（食品科学专业论文）石仙桃多糖及乙酸乙酯提取物化学成分的研究.pdf

福建农林大学硕士学位论文 捅费 药用植物石仙桃为兰科石仙桃属植物，其药用部位假鳞茎或全草具有多种药 用价值，然而目前有关其有效成分的研究甚少。国内外尚未出现有关石仙桃多糖 的研究报道。本文主要对石仙桃多糖的提取、结构、性质及抗氧化活性进行探讨， 并对石仙桃乙酸乙酯提取物进行初步分离和分析。结果如下： 1 、在研究不同提取条件对多糖提取率的影响的基础上，采用正交试验优化 石仙桃多糖的提取条件。得到石仙桃多糖的最佳提取条件为：浸提温度为8 0 ， 浸提时间为5 h ，料液比( v ：v ) 为1 ：4 0 ，最佳提取率为2 2 5 。比较了盐析法 和s e v a g 法两种除蛋白方法。结果表明，盐析法较s e v a g 效果好，且更经济。 2 、测定了石仙桃的总糖含量，得知石仙桃总糖含量为3 3 5 2 。采用高效 凝胶渗透色谱法测定了石仙桃多糖的分子量，其平均分子量为4 5 2 0 0d 。用乌氏 黏度计测定了石仙桃多糖的特性黏度，为1 5 5m l g 。 采用超滤技术分离不同分子量大小的石仙桃多糖，并分别测定了它们的特性 黏度，结果表明，多糖的特性黏度随着分子量的减小而减小。 3 、采用2m o l l 三氟乙酸封管水解石仙桃多糖，t l c 及h p l c 分析反应了 不同时间( 1h ，2 h ，3h ，4 h ，5h ，6h ，7 h ，8h ) 后的降解物，分析了降解时 间对降解物的影响。由结果可知，降解时间对降解物有一定影响，体现在：降解 物在硅胶板上的斑点逐渐上行至r f 为0 6 处，且最终呈现一个斑点；在高效凝胶 色谱图中的出峰时间逐渐推迟，6h 后基本不再发生变化。经h p l c 、i r 及n m r 分析，结果表明，石仙桃多糖主要由甘露糖通过& 1 ，4 糖苷键聚合而成。 4 、分别利用f e n t o n 体系、邻苯三酚自氧化法产生o h 及0 2 ，研究了石仙 桃多糖的抗氧化活性。结果显示石仙桃多糖具有较好的抗氧化活性，抗氧化能力 随浓度增大而增强；粗多糖的清除自由基能力大于脱蛋白多糖；二者的清除自由 基能力均大于或与v c 相当。 5 、石仙桃化学成分预试验结果表明，石仙桃水溶液含有糖、氨基酸、蛋白 质、酚类、鞣质、强心苷、甾体、萜类、有机酸、皂苷。 t l c 分析乙酸乙酯提取物，结果显示，展开剂为环己烷：四氯化碳：乙酸 乙酯= 1 ：1 ：l 时，展开显色后得到6 个点，而且分离效果最好。 乙酸乙酯提取物经过硅胶柱层析分析后，得到一个白色结晶，服图谱分析 福建农林大学硕士学位论文 表明，其结构中可能含有o h 和c o o h 。此外，经薄层层析鉴定合并的2 8 6 3 部分分离得到三个组分，6 4 6 8 合并部分分离得到两个较纯的物质。 乙酸乙酯提取物经过薄层层析展开、h p l c 分析后，a 斑点分离得到四个组 分，b 斑点分离得到六个组分。 关键词：石仙桃；多糖；提取；性质；结构；抗氧化：化学成分 1 1 福建农林大学硕士学位论文 s t u d yo i lp h o l i d o t ac h i n e n s i sl i n d lp o l y s a c c h a r i d ea n d c h e m i c a lc o n s t i t u e n t so fe t h y la c e t a t ee x t r a c t i o n a b s t r a c t p h o l i d o t ac h i n e n s i sl i n d l ，o n ek i n do fh e r b a lm e d i c i n e ，i sam e m b e ro fo r c h i d f a m i l y i t sp s e u d o b u l bo rt h ee n t i r eg r a s sh a sg r e a tm e d i c i n a lv a l u e s ，h o w e v e r ，t h e s t u d i e so nt h ef u n c t i o n a lc o m p o n e n t so fi ta r er e a l l yf e w t h er e p o r t sa b o u tp h o l i d o t a c h i n e n s i sl i n d lp o l y s a c c h a r i d ew h i c hi so n ec o m p o n e n to fp h o l i d o t ac h i n e n s i sl i n d la r e n o tf o u n da l lo v e rt h ew o r l d t h i sa r t i c l em a i r d ys t u d i e dp h o l i d o t ac h i n e n s i sl i n d l p o l y s a c c h a r i d e se x t r a c t i o n ，s t r u c t u r e ，n a t u r ea n da n t i o x i d a n t i v ee f f e c t ，a n dc a r r i e do n t h ep r e l i m i n a r ys e p a r a t i o na n da n a l y s i st ot h ee t h y la c e t a t ee x t r a c t i o np a r t t h er e s u l t s o ft h ee x p e r i m e n tw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h eb e s te x t r a c t i o nc o n d i t i o no fp h o l i d o t ac h i n e n s i sl i n d lp o l y s a c c h a r i d ew a s t h a t ：t h et i m eo fe x t r a c t i o nw a s5h o u r s ，t h er a t i oo fs a m p l et ow a t e rw a sl ：4 0a n dt h e t e m p e r a t u r eo fe x t r a c t i o nw a s8 0 u n d e rt h eb e s te x t r a c t i o nc o n d i t i o n s ，t h e e x t r a c t i o ne f f i c i e n c yo ft h ep o l y s a c c h a r i d eo fp h o l i d o t ac h i n e n s i sl i n d lw a s2 2 5 t w om e t h o d so fe l i m i n a t i n gp r o t e i nw e r es t u d i e d ，a n dt h es a l t m g - o u tm e t h o dw a sb e t t e r a n dm o r ee c o n o m i c a lt h a ns e v a g sm e t h o d 2 t h ep h o l i d o t ac h i n e n s i sl i n d l st o t a ls u g a rc o n t e n tw a sd e t e r m i n e d ，a n dt h e r e s u l tw a s3 3 5 2 t h em o l e c u l a r w e i g h t o fp h o l i d o t ac h i n e n s i sl i n d l p o l y s a c c h a r i d ew a sd e t e r m i n e db yh p l c ，a n di t sm o l e c u l a rw e i g h tw a s4 52 0 0d a l t o n t h ep h o l i d o t ac h i n e n s i sl i n d lp o l y s a c c h a r i d e si n t r i n s i cv i s c o s i t yw a s1 5 5m l g d i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h ts i z eo fp h o l i d o t ac h i n e n s i sl i n d lp o l y s a c c h a r i d ew a s p r e p a r e db yt h eu l t r a f i l t r a t i o n ，a n dt h e i ri n t r i n s i cv i s c o s i t yw a sd e t e r m i n e ds e p a r a t e l y b yt h eu b b e l o h d ev i s c o m e t e r i tw a sd i s c o v e r e dt h a tt h e i ri n t r i n s i cv i s c o s i t yr e d u c e d a l o n g 、析t ht h e i rm o l e c u l a rw e i g h t 3 d e g r a d e dt h ep o l y s a c c h a r i d eu n d e r110 埘m2m o u lt r i f l u o r o a c e t i ca c i d i nav a c u u mt u b ef o rd i f f e r e n tt i m e ( 1h ，2b3h ，4ha n d5h ，6k7k8h ) t os t u d y t h ee f f e c to fd e g r a d a t i o nt i m eo nt h ed e g r a d a t i o np r o d u c t s t h ee f f e c tw a ss t u d i e db y t l ca n dh p l c t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ed e g r a d a t i o nt i m eh a dac e r t a i ni n f l u e n c e m 福建农林大学硕士学位论文 o nt h et h ed e g r a d a t i o np r o d u c t s a f t e rh p l c ，i ra n dn m r a n a l y s i s ，i tw a ss h o w e dt h a tt h ep h o l i d o t ac h i n e n s i s l i n d lp o l y s a c c h a r i d ew a sm a i n l yc o n s t r u c t e db ym a n n o s et h r o u g h0 【一1 ，4 一g l u c o s i d e b o n d 4 t h ee f f e c to ns c a v e n g i n g o ha n d o z 。o fp h o l i d o t ac h i n e n s i sl i n d l p o l y s a c c h a r i d ew a ss t u d i e db yf e n t o ns y s t e ma n dp y o r g a l l o la u t o x i d a t i o nm e t h o d r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：t h ep h o l i d o mc h i n e n s i sl i n d lp o l y s a c c h a r i d e h a dag o o da n t i o x i d a n t i v ea b i l i t y ；t h ea b i l i t yi n c r e a s e da l o n gw i mt h ed e n s i t y ；t h e c r u d ep o l y s a c c h a r i d e sa b i l i t yw a ss t r o n g e rt h a nt h ep u r i f i e dp o l y s a c c h a r i d e s ，b u t t h e i ra b i l i t yw a sa l ls t r o n g e rt h a no re q u a lt ov c s 5 a f t e rc h e m i c a lc o n s t i t u e n t s p r e t e s t i n ge x p e r i m e n t ，i tw a sd i s c o v e r e dt h a tt h e c o m p o n e n t so fp h o l i d o t ac h i n e n s i sl i n d li n c l u d e ds u g a r ，a l n i l l oa c i d ，p r o t e i n ， p h e n o l s 、t a n n i n 、c a r d i a cg l y c o s i d e s 、s t e r o i d 、t e r p e n e 、o r g a n i ca c i da n ds a p o n i n s t h ee t h y la c e t a t ee x t r a c t i o np a r tw a sa n a l i e db yt l c ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t w h e nt h ed e v e l o p i n gs o l v e n tw a sc y c l o h c x a n e ：c a r b o nt e t r a c h l o r i d e ：e t h y la c e t a t e = 1 ：1 ：l ，a f t e rl a u n c h i n gt h ec o l o r a t i o n , 6s p o t sw e r eo b t a i n e d ，m o r e o v e rt h es e p a r a t i o n e f f e c tw a sb e s t t h ee t h y la c e t a t ee x t r a c t i o n p a r t w a sa n a l i e d b ys i l i c a g e l c o l u m n c h r o m a t o g r a p h i c aw h i t ec r y s t a lw a so b t a i n e d ，a n di t si rm a pd e m o n s t r a t e dt h a t t h e r ew e r ep o s s i b l y o ha n d - c o o hi ni t ss t r u c t u r e i na d d i t i o n ，t h r e ec o m p o n e n t s w e r eo b t a i n e di np a r t2 8 - 6 3 ，t w op u r em a t e r i a l sw e r eo b t a i n e di np a r t6 4 - 6 8 a f t e rt c aa n dh p l ca n a l y s i s ，f o u rm a t e r i a l sw e r eo b t a i n e df r o ma s p o to f e t h y la c e t a t ee x t r a c t i o np a r t ；s i xm a t e r i a l sw e r eo b t a i n e df r o mbs p o to fe t h y la c e t a t e e x t r a c t i o np a r t k e y w o r d s ：p h o l i d o t ac h i n e n s i sl i n d l ；p o l y s a c c h a r i d e ；e x t r a c t i o n ；n a t u r e ；s t r u c t u r e ； a n t i o x i d a n t i v ee f f e c t ；c h e m i c a lc o n s t i t u e n t i v 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：冻勿乡压掘日期：砌力莎易侈 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。盯 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：饧洛花日期：加缈矿易眵 指导教师亲笔 晰缈譬参阳 福建农林大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 石仙桃的研究进展 石仙桃( p h o l i d o t ac h i n e n s i sl i n d l ) 又名石上莲、石橄榄、石穿盘、石萸肉 等，是一种常见的药用兰科石仙桃属植物，药用部位为假鳞茎或全草，主要分布 在福建、广东、广西、贵州、云南等南方省份【1 1 。 1 1 石仙桃的药理药效学研究现状 石仙桃具有养阴、清肺、利湿、消瘀的功能，可治疗眩晕、头痛、咳嗽、吐 血、梦遗、痢疾、白带、疳积，民间常用来治疗高血压、头晕及其他原因引起的 头痛【1 1 。临床研究证实石仙桃可以治疗眩晕、头痛、轻度脑震荡，用石仙桃提取 物制成的头痛定糖浆可治疗神经性头痛，总有效率达9 0 ，疗效显著 2 1 。 现代社会，由于疾病后遗症、压力等各种原因引起的神经性头痛控扰着很多 人的生活、工作，根据k u r t z k e 调查，美国1 9 8 2 年年发病率2 5 0 l o 万，患病率 2 0 0 0 1 0 万。我国1 9 8 3 年六大城市调查表明偏头痛年发病率2 0 2 1 0 万，患病 率5 2 3 9 1 0 万【3 】。石仙桃是一种草药，它能够通过调节神经，促使血管扩张， 增加脑部供血，从而缓解头痛。此外，它还具有麻痹作用，从而可以镇痛镇定【2 】。 1 1 1 石仙桃的镇痛作用 石仙桃的水提液具有镇痛作用，民间常服用石仙桃全草水煮汤药，来治疗头 痛。刘建新等 4 1 采用热板法、醋酸扭体法、电刺激致痛法研究石仙桃的镇痛作用。 结果显示出石仙桃提取液明显抑制冰醋酸引起的小鼠扭体反应；显著提高热板法 和电刺激致痛小鼠的痛阈；且呈剂量依赖性。说明石仙桃具有镇痛作用。刘洪旭 等【5 】对石仙桃药理活性部位进行了研究。他们通过小鼠扭体法、热板法等镇痛药 理试验方法考察了石仙桃水提取物的镇痛作用，同时比较石仙桃水提物不同极性 溶剂萃取部位的镇痛效果。发现石仙桃水提取物及水提取物的乙酸乙酯萃取部位 能明显提高热板引起的小鼠痛阈值，减少冰醋酸致小鼠的扭体次数，表明石仙桃 具有一定的镇痛作用，石仙桃乙酸乙酯萃取部位可能是石仙桃镇痛作用的有效部 位。 1 1 2 石仙桃对中枢神经系统的抑制作用 石仙桃水提物同样具有镇定、抗惊厥作用。刘建新等【6 】通过分析石仙桃提取 液对小鼠自发活动、戊巴比妥钠睡眠时间、阁下催眠剂量戊巴比妥钠的作用及对 福建农林大学硕士学位论文 小鼠电惊厥的影响研究了石仙桃镇定和催眠作用，发现石仙桃提取液明显减少小 鼠的自发活动，延长小鼠戊巴比妥钠催眠时间，增强阈下催眠剂量戊巴比妥钠的 作用并有一定的抗惊厥作用且呈剂量依耐性，说明石仙桃提取液具有镇静、催眠 和抗惊厥作用。同时刘建新等【4 】也研究发现石仙桃提取液具有镇静、催眠和抗惊 厥作用。 1 2 石仙桃化学成分的研究现状 据文献记载，石仙桃全草含三萜化合物：虫漆蜡醇( l a c c e r 0 1 ) 、环石仙桃醇 ( c y c l o p h o l i d o n o l ，4 0 t ，1 4 0 t ，2 4 ，2 4 一t e t r a m e t h y l - 9 p ，1 9 一c y c l o 一5 a c h o l e s t - 2 5 - e l l 一3 p - o i ) 、 环石仙桃酮( c y c l o p h o l i d o n e ) 等。马雪梅等【7 8 】从兰科植物云南石仙桃p h o l i d o t a y u n n a n e n s i sr o 抬中首次分离出三个三萜类成分和一个甾醇类成分，经理化常数 和光谱分析，分别鉴定为c y c l o p h o l i d o n e ( i ) ，c y c l o p h o l i d o n o l ( i i ) ，2 5 一 m e t h y l e n e c y c l o a r t a n y l p - h y d r o x y - t r a n s c i n n a m a t e ( i i i ) 和b - 谷甾醇( ) ，其中为 一新成分，命名为p h o l i d o t a n i n 。另外还以酸性染料比色法测定了贵州产云南石 仙桃茎的总生物碱含量为0 0 7 5 ；参考有关方法测定了云南石仙桃的多糖含量 为1 7 6 5 。毕志明等【9 】以9 5 乙醇提取云南石仙桃，硅胶柱色谱分离，用u v 、 i r 、m s 、h n m r 、c n m r 和h m b c 等方法确定结构，分离并鉴定了四个酚类成 分，分别为e u l o p h i o l ( i ) ，i u s i a n t h r i d i n ( h ) ，d e n s i f l o r o lb ( i i i ) 和b a t a t a s i n i i i ( n ) ， 以及四个其他类型的化合物：3 ，5 二甲基氧一4 羟基苯丙酮( 3 ，5 d i m e t h o x y 4 h y d r o x y p r o p i o p h e n o n e ，v ) ，( 2 4 r ) 6 p h y d r o x y2 4 一e t h y l c h o l e s t 一4 - e n 一3 - o n e ( v i ) ， 5 a ，8 a e p i d i o x y - 2 4 ( r ) - m e t h y l c h o l e s t a - 6 ，2 2 一d i o n - 3 p o l ( ) ，胡萝卜苷( ) 。 这些化合物为研究者首次从石仙桃属植物中分离得到。 2 多糖的研究现状 多糖是来自高等植物、动物和微生物的天然大分子物质，一般多糖常由二十 个以上单糖通过糖苷键聚合而成。它是生物体内的重要组成物质，是维持生命活 动正常运转的基本物质之。大量研究表明，其中植物多糖如薄荷、人参、猴头 菇等均具有显著的药用功能。f r a n z 等【地1 1 】报道说已经有近百种植物的多糖被分 离提取鉴定出来，这类多糖来源广泛，而且没有细胞毒性，对机体毒副作用小。 此外，多糖在食品工业等其他方面也有广泛的用途【1 2 - 1 5 】。因此，对多糖的深入研 究将为探讨多糖类药物治疗奠定基础，为多糖在保健食品、环保领域、农业成产、 2 福建农林大学硕士学位论文 化妆品等方面发挥独特的应用价值奠定基础。 2 1 多糖的提取分离 多糖的提取分离是指多糖研究之获取研究对象的过程。一般包括提取、分离 纯化和纯度鉴定。其中分离纯化是多糖研究的关键，其成功与否、效果好坏都会 直接影响后续研究的可行性与可信度。 2 1 1 多糖的提取方法 多糖的提取方法和技术在不断改进和创新，但对于同一种方法和技术又需在 不同植物多糖的提取中研究考察。在选取提取分离方法的同时，应当根据目标多 糖的特点、物理化学性质，综合比较，进行实验，选取最佳方法和提取工艺。 溶剂提取法【1 6 17 1 。这是提取多糖的常用的方法，一般用水做溶剂，加热提取， 提取的多糖大多是中性多糖。这种方法以水作为提取媒介，对植物组织穿透力强， 提取效率高，在生产上使用安全，被广泛应用。 酸碱提取法。有些多糖适合用稀酸或碱液提取，才能得到更高的提取率，提 取时应根据提取多糖的性质不同，使用不同的酸碱提取法，而且应该严格控制酸 碱度【1 8 】。因为某些多糖的糖苷键在酸碱度较高时，多糖中的糖苷键可能被水解。 此外，稀酸或稀碱提取液应迅速中和或迅速透析、浓缩与醇析，以获得多糖沉淀。 酶提取法。近年来，酶技术发展已成为一种广泛应用的有效成分提取技术。 在应用酶技术提取多糖，可以通过在较较温和的条件下分解植物组织，加速多糖 的释放和提取，从而增大多糖的提取效率。此外，使用酶还可以分解提取液中淀 粉、果胶和蛋白质等物质，常用的酶有蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等。 超声辅助提取法。超声的机械化学作用通过破坏细胞壁和加强细胞内的传质 作用，提高了植物中有机化合物的提取速度【1 9 】。超声波在液体内传播时，液体 介质不断受到压缩和拉伸，在拉力作用下，液体断裂形成暂时的近似真空的空洞， 压缩时，这些空洞就会发生崩溃，出现局部高温以及放电现象，产生空化作用 2 0 】。 超声波空化可以从稳态空化转化成瞬态空化，空化泡瞬间长大破裂，吸收的能量 在极短的时间和极小的空间内释放出来，形成高温高压的环境，同时伴随有一定 强度的冲击波和微声流，从而破坏细胞壁结构，使其在瞬间破裂，释放细胞内的 有效成分，大大提高了提取率。从药草和颉草属植物中得到乙醇溶液萃取物的过 程中，超声方法比传统方法更有效率【2 l 】。与传统萃取相比，超声萃取可以从不 福建农林大学硕士学位论文 溶于乙醇的植物残基中获得更多的水溶性多糖，其提取率从9 增加到1 0 ， 提高了1 嘣2 2 】。超声可能会导致可溶性多糖发生降解，并溶解在乙醇溶液中，这 些是超声的不足之处。然而，超声并不影响水溶性多糖的生物性能【2 3 】。因此， 超声辅助提取法是一种高效实用的多糖提取方法。 微波辅助提取法。微波提取过程中，微波辐射导致植物细胞内的极性物质， 尤其是水分子，产生大量热量，使得细胞内的温度迅速上升，液态水汽化产生的 压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞，进一步加热，导致细胞内部和细 胞壁水分减小，细胞收缩，表面出现裂纹。由于孔洞和裂纹的存在，胞外溶剂容 易进入细胞内，溶解并释放胞内多糖。j o nl u n d q v i s t 等人【2 4 】应用微波加热从云杉 碎片中提取得到水溶性半纤维素多糖。 超临界c 0 2 萃取法。超临界c 0 2 萃取法是采用c 0 2 作为流体的一种超临界 萃取方法。在超临界状态下，超临界流体与目标物接触，使其依次把极性、沸点 和分子量大小不同的成分萃取出来，当恢复到常压和常温时，溶解在流体中的成 分立即以溶于吸收液的液体状态与气态流体分开，从而达到分离目的【2 5 1 。另外， 超临界流体的密度和介电常数随着密闭体系的压力增加而增加，极性增大，利用 程序升压，可以将不同极性的成分进行分步提取【2 6 】。 2 1 2 多糖的分离纯化方法 对于从浸提液中分离多糖，目前大多采用沉淀法，尤其是传统的乙醇沉淀是 目前最广泛采用的方法【2 7 之引。由于从浸提液中分离得到的多糖一般都含有大量的 蛋白质，所以多糖在进一步纯化前要先除尽蛋白质。除去多糖中蛋白质的常用方 法主要有：( 1 ) s e v a g 法【2 9 】：将提取液与有机溶剂( 氯仿与正丁醇体积比5 ：1 ) 混合，比例为5 ：1 ，剧烈振荡2 0 3 0m i n ，离心，去除沉淀。重复此过程若干次， 直至上清液中无蛋白质被测出( 用茚三酮法测定是否还有蛋白质残余) 。( 2 ) 三 氯乙酸法【3 0 】：在多糖水溶液中滴加3 三氯乙酸。直至溶液不再混浊为止，在5 1 0 放置过夜，离心去除沉淀，即得到不含蛋白质的多糖溶液。( 3 ) 盐析法【3 1 】： 将多糖溶液浓缩到一定体积后按5 0 ：1 ：1 ( 多糖溶液：3 0 硫酸锌：1 0 亚铁 氰化钾) 的体积比例加入蛋白沉淀剂，混匀，静置3 0r a i n 后，离心去除蛋白质， 上清液即为不含蛋白的多糖溶液。( 4 ) 酶法【3 2 】：蛋白酶可以除去与多糖结合在 一起的蛋白质。此法效率高，但易使多糖蛋白质的复合物分解，造成某些多糖 4 福建农林大学硕士学位论文 蛋白质复合物特有的生理活性降低。一般先用蛋白酶使蛋白质部分水解解离后， 再与s e v a g 法结合效果更好【3 3 】( 5 ) 三氟三氯乙烷法【3 4 】：将三氟三氯乙烷加入到 多糖溶液中，两者比例为1 ：1 ，搅拌1 0m i n ，离心，收集上层水层，再用上述 溶液处理2 次，即得到不含蛋白的多糖溶液。 去除蛋白后的多糖需要进一步纯化，以便进一步研究多糖。纯化多糖的方法 很多，但是往往只用某一单一的方法不能得到纯的多糖，所以一般都需要结合两 种以上方法才行。归纳目前常用的方法主要有如下几种【2 7 之8 3 5 1 ：( 1 ) 分步沉淀 法：这种方法适宜于分离各种溶解度相差较大的多糖，根据不同多糖在不同浓度 的低级醇或酮分步沉淀。( 2 ) 盐析法：根据不同多糖在不同浓度盐溶液中具有不 同溶解度的性质，加入不同盐析剂使之逐步析出。常用的盐析剂有氯化钠、氯化 钾、硫酸铵等，以硫酸铵为佳。( 3 ) 季铵盐沉淀法：主要是根据长链季铵盐能与 酸性多糖形成水不溶性多糖化合物的特征，可以分离酸性多糖及中性多糖。常用 的季铵盐是十六烷基三甲基溴化铵( c t a j b ) 。控制季铵盐的浓度，能分离各种不 同的酸性多糖。形成的沉淀能溶于不同的盐溶液、酸溶液和有机溶剂，能够使多 糖游离出来。( 4 ) 纤维素阴离子交换剂柱层析：是目前最常用的方法之一。常用 的交换剂是d e a e 纤维素。此法适合于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。 当d h 为6 时，酸性多糖能吸附于交换剂上，而中性多糖不吸附，当用相同p h 、 不同离子强度的缓冲液洗脱时，酸性强弱不同的多糖分别被洗脱下来。另外，离 子交换剂柱层析中，许多杂质如色素等还牢牢吸附于柱上端，从而提高了多糖的 纯度。( 5 ) 凝胶柱层析：该法是多糖分离中常用的方法之一，其原理是根据多糖 分子的大小和形状不同而达到分离的目的。常用的凝胶有葡聚糖凝胶( s e p h a d e x ) 及缓冲液，但缓冲液的离子强度最好不低于o 0 2m 。( 6 ) d e a e s e p h a d e xa 2 5 或a - 5 0 柱层析：近年来常用于多糖的纯化，它将离子交换和凝胶层析柱一并完 成。( 7 ) 超滤法：超滤技术是一种膜过滤技术，其作用原理主要是筛分作用【3 q ； 分子的大小是分离的基础，此外分子的形状和电荷也起重要作用。利用膜的选择 性，在膜的两侧存在一定量的能量差作为推动力，通过溶液中各组分通过膜的迁 移速率的不同而实现非均相物系的分离。 2 2 多糖结构的研究 多糖结构具有复杂性和多样性，对其结构的研究是多糖研究的重点。多糖的 福建农林大学硕士学位论文 结构分类沿用了蛋白质和核酸的分类方法，也包括了一级结构、二级和二级以上 的高级结构，其结构含义与内容都较蛋白质、核酸要复杂和丰富得多。用于研究 多糖结构的多糖必须具有很高的纯度。 2 2 1 多糖的纯度鉴定 因为多糖分子量的多分散性，它在分子大小上便表现为连续变化，所以多糖 的纯度只代表某一多糖的相似链长的平均配布。因此多糖的纯度标准不能用通常 化合物的纯度标准来衡量。我们通常所说的多糖纯品实质上是指一定分子量范围 的均一组分。 目前，用于多糖纯度鉴定的方法一般有以下几种【3 5 】：旋光测定法、高压电 泳法、超速离心法、毛细管电泳法和凝胶过滤法等。其中凝胶过滤法是目前实验 室最常用的方法，该法操作简单，不需要特殊仪器，准确度高。当洗脱曲线只显 示单一对称峰时，即认为多糖为纯品。 2 2 2 多糖一级结构的研究方法 多糖的结构测定是比较困难的，但解剖多糖的低级和空间结构，对于明确多 糖的生物学功能具有重要的意义。 对多糖一级结构的阐明已建立了许多分析方法，随着现代分析技术的出现与 发展，新技术不断引入到糖链的结构分析中【3 7 】。 化学方法：主要有水解法、高碘酸氧化法、s m i t h 降解、甲基化反应。现分 别介绍如下： ( 1 ) 水解法：将多糖链通过完全水解分解为各个单糖，是分析多糖链组成 成分的主要手段。水解法包括完全酸水解、部分酸水解、乙酰解和甲醇解等。完 全酸水解：将多糖用强酸( 硫酸、盐酸) 等试剂处理，在一定温度下( 8 0 1 0 0 c ) 进行完全酸水解( 4 - 1 0h ) 。水解之后的多糖经中和、过滤，可采用纸层析 c ) 、 薄层层析( t l c ) 、气相色谱法( g c ) 、液相色谱法( l c ) 【3 8 】和离子色谱法( i c ) 【3 9 】 进行分析。部分酸水解：利用多糖链中部分糖苷键如呋喃型糖苷键、位于链末端 的糖苷键和支链上的糖苷键易水解脱落，而构成糖链的主链重复结构的部分和糖 醛酸等对酸水解则相对稳定的特点，对多糖常采用部分酸水解法处理。多糖经部 分酸水解后，经醇析、离心后，将上清液和沉淀分别进行分析。多糖部分酸水解 之后的醇析产物往往是多糖的主链重复性结构片段、糖醛酸链片段，从这些小片 6 福建农林大学硕士学位论文 段可以推测多糖链的一些结构特点。乙酰解：将多糖与乙酐、冰醋酸、浓硫酸等 混合反应，可得到乙酰化单糖，目的也是用于单糖组成分析。甲醇解：利用 h c l c h 3 0 h 溶液把多糖的半缩醛甲基化，形成甲基糖甙后再经衍生或不衍生进 行g c 或h p l c 分析，甲醇解的优点在于半缩醛被保护起来，使异构体物减少， 有利于分辨。 ( 2 ) 高碘酸氧化法：高碘酸可以选择性的氧化断裂糖分子中的连二羟基或 连三羟基处，生成相应的多糖醛、甲酸，反应定量进行。每开裂一个c c 键消 耗一分子高碘酸，通过测定高碘酸的消耗量和甲酸的生成量，可以获得糖苷键的 位置、连接方式、支链状况和聚合度等结构信息。 ( 3 ) s m i t h 降解：s m i t h 降解是将高碘酸氧化产物还原后进行酸水解或部 分水解。由于糖基之间以不同的位置缩合，用高碘酸氧化后则生成不同的产物， 由降解产物来获取多糖的结构信息。 ( 4 ) 甲基化反应：将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，进而 将甲基化多糖水解，水解后得到的化合物，其羟基所在的位置即为原来单糖残基 的连接点。根据不同甲基化单糖的比例，可以推测这种连接键型在多糖重复结构 中的比例。多糖的甲基化方法较多，有p u r d i e 法、h a m o r t h 法、m e n z i e s 法、 h a k o m o r i 法等m 。目前，最常用的甲基化方法是改良h a k o m o r i 法【4 。 酶学方法：利用0 【糖苷酶和p 糖苷酶对多糖底物的催化反应来确认多糖 链中糖苷键类型，利用酶学方法分析糖肽连接方式。除了内切酶，许多外切酶也 在糖链分析中广泛使用，如唾液酸酶、p 半乳糖苷酶、0 【甘露糖菅酶和b 乙 酰氨基葡萄糖苷酶等。酶学方法最大的缺陷在于酶解结束后需要很多次的分离和 确定产物的流体动力学体积。为了解决这个问题，试剂阵列分析方法( r e a g e n t a r r a ya n a l y s i sm e t h o d ，r a a 孕育而生【37 1 。它将酶解方法的操作简化为只要将 纯化的多糖样品等分为几个试样，再将每个试样与某各种精确设定的外切糖苷酶 混合物保温酶解，这种特定酶混合物就叫作试剂阵列。合并每次酶水解的产物， 再对产物库进行一次凝胶渗透色谱分离，把分离图谱与计算机数据库中的图谱进 行对照即可确定结构。 免疫学方法 3 5 】：抗原和抗体会相互结合，一定结构的多糖( 寡糖) 会抑制抗体 抗原的相互结合，不同的糖( 半抗原) 有不同的抑制常数。当某种未知结构的糖链 福建农林大学硕士学位论文 对抗原和抗体的结合产生了抑制，通过测定其抑制常数，再与已知结构的糖链相 比较，有相近抑制常数的多糖，其结构也相似。 仪器分析法：用于糖链结构分析的仪器主要有比旋光仪、紫外分光光度计、 红外光谱【3 5 4 1 1 仪、液相色谱仪、质谱、核磁共振、拉曼( i l n a n ) 光谱【3 5 4 2 1 等。除 了传统的分析技术，现代分析技术的出现和发展以及仪器之间的联用，大大推动 了糖链结构的研究工作。 ( 1 ) 比旋光度仪【4 l 】：利用较大的比旋正数常是洳糖苷键，较大的比旋负 数常是p 糖苷键的特点，利用比旋数来为糖链a 、p 苷键的判断提供参考。 ( 2 ) 气相色谱和液相色谱：g c 和l c 主要应用于单糖和甲基化单糖的分 离和鉴定，为多糖的组分分析提供依据。g c 需要对样品进行衍生化，液相则可 直接进样。除应用于单糖和甲基化单糖的分离鉴定化，还常用于多糖的分离和纯 化操作以及多糖分子量的测定。 ( 3 ) 质谱( m s ) ：质谱灵敏度高，结构信息直观，尤其8 0 年代出现的 f a b m s ( 快速原子轰击质谱) ，使得高极性、难挥发且热不稳定的糖及其混合物 的直接分析成为可能，气相色谱质谱联用已应用于甲基化产物的鉴别。最近几 年来，在糖分析中的质谱技术又有了新的发展，如电喷雾电离质谱( e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n m s ，e s i m s ) 、基质辅助的激光解吸电离质谱( m a t r i x 。a s s i s t e dl a s e r d e s o r p t i o nl n o i z a t i o n ，m s ，m a l d i m s ) ，m a l d i 电离出的离子常用飞行时间 ( t o f ) 来检测，它是一种飞行时间质谱仪。 ( 4 ) 核磁共振( n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ，n m r ) ：n m r 主要解决多糖结 构中糖苷键的构型以及重复结构中单糖的数目。p a g e f s 技术【4 3 1 ( 荧光基团标记 的糖的聚丙烯酰胺凝胶电泳) ，它是通过对糖类分子的还原端羰基进行荧光基团 衍生化标记后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，这既增强了糖分子的检测灵敏度，又使 通常呈中性的糖类分子带上电荷，在电泳系统中进行分离，可以对多个样品平行 地进行分离和定性分析。 2 2 3 多糖分子量的测定方法 有些多糖的生物活性与其分子量有关，例如硫酸多糖的抗凝血作用与它的分 子量有关，低分子量的右旋硫酸多糖具有抗凝血作用，作为抗血栓药物己经在临 床上使用。a l b a n 等1 研究了多糖的分子量与抗凝血活性的关系，认为多糖的活 8 福建农林大学硕士学位论文 性与相对分子质量呈哑铃型曲线关系。卡拉胶抗病毒活性在定范围内随着分子- 量增加而增加【4 5 】。化学降解肝素和硫酸多糖，得到的两种低分子量化合物的抗 h i v l 的活性大大高于初始提取物 4 6 1 。 多糖分子量测定的方法主要有【3 5 j ：渗透压法、蒸汽压法、端基法、光散射 法、粘度法和凝胶过滤法等。其中凝胶过滤法是目前最常采用的方法，其原理是 不同分子量的多糖在凝胶柱上的洗脱体积与分子量的对数呈线性关系。 2 3 多糖的生物活性 多糖作为生物体内一种重要的组成成分，具有多方面的生物活性，如抗肿瘤 和免疫促进、抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖等。 2 3 1 多糖的抗氧化活性 抗氧化多糖的作用机理。目前，对抗氧化多糖的研究表明，抗氧化多糖的作 用机理可能有以下两种：( 1 ) 多糖分子间接作用于自由基本身。具体又可以分为 两种：多糖分子直接作用于抗氧化酶。通过提高体内原有抗氧化酶如：s o d 、 c a t 、g s h p x 等的活性，间接发挥抗氧化作用。多糖分子络合产生活性氧所 必需的金属离子。多糖结构中的醇羟基可以与产生o h 等自由基所必需的金属 离子如f e 2 + 、c u 2 + 等络合，使羟自由基的产生受到抑制，进而影响脂质过氧化的 启动，最终抑制活性氧的产生【4 7 1 。( 2 ) 多糖分子直接作用于自由基本身。对于 脂质过氧化而言，多糖分子可以直接捕获脂质过氧化链式反应中产生的活性氧， 阻断或减缓脂质过氧化的进行；对于o h 而言，多糖碳氢链上的氢原子可以与 其结合成水，达到清除o h 的目的，而多糖的碳原子则因此成为碳自由基，并 进一步氧化形成过氧自由基，最后分解成对机体无害的产物；对于超氧阴离子自 由基而言，多糖可与其发生氧化反应，达到清除的目的【4 扪。 多糖的抗氧化性与其结构有关，t s i a p a l i 等【4 9 】研究了葡聚糖和其衍生物的抗 氧化活性，结果表明硫酸化和磷酸化的葡聚糖的抗氧化活性比未经硫酸化和磷酸 化的葡聚糖强，说明多糖的荷电性可能与其抗氧化性有关