r i m e t h o p r i m ，简称t m i ) 与磺胺甲基礞唑联合使用，使磺胺药的疗效显著提 高，治疗范围也有了扩大目前已有不少磺胺药与t m p 联合应用，磺胺药从而又进入了 新的发展时期( t h o m a s ，1 9 9 张德昌，1 9 9 8 ) 。 1 2 抗菌作用机制 磺胺类抗生素对多数革兰氏阳性与阴性球菌、某些革兰氏阴性杆菌有抑制作用，各种 磺胺抑菌作用强度不一其抗菌作用原理：一般认为活细胞必须保持活跃的叶酸代谢。人 和哺乳动物细胞能利用外源性叶酸，而细菌不能利用外界现成的叶酸，它必须依靠自身的 酶系统把对氨苯甲酸( p a b a ) 合成为叶酸来维持生长。磺胺类抗生素的化学结构与p b p a 极为相似，与之竞争二氢叶酸合成酶，阻断了四氢叶酸的合成，而后者在嘌呤和嘧啶核苷 酸的生物合成中是碳单位的传递体，从而最终影响了核酸的生成，抑制了细菌的生长繁殖 ( 戴自英，1 9 9 2 ) 。但此时细菌并未此死亡，如过旱停药，易导致细菌复活和疾病复发。磺 胺类抗生素的抑菌作用原理如图2 ： 2 。 引言 磺胺 h ：h 争c o z h 酸 图1 - 2 磺胺抗生素作用原理示意图 f i g 1 - 2t h ea n t i m i c r o b i a lm e c h a n i s m so fs n l f o n a m i d e s 1 3 磺胺类抗生素的动物体内代谢 用于全身感染的磺胺类抗生素经口服后，可被迅速吸收，在2 _ 3h 内血药浓度达到最 高值进入血液的磺胺类抗生素，可广泛分布于全身各组织、细胞和体液中。主要在细胞 外液中，部分穿过细胞膜进入细胞内机体中的磺胺类抗生素，以肝脏和肾脏中浓度最高， 部分进入乳腺、胚胎、胸膜腔和滑膜腔内。磺胺类抗生素可与动物血浆蛋白质结合，其结 合率随动物品种不同存在较大的差异。此外，磺胺抗生素与蛋白的结合率还影响抗生素的 分布、生物转化和捧出，进而影响药效。短效磺胺类抗生素如s m z 半衰期小于8h ，中效 磺胺抗生素s d z 的半衰期在1 0h 以上，长效磺胺抗生素s m m 半衰期则达到1 周。口服易 吸收的磺胺类抗生素在动物体内吸收后，几乎全部由肾脏排泄，经皮肤、胆汁、乳汁也可 捧出一部分，其排泄速度的快慢取决于它们通过肾小管时的重吸收程度；口服不易吸收的 抗生紊几乎全部随粪便排出 磺胺类抗生素在动物体内的代谢分为两个阶段：药物经氧化、还原、或水解、水合及 脱水等反应，进行各种特殊官能团的转化，为第一阶段或一相反应；结合、乙酰化、羟化 反应等，为第二阶段或二相反应，其中乙酰化和羟化反应是主要的代谢方式( 李俊锁，2 0 0 2 ) 乙酰化主要发生于对位氨基上，由n 乙酰基转移酶和乙酰辅酶a 共同催化完成；在嘧啶 环上的5 位和6 位发生羟化反应，羟化产物仍具有抗菌活性各种动物对磺胺抗生素的代 谢速度和程度有着自身规律，不同物种存在着明显差异，如猪的血、尿和组织中检出的代 谢物都是乙酰化产物，检不出羟化物。兔的乙酰化率为6 2 1 ；鱼的乙酰化化率为2 ( 朱 蓓蕾，1 9 9 4 ) 1 4 动物性食品中磺胺类抗生素的来源及危害 1 4 1 来源 作为饲料添加剂，养殖业者使用标有停药期的动物用药品及含药物饲料添加剂后，未 3 东北农业大学工学硕士学位论文 遵守停药期就将禽畜、水产品类及乳蛋品等出售。这是造成药物残留强主要的原因 在治疗动物疾病时错误地使用药扬，如用药量、给药途径、用药部位以及用药种类等 不符合用药指标，有可能延长药物在体内的残留时间，从而需要增加休药天数( 曾蓉，2 0 0 5 ) z a y a s ，2 0 0 4 ) 对于原料乳，有可能存在人为添加抗生紊以提高原料乳的保质能力 1 4 2 危害 磺胺抗生素种类可达数千种，其中应用较广并具有一定疗效的就有几十种。通过任何 途径摄入的s a s 都会在人体中蓄积，会对人类的身体健康产生很大的危害 1 4 2 1 导致细菌耐药性和破坏微生态平衡 食用含有抗生素残留的动物性食品容易诱导耐药菌株的出现，使抗生素失去了治疗 疾病的价值，给人类疾病的治疗带来困难度，甚至可能出现一些药物无法控制的人体细菌 感染。而且体内对该类抗生素敏感的菌株会受到抑制，而不敏感菌株将会大量生长繁殖， 使平衡紊乱，造成条件致病菌过度繁殖而致病、维生素缺乏和紫癫性损伤( f e d e r i c a ，2 0 0 1 ) 1 4 2 2 过敏反应 磺胺能引起人的过敏反应，轻者引起皮肤瘙痒和尊麻，重者引起血管性水肿，严重的 过敏病人甚至出现死亡( 曾蓉，2 0 0 5 ) 1 ，4 2 3 泌尿系统损害 磺胺类抗生素较难溶于水，易在肾小管中形成结晶，代谢所产生的乙酰化产物，更易 形成结晶，可能在肾小管、肾盂、输尿管或膀胱内形成结晶沉淀。因而发生刺激和阻塞现 象，出现血尿、疼痛、尿雨等症状，导致泌尿系统损伤( p r i t h l p a l ，1 9 8 9 tz a y a s ，2 0 0 4 ) 1 4 2 4 血液系统的反应 磺胺药能抑制骨髓的白细胞生成。产生白细胞减少症、偶见粒细胞减少症、可致溶血 佳贫血( 1 h c 蚴，1 9 9 7 ) 1 4 2 5 抑制免疫系统 幼畜及雏禽免疫系统抑制，免疫器官出血及萎缩，家禽类引起产蛋率下降，蛋破损率 和软壳蛋率升高( 朱蓓蕾。1 9 9 4 ) ， 1 4 2 6 其它 头晕、头痛、全身乏力、恶心、呕吐等消化道症状较多见。另外，磺胺二甲嘧啶可能 引起甲状腺癌 1 5 动物性食品中磺胺类抗生素的残留 汤丽芬等人在2 0 0 4 年6 月对广州某地区猪、鸡、鱼肉、肝脏、肾脏共1 4 0 个样本进 行了测定，含量分布特点为：猪、鸡，鱼肉中三种磺胺类抗生素的残留量较低，均在抗生 素最大残留的允许范围内，l l l j 4 , 于1 0 0 , u g k 9 1 ，肝脏、肾脏中的磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶 和磺胺甲嗯唑的最大残留量分别为1 1 0 3 7 士, * z g u g k f f l ，3 8 5 0 士1 4 7 l , g - k g 1 ，1 0 8 。8 士6 7 9 g k g - 1 ，可见动物内脏中磺胺类抗生素的残留量严重超出最大残留量标准，且超出最大残 留限量标准的动物内脏样本所占的百分比如下表( 汤丽芬，2 0 0 3 ) ： 4 引言 表1 - 1 样本中各抗生素超出最大残留限量标准的百分比 t a b l e1 - 1t h ep e r c e n te x c e e dm a x i m a lr e s i d u el i m i t so fa n t i n i o t i cd r u g si ns a m p l e s 刘清等人在2 0 0 3 年调查了兰州地区鲜牛乳中4 种磺胺类抗生索残留的情况高教液相 测定样品。在1 3 5 个被检样品中阳性样品5 1 个。占被监测样品的3 7 7 8 ；含两种以上磺 胺类阳性样品1 0 个，占被监测样品的7 4 1 ，检出范围过宽、残留中位数值较高，根据农 业部1 9 9 9 年发布的动物性食品中兽药最高残留限量的要求衡量检测结果。符合要求低 于最高残留限量的样品数为“个占6 2 2 2 ，阳性样品5 1 个占3 7 7 8 。表1 - 2 是检测的具 体结果( 刘清，2 0 0 3 ) 表1 2 兰州地区2 0 0 3 年鲜牛乳中磺胺类抗生素残留检测结果 t a b l e l - 2 t h es u l f o n a m i d er e s i d u e s i n s p e c t e d o f f r e s h m i l k 白m t a n z h o l l i n2 0 0 3 2 0 0 4 年，侯为道等人为了解成都地区动物源性食品中兽药残留水平，采用分层多极整 群随机抽样p p s ( 按容量比例概率抽样) 确定，高效液相测定样品，总阳性检出率为8 3 8 7 ， 磺胺类阳性检出率为1 2 5 8 6 。阳性超标率为8 5 7 1 ，残留量在0 0 2 3 一1 0 6 0 0 m g 培1 之间。 具体结果如表1 - 3 ( 侯为道，2 0 0 4 ) 由此可见，成都市2 0 0 4 年某地区动物源性食品中磺 胺类药物残留问题较为严重。 表1 - 3 成都地区2 0 0 4 年动物源性食品中磺胺药物残留检测结果 t a b l e1 - 3t h es u l f o n a m i d er e s i d u e si n s p e c t e do fa n i m a lp r o d u c t sf r o mc h e n g d ui n2 0 0 4 5 东北农业大学工学硕士学位论文 1 9 9 9 年，r o m a n h i r s c h 等人报到了德国农业地区灌溉水( 包括地下3 - 5 米深的地下水) 、 河流水中1 8 种抗生素的残留情况，其中包括磺胺甲嘿唑和磺胺二甲基嘧啶。在5 9 个被检 样品中，抗生素的含量相似，四个样品中检出磺胺。磺胺甲嚼唑在在地下水中的浓度为0 0 4 g l - 1 ，灌溉水中的最大残留量为0 4 8 , u g l 1 在两个水样品中均检测到磺胺- e p 基嘧啶， 浓度分别为o 0 8 u g - u 1 和0 1 6 m g - u 1 ( h i r s c h r ，1 9 9 9 ；c h r i s t i a n t ，2 0 0 3 ) 。 由以上这些数据充分反映出，目前养殖中磺胺类抗生素滥用的现象非常严重，并且用 药方式不规范，抗生素残留和蓄积严重，已经不仅存在于动物体内，甚至在日常用水中也 产生富集，而人们长期食用这样的食物和饮用这样的水，势必会引起人群食源性疾病的流 行，对人体的健康造成严重危害。 1 6 磺胺类抗生素的最大残留限量 由于磺胺类抗生素广泛地用于畜牧业，造成相应产品中( 如兽肉与相关产品、牛奶和 奶制品等) 残留的抗生素将损害人类的健康。为人类的食用安全考虑，西方发达国家对此 类抗生素有严格规定，如世界卫生组织( w h o ) 、美国f d a 、国际食品法典委员会( c a c ) 和欧美等大多数国家规定食品和饲料中的磺胺总量及磺胺二甲基嘧啶等单个磺胺的含量不 得超过0 im g k g 1 ，日本规定食品中不得检出磺胺抗生素( 庄无忌，1 9 9 5 ) 表1 4f a o w h o 兽药法典委员会关于磺胺抗生素最高残留的规定 t a b l e1 - 4m a x i m a lr e s i d u el i m i t so fs u l f o n a m i d e se s t a b l i s h e db yf a o w h o 表1 5 日本磺胺类抗生素的最高残留限量 t a b l e l - 5m a x i m a lr e s i d u el i m i t se s t a b l i s h e do fs u l f o n a m i d e si nz a p a n 6 引言 表1 - 6 我国动物性食品中磺胺抗生素最大残留限量规定 t a b l e l - 6m a x i m a lr e s i d u el i m i t se s t a b l i s h e do fs u l f o n a m i d e si nc h i l l a 注lf = f a t 脂肪，m ，m e a t 肌肉。l 【：k i d n e y 肾，l = l i v e r 肝，m i lm i l k 乳 1 7 动物源食品中磺胺残留的研究进展 几十年来，人们对食品和饲料中磺胺残留的检测进行了深入全面的研究。从早期的分 光光度法( u y ) ( g e o r g e 等，1 9 6 3 ；r i c h a r d ，1 9 7 8 ) 、荧光法( f l ) 、薄层色谱法( t ic ) 、 气相色谱法( g c ) 到2 0 世纪8 0 年代以来的液相色谱( h p l c ) 、气相色谱- 质谱法( g c m $ ) 、 液相色谱，质谱法( 珊l ( 孙缁) 、毛细管电泳法( c e ) 和超临界流体色谱法( s f c ) 等。其 中采用最多的是反相h p l c 法，在前处理方法中固相萃取( s p e ) 、超临界流体萃取( s f e ) 、 免疫亲和色谱法( i a c ) 等经常被用于药物的提取和净化。下面介绍几种常用的动物性食 品中抗生素残留检测和提取方法 1 7 1 样品前处理方法 现代兽药残留分析方法通常包括分离和检测两个基本方面，样品分离是核心，兽药残 留检测是复杂混合物中痕量组分的分析技术，最显著的特点是需要严格的样本前处理步骤。 样品处理的最终目的是将待测组分从样品基质中分离出来，并达到仪器能够捡测的状态， 其主要作用包括将药物从样品中释放出来、除去样品中干扰杂质。样品处理过程通常包括 三项基本内容：提取、净化和浓缩。通常采用的样品前处理方法有以下几种： 1 7 1 1 液一液萃取 通过调整p h 值，进行液液萃取是s a s 残留分析中一种经典的提取方法，可以分为四 类：单一溶剂提取；混合溶剂提取；酸、碱、缓冲溶液提取；酸或缓冲溶液加溶莉提取。 各种方法的提取效率没有显著差异，根据测定抗生素的种类、样品基体的性质、采用的净 化手段以及检测的仪器不同而有所不同，多残留方法一般采用有机溶剂进行提取。由于s a s 的两性，使得液- 液分配也成为其残留分析的一种重要净化手段。刘清、n f u r u s a w a 等人 7 东北农业大学工学硕士学位论文 建立了动物组织中磺胺类残留检测的样品前处理方法，基本采用固液提取、液液萃取脱脂 等前处理步骤，样品的基质干扰比较大，因此用l c m s 检测，灵敏度只达到5n g g - 1 ( 刘 清，2 0 0 3 ：f u m s a w an ，2 0 0 0 ) 。 1 7 1 2 微波辅助萃取( m e ) m a e 具有萃取时间短、试剂用量少、污染低、回收率高和自动控制等优点，其提高萃 取效率的途径可概括为三点：其一，直接作用，微波穿透样品，与某些物质的分子或基团 作用，使该分子或基团很快与样品基质或大分子分离，达到快速萃取的目的；其二。使用 极性溶剂来吸收微波能，从而提高溶剂活性，增强溶剂提取效能；其三，采用密闭容器。 微波萃取可以在高于溶剂沸点的温度和较高的压力下进行，分子运动加快，从而提高微波 萃取的速率( b a k e r s a ，1 9 9 8 ) 。a k h t a r 等用甲醇作溶剂，通过家用微波炉辅助提取，c 1 8 s p e 柱净化，柱后衍生化，h p l c u v d 测定猪组织中的磺胺二甲基嘧啶。提取时用2 份2 0n l l 甲醇每次微波辐射2 5s ，总提取时问不足1r a i n ，测定冻干样品的回收率明显优于均质方 法，对湿样品则变化较大，方法的定量限为2 j 口g k g 1 ( a k h t a rhm ，1 9 9 8 ) 1 7 1 3 超声波辅助提取( s a e ) s a e 提取的作用有两方面：通过空化作用使分子运动加快；同时将超声波的能量传递 给样品，使组分脱附和溶解加快。蒋定国等建立了肌肉、内脏及虾中磺胺二甲嘧啶残留的 高效液相色谱检测技术：用二氯甲烷超声提取3 次。提取液与2 硫酸钠水溶液进行液液 分配，下层有机相经脱水、浓缩后用o 0 2m o l l 1 盐酸溶解浓缩瓶中残留物，以正已烷去除 脂溶性杂质，经0 4 5 z m 滤膜过滤后供h p l c 测定。结果表明此方法的线性范围为0 2 - 3 0 p g m l 1 ，方法的最低检出浓度为2 1 # g k g 1 ，在5 0 - 1 0 0 # g k g 1 的加标水平，方法平均回收 率为7 6 6 - 9 3 6 ，相对标准偏差为4 4 0 o - 8 4 ( 蒋定国，2 0 0 3 ) 。a u s t i n ( 1 9 9 0 ) 以0 0 1 7 m 磷酸- 乙腈为流动相，测定猪肉中多种磺胺抗生素残留，采用超声振荡5 1 0 r a i n ，离心、 过滤后分析，克服了经典分离技术费时费力、有机溶剂消耗量大的限制。 1 7 1 4 超临界流体萃取( s f e ) s p e 于2 0 世纪年代开始用于环境和残留分析，超临界流体的密度与液体相似，但 溶质分子在其中的扩散系数却比在液体中要大得多，而且超临界流体的表明张力小，容易 渗透进入样品中，其萃取速度比普通溶剂要快的多( p e n s a b e n e 。1 9 9 7 ) f u r u s a w an 将鸡 蛋样品与基体分散剂混合，装入下填中性氧化铝的萃取池，在4 0 c ，6 8 m p a 的条件下用二 氧化碳进行萃取，磺胺被提取后吸附于氧化铝上，经磷酸缓冲溶液和甲醇洗脱后，用 h p l c u v d 检测，测定波长为2 6 5n n l 。该法的检测限为2 5 弘g k g - 1 回收率在8 1 - 1 0 1 之问(