（发酵工程专业论文）白细胞介素1受体拮抗剂仿生亲和纯化的研究.pdf

摘要 摘要 白细胞介素1 受体拮抗剂( i n t e r l e u k i n 一1r e c e p t o ra n t a g o n i s t ，i l l r a ) 与白细 胞介素一1 ( i l 一1n ) 、白细胞介素1b ( i l lb ) 共为白细胞介素一1 ( i l 一1 ) 家族 的一员，他们参与机体的炎症和免疫防御反应，包括许多急性和慢性炎症的病理 过程。1 1 1 r a 是拮抗剂家族的一员，主要通过白细胞介素1 受体( i l 一1 r ) 起作用， 它与i l 一1 竞争性与i l 一1 r 结合，从而控制i l 1 的活性，这种方法已经成为治疗 许多疾病的主要手段。目前i l i r a 已在临床上试用于治疗败血症、类风湿性关节 炎、炎症性肠道疾病、哮喘、髓源性白血病，以及移植物抗宿主反应等疾病，并 获得了一定的效果。 临床需要大量i l l r a ，但是由于缺乏特异性亲和配基，其纯化是限制i l l r a 应用的瓶颈。为了探索简单高效的i l l r a 的纯化工艺，我们根据文献报道的i l i r a 的结构特点，构建可结合i l l r a 的随机化学配基库，固相合成这些介质，以i l l r a 发酵液为原料筛选实验表明，这些配基中p u k t r p 纯化i l ir a 的效果最好。 层析条件优化实验表明：固定化p u k t r p 吸附i l l r a 的最佳条件为1 0 m m o l 1 的 磷酸缓冲液( p h 6 ，电导率3m s c m ) ；洗脱的最佳条件为1 0 m m o l 1 的磷酸缓冲液 ( p h 6 ，电导率3 6m s c m ) 。在此层析条件下，配基p u k t r p 的最佳上样量为每克 配基l 样2 2 5 m gi l ir a ，介质对i l i r a 的表观吸附容量为1 3 5 m g g 干胶。采用 二述条件进行i l i r a 的制备纯化，用高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 和s d s p a g e 电泳进行产品的纯度和回收率分析，结果 表明一步纯化的i l ir a 的纯度可达9 9 8 ( 电泳纯) 、9 6 5 ( h p l c 纯) ，回收率 为6 2 8 。 配基稳定性实验表明，配基p u k t r p 经2 m o l 1 的n a o h 溶液3 7 。c 处理7 天7 夜，吸附容量没有变化，i l 1 r a 的纯度也没有变化，这说明亲和介质的稳定性很 高，适用于大规模工业生产。对纯化后的样品进行w e s t e r n b l o t t i n g 分析，结果看 出，纯化所得样品与兔抗i l l r a 血清具有很高的亲和作用，证明纯化得到的样品 是有活性的、是所要的i l 一1 r a ，而且得到的样品的纯度也非常高。 关键词：仿生配基；白细胞介素一1 受体拮抗剂；纯化 华南理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t i n t e r l e n k i n 一1r e c e p t o ra n t a g o n i s t ( i l l r a ) i sam e m b e ro ft h ei n t e r l e u k i n 一1 ( i l - 1 ) f a m i l y i l l a n di l 一1ba r et h ea g o n i s tm e m b e r s o ft h i sf a m i l y ：t h e ya r ei n v o l v e di n m a n y i m m u n ea n di n f l a m m a t o r yp r o c e s s e s ，i n c l u d i n gp a t h o l o g i c a le v e n t so fa c u t ea n d c h r o n i ci n f l a m m a t i o n i l i r ai st h ea n t a g o n i s tm e m b e ro ft h ef a m i l y ：i te x e r t si t s a c t i v i t yb yc o m p e t i n g w i t hi l 一1f o rb i n d i n gt oi t sr e c e p t o r s t h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo f i l lr ao nt h ei l le f f e c t sm a k e si tac a n d i d a t ef o rt h e r a p e u t i cu s ei nan u m b e ro f p a t h o l o g i e s i n w h i c hi l l a c t i v i t y i si n v o l v e d i l - ir ai su s e di n t h e r a p e u t i c i n t e r v e n t i o no f s e p t i c s h o c k ，r h e u m a t o i da r t h r i t i s ，a s t h m a ，m y e l o i dl e u k a e m i a ， g r a f t v e r s u s h o s td i s e a s e ，a n dt h er e s u l ti n d i c a t e di l 一1r ai s v e r y e f f e c t i v ei nt h e c l i n i c a la p p l i c a t i o n d u et ot h el a r g ea m o u n to fi l i r ar e q u i r e df o rt h e r a p e u t i ci n t e r v e n t i o na n dl a c k o fs p e c i f i ca f f i n i t yl i g a n d s ，t h ep u r i f i c a t i o np r o c e d u r e si si t sa p p l i c a t i o nb o t t l e n e c k t h e r ei san e e dt of i n das i m p l e 、r o b u s tp u r i f i c a t i o nm e t h o d b a s e do nt h ei l 一1r a s t r u c t u r a lc h a r a c t e r i s t i c s ，ab i o m i m e t i cl i g a n dl i b r a r yw a sd e s i g n e d ，a n ds o m el i g a n d s w e r es y n t h e s i z e dw i t hs o l i da p p r o a c h l i g a n dp u k t r pw a sf o u n dt ob em o r e r o b u s ta n d s e l e c t i v ef o ri l 一1r ab ys c r e e n i n gt h el i b r a r y t h e p h a n dt h es a l tc o n c e n t r a t i o nt h a tl i g a n dp u k t r p p u r i f i e d i l i r aw e r e o p t i m i z e d ，t h eb i n d i n gw a sa t 1 0 m m o l 1s o d i u mp h o s p h a t eb u f f e r ( p h6 ，3m s l c m ) ， a n dt h ee l u t i o nw a sa t1 0 m m o l 1s o d i u mp h o s p h a t eb u f f e r ( p h6 ，3 6m s c m ) a tt h e e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，t h em o s ts u i t a b l ep r o t e i ns a m p l eo fa d d i n gt ol i g a n dp u k t r p w a s2 2 5 m g g d r yg e l ，t h ea p p a r e n tc a p a c i t y w a s1 3 5 m g gd r yg e l o n es t e p p r e p a r a t i v ec h r o m a t o g r a p h yo fi l l r as h o w e dt h a t t h ep u r i t yo ft h ep r e p a r e di l i r a w a s9 9 ，8 ( s d s p a g e ) a n d9 6 5 ( h p l c ) ，t h er e c o v e r yw a s6 2 8 s t a b i l i t yw a st e s t e db yt r e a t m e n tw i t h2 m o l 1 o v e r7 d a y sa t3 7 i tw a sf o u n d t h ei l 一1r ab i n d i n gc a p a c i t i e so fi m m o b i l i z e dp u k t r pw e r en o ta l t e r e d ，t h ep u r i t yo f p u r i f i e di l l r aw e r e n o ta l t e r e d t h es t a b i l i t ym a d ei m m o b i l i z e dp u k t r pv e r ys u i t a b l e f o r s c a l e d u pp u r i f i c a t i o n o fi l l r a t h e p r e p a r e d i l l r aw a s p e r f o r m e d w e s t e r n b l o t t i n ga n a l y s i s ，t h e r e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e p r e p a r e d i l i r ah a v eh i g h a f f i n i t ya c t i o nw i t hr a b b i ta n t i i l l r as e r u m ，s ow e k n o w e dt h a tt h ep r e p a r e ds a m p l e h a v eb i o l o g i c a la c t i v i t y ，i tp r o v e dt h a tt h ep r e p a r e ds a m p l ew a si l - l r a k e y w o r d s ：b i o m i m e t i cl i g a n d ；i n t e r l e u k i n 一1r e c e p t o ra n t a g o n i s t ；p u r i f i c a t i o n u 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：镀舵趟 日期：少午年j 月名日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密碱 ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 作者签名：和扣f 2 导师签名：美砘础 日期：伽午年月7 日 日期：2 口口年石月夕日 第一章绪论 第一章绪论 1 1 白细胞介素一1 受体拮抗剂的产生和结构 自细胞介素一1 受体拮抗剂( i n t e r l e u k i n 1r e c e p t o ra n t a g o n i s t ，i l 1 r a ) 与1 l 一1 a 、i l 一11 3 共为i l 一1 家族的一员。多种细胞可以产生i l ，1 r a ，如单核细胞、巨噬 细胞、角质细胞、滑膜细胞及某些内皮细胞。单核细胞既可以产生i l 一1a 和i l 一1 1 3 ，也可以产生i l 1 r a ，脂多糖( l p s ) 刺激单核细胞2 4 小时后产生近似等量的 i l 一10 和i l 一1r a t , 1 。佛波酯( p m a ) 、i l 一3 、转化生长因子( t g fb ) 、i l 一4 可诱导 单核细胞产生i l l r a 蛋白或迅速表达i l i r a m r n a t 2j 。粒细胞一巨噬细胞集落刺激 因子( g m c s f ) 刺激单核细胞分泌i l 一1 r a 的量高于i l 一1d 及i l lb ，粘附i g g 刺激单核细胞只产生i l l r a ，而不产生i l 一10 。f a b i o 报告的多形核细胞( p m n ) 产生i l l r a ，用i l 一4 、l p s 、肿瘤坏死因子( t n f ) 、g m c s f 、粒细白集落刺激 因子( g c s f ) 促进p m n 表达i l i r am r n a ，并产生i l l r a 蛋白，而i l 1 、y 一 干扰素( i f ny ) 和趋化因子无此作用 3 1 。一些骨髓细胞系在植物血凝素( p h a ) 和g m c s f c 刺激下，其上清中有i l l r a 的存在。 在疾病状态下，许多组织如滑膜、皮肤组织中的巨噬细胞可产生i l l r a ； 间质性肺炎患者的肺部巨噬细胞也可产生i l i r a ；在感染和炎症中i l l r a 含量 明显升高，如在实验性内毒素败血症动物模型中，首先发现高于i l 一1b1 0 0 倍的 i l l r a 。在内毒素血症患者体内检测i l l r a 的含量达到8 0 0 0 n g l ( 正常不超过 2 0 0n g l ) f 2 1 。相反，在螺旋体属感染人的血液单核细胞产生多量的i l 一11 3 及少 量的i l l r a ，急性骨髓白血病细胞只产生i l lb ，而i l l r a 产生极其微量t 4 1 。 1 9 9 0 年，e i s e n b e r g 等从人的单核细白基因文库中克隆了i l 1 r ac d n a ，分子 量在2 2 0 0 0 2 5 0 0 0 ，基因长1 8 k b ，又编码1 7 7 个氨基酸的开放阅读框架，并带有 短的3 末端翻译区和长的57 末端翻译区，其中2 5 个氨基酸为信号肽。成熟的 非糖基化的i l i r a 含有1 5 2 个氨基酸，分子量为1 7 1 2 6 4 3 d a ，等电点为5 4 6 。与 i l 1b 氨基酸序列有2 6 3 0 的同源性，与i l 一1q 氨基酸序列有1 9 的同源性。 基因结构与i l 一1 相似，i l 。l r a 、i l lb 及i l 1 三种分子的基因都定位在第二条 染色体上，从结构、功能、基因定位来看，三种分子是三个结构相关的多肽，但 基因编码不同，不同细胞产生的i l l r a 有一定的差异，主要在于糖基化的程度不 同。鼠与人的i l 一1 r a 蛋白质有7 7 同源性。 1 2i l 1 r a 的生物学活性 i l 一1 在体内外具有广泛的生物学活性，i l l r a 与i l 1 受体结合后，虽无激活 作用，但可消除或减轻i l 一1 的生物效应，从而影响机体的病理生理过程。 华南理工人学硕十学位论文 1 2 1i l 一1 r a 与免疫调节 机体内i l l 和i l i r a 之间的平衡和比值对机体免疫状态和内环境稳定十分重 要，但在疾病因素存在时，由于i l 一1 和i l l r a 基因调控机理不同，i l 一1 有效表达， 而i l i r a 却表达量低，产生病理状态，故给予外源性i l lr a 有助于恢复i l i i l lr a 的平衡。i l lr a 除调节i l l 功能外，还可增加i l 一2 对n k 细胞的杀伤作用，可能 与抑制环氧酶产生有关，也与i f n 抗病毒、抗肿瘤作用密切相关。 1 2 2i l l r a 与神经内分泌系统 脑细胞可产生i l 一1r a ，大鼠脑室内注射i l i r a 【_ 1 ：消除i l 一1 造成的发热、非快 速动眼期睡眠。i l 1 r a 还存在于胸与神经内分泌有关的部位，可能参与i l 1 的作 用而阻断外周神经的再生。i l l r a 还能够阻止i l 一1b 对胰岛素产生细胞的抑制作 用。i l 1b 能抑制人绒毛膜促性腺素刺激大鼠l e y d i g 细胞产生睾酮，人的i l l r a 可以消除这种抑制。此外，i l l r a 还能抑制i l 一1 诱导的小鼠死亡、低血糖病、i l 一6 产生和皮质酮分泌。 1 2 3i l l r a 与细胞因子网络 细胞因子网络是调控机体功能的又一重要网络。i l 一1 在细胞因子网络的中心 位置，它可调控许多细胞因子的作用，由于i l 一1 对其他因子的调控可被i l l r a 阻断，所以i l 一1 r a 实际上在细胞因子网络中对i l 一1 的作用起着负调控，共同维持 着细胞因子网络的正常稳定。i l l r a 本身也影响c s f 、i l - 6 、i l 8 的产生，而t g f b 、i l 一4 、g m c s f 等则能调控i l l r a 的产生 6 1 。 1 3i l l r a 的临床应用前景 动物模型实验研究表明，用i l 一1 r a 治疗某些与细胞因子失调有关的炎症性疾 病，町有效地阻断i l 一1 的活性，使机体过高的t n f 、i l 一6 水平趋于正常，而不干 扰内环境平衡。目前，重组人i l i r a 已在临床上试用于治疗败血症、类风湿性关 节炎、炎症性肠道疾病、哮喘、髓源性白血病，以及移植物抗宿主反应等疾病， 并获得了一定的效果。 1 3 ，1 对败血症的作用 败血症及其后遗症会引起很高的死亡率，虽然对其病理过程已有一定的了解， 并已有多种抗菌药物和治疗手段可以应用，但仍不能有效地降低其死亡率。已证 明一些细胞因子在败血症病理过程中起着重要的作用。败血症死亡率的回顾性研 究表明，血液细胞因子( i l 一1 ，i l 一6 和t n f ) 水平可作为败血症时病人死亡率预 测的指标之一。i l i r a 在几种用细菌或细菌产物引起的动物败血症模型的治疗研 究中，都能有效地提高实验动物的存活率。和动物实验相似，在i l l r a 治疗败血 症的i 川期临床实验中，也取得了明显的效果。而且随着疾病严重程度的增加， 其降低死亡率的作用也更明显m 。对参与i i i 期临床实验的病人进行回顾性研究发 现，败血症病人如伴有器官损伤和器官功能衰竭( a r d s ，d i c 和肾功能障碍的 2 第一章绪论 病人等) ，以及败血性休克病人，是适合应用i l i r a 治疗的重要指征。已有人报 告1 l l r a 治疗败血症休克患者死亡率由4 5 降至1 6 t 8 1 。 1 3 2 对关节炎的作用 目前普遍认为与类风湿关节炎( r h e u m a t o i da r t h r i t i s ，r a ) 相关的细胞因子中， 最重要的是t n fn 和i l 一1 。部分学者认为同时抑制多个比抑制单个促炎因子效果 可能更好。临床观察发现用t n f 可溶性受体( e t a n e r c e p t ) 和重组人i l l r a ( a n a k i n r a ) 同时阻断t n fa 和i l 一1 的作用，可明显增加严重感染和白细胞减少 的发生率。大量临床试验证实，治疗r a 时阻断单个细胞因子是有效的，尤其是 强促炎因子如t n f 和i l 一1 。v a n d e n b e r g 等【9 1 进行大量研究发现，t n fo 主要是 诱发系统性症状和关节炎的早期关节肿胀，而i l 1 对关节破坏起关键性作用，对 r a 滑膜标本免疫组织化学检测发现t n fn 染色阳性率为5 0 ，而i l 一1 却是1 0 0 ， i l 1 基因缺失的c i a 小鼠不发生慢性侵蚀性关节炎，认为t n fa 的作用可能需要 部分依赖于i l 1 。r a 以慢性滑膜炎及关节进行性破坏为主要表现，因此，阻断 1 l 1 比阻断t n fd 对r a 远期疗效可能更有意义。研究发现r a 病人血清及滑液 中i l i i l 一1 r a 比例存在严重不平衡。d e l e u r a n 等d o 发现r a 中i l l 表达是i l i r a 的9 倍。i l 1 明显增加和i l l r a 相对不足可能在r a 疾病过程中有重要意义。 众多实验表明，i l i r a 可阻断i l 一1 在关节受损模型中的作用。在i 期临床中， 1 5 个r a 病人每天接受i l 1 r a 皮下注射，连续治疗2 8 天。7 天后关节炎症状明显 减轻，炎性血清学指征也好转( 血沉和c r p 都有降低) ，除仅有局部皮肤反应外， 未见明显的副作用。1 i 期临床在1 7 5 个r a 病人中进行，根据给药的剂量和频率 进行分组。三周后观察，4 个关节炎症的医学指征( 包括疼痛、红肿) 都有明显 改善。在随后一个月每周一次i l 1 r a 注射治疗中，病情仍保持改善势头。和i 期 临床类似，大部分病人在注射位点都有轻微的皮肤反应。另外有3 个病人有软组 织的感染，是由i l l r a 的作用所致还是偶发事件，应引起注意n ”。 1 3 3 对移植物抗宿主反应的作用 在移植物抗宿主反应建立、机体对外源蛋白识别过程中，i l 一1 起着关键作用。 移植物部位和系统性i l 1 水平的提高会引起中性粒细胞过量浸润和介导炎症及 组织损伤基因的表达。用i l 1 r a 治疗小鼠胰岛同种异体和异种移植实验发现，针 对急性排斥，i l i r a 能保护同种移植，而对异种移植无作用。兔眼内晶状体移植 后，用i l 一1r a 拮抗i l 一1 ，对手术后i l 一1 升高引起的炎症反应有抑制作用。在骨髓 移植模型中，i l l r a 可抑制炎症反应，延长其在非匹配受体中的存活时间。在鼠 心同种异体移植实验中，低剂量i l l r a 即可延长异体移植心脏存活时间，并能和 环孢菌素( c s a ) 起协同作用m - 。i l l r a 可抑制器官移植后的排斥反应。结膜下注 射i l 1 r a 可抑制角膜移植术后免疫排斥反应，减少新生血管的生成，减轻免疫性 炎性反应，延长角膜植片的存活时间。i l 1 r a 的剂量越大，效果越好n ”。 3 华南理工人学硕士学位论文 1 3 4 对炎症性肠道疾病的作用 朱峰等m ，通过实验验证了i l i r a 对炎症性肠道疾病的治疗作用。实验以3 个 不同时间段静脉注入i l l r a 治疗由三硝基苯磺酸( t n b s ) ，乙醇诱导的细胞免疫 法制成的实验性结肠炎，并从组织学、酶学和分子生物学角度较全面地评价了 i l 1 r a 的作用机制和作用效果。实验结果表明：i l 1 r a 治疗后，结肠炎症在组织 学上有明显改观，酶学检查亦显示炎症好转，疗效同临床己公认的糖皮质激素相 当，这说明i l l r a 确实与糖皮质激素一样具有抑制炎症作用。比较治疗前后两种 白细胞介素m r n a 表达的情况发现，治疗后两种白细胞介素m r n a 的表达均受 到抑制，说明i l l r a 的抑制炎症作用机理可能是通过抑制i l 一1m r n a 的表达。由 于预防性给予i l l r a ，也抑制了白细胞介素m r n a 的表达，产生了良好的治疗效 果。因此该实验也进一步证实了由于致炎因子造成i l i i l l r a 比例失衡，而使i l 一1 的量增加导致炎症这一学说 1 4 1 。而预防性给予i l i r a 可纠正致炎因子造成的 i l 一1 i l 一1r a 比例失衡，从而避免炎症的发生和发展。反之，预防性给予糖皮质激 素却无此作用。所以，i l l r a 在肠道炎症的治疗中可能成为作用较激素为优，却 无激素副作用的新型药物。 1 3 5 对肾脏病的作用 1 3 5 1 在系膜增殖性肾炎中的作用 近年来的研究表明，i l 1 是系膜细胞的自分泌因子，除刺激系膜增殖外，尚 有多种影响，如刺激肾小球系膜细胞产生i l 一6 、i l 一8 、单核细胞趋化因子1 ( m c p 1 ) 、血小板源性生长因子( p d g f ) ，增加粘附分子( i c a m 一1 、v c a m 一1 ) 的表达，促使主要组织相容复合物( m h c ) 类抗原表达i f ny 。此外，还促使 系膜基质的产生、中性蛋白酶的产生、花生四烯酸的合成、氧自由基的产生和一 氧化氮的合成 t5 1 。因此，i l lb 在肾小球肾炎的发病及进展中起重要作用。阻断 i l 一1 对系膜细胞的作用，在一定程度上将阻止肾小球系膜病变的发生和发展。1 9 9 3 年，z o j a l - , l 报道在体外培养的人系膜细胞中加入i l i r a ，可阻断由i l lb 引起i l 一1 、 i l 一6 、i l 8 的m r n a 表达及m c p 一1 、g m c s f 、i l 一6 的产生，且呈剂量依赖关系。 1 3 5 2 在新月体肾炎中的作用 1 9 8 8 年已提出i l 一1 与人类新月体肾炎的进展有关系i l ”。1 9 9 3 年l a n 等“7 1 报告，给予i l i r a 以阻断i l 一1 在新月体肾炎发病中的作用，并用i l l r a 治疗抗肾 小球肾炎基膜( g b m ) 肾炎。在建立抗g b m 肾炎模型5 天后，治疗组皮下注射 i l ir a ( 使血浆浓度达1 0 0 2 0 0r t g l ) 1 4 天，对照组给予等渗盐水。结果显示， 对照组很快出现蛋白尿、血尿素氮增加，血肌酐增加，肌酐清除率下降，发展为 肾功能不全：治疗组蛋白尿明显减轻( p 0 0 5 ) ，肾功能正常。组织病理观察表明， i l l r a 治疗肾小球病变减轻，硬化明显减轻，新月体形成数目很少，几乎无肾小 管萎缩及问质纤维化，i l l r a 抑制肾小球巨噬细胞浸润达5 7 ，肾小球、肾问质 4 第一章绪论 炎症细胞浸润减少。1 9 9 4 年，l a n , s ，又再报道i l ir a 在新月体肾炎中的作用。 t a n g 1 9 1 报道了i l i r a 在抗肾小球基膜抗体介导的肾小球肾炎中的作用，给 l e w i s 鼠注入抗g b m 抗体或正常兔血清，在2 4 小时给6 m gi l i r a ，使i l l r a 浓 度为2 6 5 9 5 l “g l ；当给予i l l r a 4 小时后p m n 和单核细胞或巨噬细胞浸润分 别下降3 9 2 9 。在肾小球中与淋巴细胞功能相关的分子1 ( c d l8 ) 下降3 9 ， 这与细胞间粘附分子l ( i c a m 一1 ) 表达下降有关。但i l 1 r a 治疗不影响i l 一1b 、 t n f nm r n a 的表达。提示i l i r a 在治疗抗g b m 抗体介导的肾小球肾炎中有。一 定疗效。表明i l 1 r a 在人的急进性肾小球肾炎中是一个很有潜力的制剂。 为判断i l 1r a 治疗严重新月体肾炎的作用，a t k i n s 等在大鼠中已正式i l i r a 能防止和治疗新月体肾炎，除明显改善肾脏组织学改变外，在病肺也减少了白细 胞浸润、纤维蛋白原的沉积、局部破坏和肉芽肿形成。1 9 9 5 年，a t k i n s 在组织国 际性多中心、前瞻双育研究中，应用i l 1 r a 作为治疗性急进性肾炎标准常规中的 辅助治疗1 15 1 。 1 3 5 3 在狼疮性肾炎中的作用 s i n g h 观察在狼疮动物模型m r l l l p r 中i l l r a 的剂量对体内、外i g g 产生的 影响，在培养的m r l l p r b 细胞中加入i l l r a5 0 m g l ，i g g 的产生增加两倍。相 反，在c 3 h h e jb 细胞培养中加入i l 一1 r a ，i g g 产生无变化。说明在m r l l p rb 细胞中，i l l r a 诱导i g g 的产生是通过i l 一1 生物活性的增加，而不是i l i r a 内在 激活剂活性的增加。体内试验表明，小剂量i l l r ao 0 6 g ( k g d ) 或o 9 盐水给 m r l 1 p r 小鼠注射，i l l r a 治疗组能够增加i g g 的产生，而0 9 盐水组无变化。 说明高、低浓度的i l l r a 在m r l l p r b 细胞中有不同的反应。提示在m r l l p r b 细胞中增加i g g 的产生，对于维持i l 一1 i l 一1 r a 的平衡是一重要因子m ”。 t a m m ，报道，在免疫复合物肾小球肾炎和狼疮性肾炎的小鼠动物模型中，有 i l 一1bm r n a 水平的增高注射一定剂量的i l i r a 使肾小球肾炎的炎症减轻，表 明i l i r a 对疾病的进展起着反馈作用。 1 3 6 对髓源性白血病的作用 i l 一1 是急性和慢性自血病细胞的生长因子。在体外白血病细胞培养中，i l i r a 可抑制细胞增殖和集落形成，对青少年型慢性白血病也是如此。在慢性髓源性白 血病( c m l ) 病人慢性期，i l i r a 水平和正常人水平一致，而在c m l 病人的急 性发作期，i l l r a 水平明显下降，以上充分说明i l i i l i r a 在白血病发病中的作 用，尽管目前还未见临床应用i l i r a 治疗白血病的报道，但可预期i l i r a 可使某 些白血病人的病情缓解，为进一步治疗创造条件m i 。 1 3 7 对脑损伤的作用 动物实验表明，脑损伤后，无论是机械损伤，还是缺血性损伤，内源性i l 一1 都有增加。在脑缺血后再灌注时，加入i l 一1b ，可使脑损伤加剧；与此相反，如 5 华南理t 大学硕t ：学位论文 再灌注时加入抗i l 一10 的中和性抗体则可使损伤减轻。大鼠头部水冲击损伤后， 如在1 5 分钟到4 8 小时内，在脑损伤部位附近脑室内注射重组i l lr a ，或全身性 注射高剂量i l lr a 均可抑制鼠脑内局部损伤 1 q 。 1 3 8 抗肝纤维化的作用 肝纤维化的本质是细胞外基质成分( e c m ) 在肝内异常沉积，参与肝纤维化 的e c m 成分包括胶原蛋白、蛋白多糖及粘连糖蛋白三大类m ，胶原蛋白以胶原 纤维的形式发挥作用，蛋白多糖则形成无定型基质填充、包绕于胶原纤维之间， 各种粘连糖蛋白则在纤维和细胞之间介导它们的相互连接m 一。 用w i s t a r 大鼠为实验观察对象，采用四氯化碳皮下注射，按每1 0 0 克体重 0 3 m l ( 首剂为0 5 r o l l l 0 0g 体重) 皮下注射，每周2 次，共1 6 次，诱导肝纤维化 模型。i l 一1 r a 处理组于实验第1 天开始注射四氯化碳时按每1 0 0g 体重0 5 m g 肌 肉注射i l 1 r a ，每同1 次。于实验1 7 、2 9 、4 3 、5 7 日每组分别处死动物6 1 0 只， 取血检测血清生化指标，取肝作组织学和i 、胶原和l n ( 层连粘蛋白) 半定 量分析。结果：i l l r a 处理组各期大鼠血清a l t 、a s t 及p c i i i ( 血清i 型前胶原) 、 ci v ( i v 型胶原) 、l n 及h a ( 透明质酸) 含量明显下降，实验8 周时肝纤维化 程度明显减轻。i t o 细胞增生受到抑制，肝组织内i 、型胶原和l n 沉积明显减 少。所以，i l l r a 具有抗实验性肝纤维化作用m ，。 1 _ 3 9 对激光角膜灼伤的作用 角膜灼伤是4 种常见的角膜外伤病，各种因素造成的角膜损伤不但导致角膜 本身的器质性损害，因而影响视力，还可产生各种并发症，严重者导致失明。激 光作为一种物理因素，也可造成角膜灼伤。用不同浓度的i l l r a 溶液对c 0 2 激光 造成的日本大耳白兔角膜灼伤斑进行滴眼治疗，并用地塞米松( d e x a m e t h a s o n e 。 d m ) 作为治疗对照药物进行比较，应用图像分析技术，观察角膜灼伤斑面积和 角膜透明度的变化，表明i l l r a 有利于激光角膜灼伤斑面积的缩小和角膜透明度 的恢复。目前尚未见将这一技术方法应用于角膜灼伤治疗药效学研究的文献报道。 此外，低浓度和中浓度的i l l r a 疗效较好，因此，尚需进一步明确i l - l r a 的用药 浓度范围。选用地塞米松作为治疗对照药物是取其抗炎作用与i l l r a 相比较。 i l l r a 有治疗作用，副作用小安全性高，这些特点使它有望成为治疗角膜灼伤的 新型药物【2 6 1 。 1 3 1 0 对冠心病的作用 白细胞介素一1 受体拮抗剂基因( i l 一1 r n ) 内含予2 可变数串联重复多态性 ( v n t r ) 和外显子2 ( + 8 0 0 6 t ，c ) 多态性与冠心病( c h d ) 的相关关系，以及 各基因型对c h d 患者血清i l l r a 水平的影响。采用聚合酶链反应( p c r ) 和p c r r f l p 的方法，分析2 4 5 例c h d 患者和2 3 6 例健康对照者的i l 一1 r n ( v n t r ) 和 i l 一1 r n ( + 8 0 0 6 t ，c ) 基因型，并从c h d 患者中随机选择5 5 例( 携带i l 一1 r n i i 6 第一章绪论 或i l 一1 r nc 者2 5 例，不携带者3 0 例) ，利用酶联免疫吸附实验检测其血清i l 一1 r a 水平。与健康对照组相比，不携带i l 一1 r n1 i 或i l 一1 r nc 基因型者患c h d 的相 对风险度增加1 9 1 倍( o r = 1 9 1 ，9 5 c i = 1 1 2 3 2 4 ) ；而与心绞痛组相比，其 患心肌梗死的相对风险度增加4 1 5 倍( o r = 4 1 5 ，9 5 c i = 1 5 0 1 1 4 5 ) 。携带 i l i r n i i 或i l 一1 r nc 基因型的c h d 患者血清i l l r a 水平显著高于不携带者 ( p o0 1 ) 。i l l r ni i 总是伴随着i l 一1 r nc 的出现而出现。结论i l 一1 r n ( v n t r ) 和i l 一1 r n ( + 8 0 0 6 t c ) 多态间存在完全连锁不平衡，其基因型与c h d 的发生、发展及该疾病的严重程度密切相关，i l 1 r nc 和i l 一1 r n i i 可能共同通 过促进i l i r a 的表达而具有保护作用1 2 7 1 。 1 3 1 1 对哮喘病的作用 哮喘是以气道变应性炎症、支气管高反应性为特征的呼吸困难性疾病 1 l ，其 发病机理与变态反应有关，当过敏原作用于机体后，体内产生特异性l g e ，i g e 结 合于肥大细胞、嗜碱性粒细胞等炎症细胞表面，当抗原再次进入体内，可与结合 的i g e 交联，使炎症细胞合成并释放多种炎症介质，如组胺、白三烯、各种细胞 趋化因子等，引发炎症反应。i l 一1 主要由单核细胞为主，多种细胞都可分泌的促 炎症细胞因子。i l l r a 作为唯一的i l 1 天然受体拮抗剂，在调节免疫、抑制炎症 方面发挥了重要作用。 通过建立致敏豚鼠模型，连续吸入不同浓度i l i r a ，用卵白蛋白引喘豚鼠， 连续8 天，分离血液、肺泡灌洗液( b a l f ) 中嗜酸性粒细胞，计数嗜酸性粒细 胞，用放射免疫法测定上清液中阳离子蛋白( e c p ) ，酶连免疫法测血清中i l 一5 ， 荧光显微镜观察嗜酸性细胞凋亡。结果，i l 一1 r a 能明显减少肺部嗜酸性粒细胞浸 润，降低血清、肺泡灌洗液中e c p 水平及血清中i l 一5 的含量，促进嗜酸性细胞 凋亡。所以，雾化吸入i l i r a 可以通过改变嗜酸性粒细胞的活性及浸润程度，达 到治疗哮喘的目的m ”。 1 4i l l r a 的表达、分离纯化研究现状 1 4 1 重组大肠杆菌表达i l l r a 的分离和纯化 d i n o 等人l ：w ，把合成的人i l i r a 基因重组到大肠杆菌中进行表达，研究了大 肠杆菌在实验室规模下表达r e c l l l r a 生长条件，在此条件下大多数r e c l l i r a 以 不溶性的形式表达。然后在6 l 规模的水平上进行了条件优化，进而上升到5 0 l 规模的优化，结果发现，不需要蛋白的增溶就可以直接从大规模培养的细胞裂解 液中得到大量的可溶的、具有活性的r e c l l l r a ( o 4 3 9 l l 细菌) 。d i n o 的大规模培 养条件是：在7 0 l 的无菌反应器中，加入5 0 l t b ( t e r r i f i c b r o t h ，2 4 9 l 酵母膏， 1 2 9 l 细菌用胰蛋白胨，4 9 l 甘油，1 7 0 m m k h 2 p 0 4 ，7 0 m m k z h p 0 4 ) 培养基， 以1 ( v v ) 的接种量接入经过夜活化的重组的大肠杆菌，3 7 培养1 9 小时，通 过测定o d 6 1 0 检测大肠杆菌的生长。当大肠杆菌达到生长的要求时，通过超高速 7 华南理工大学硕士学位论文 冷冻离心机收集大肠杆菌，上样流速为1 2 l h ，收集的细胞浆贮存于8 0 。c 的冰 箱中。另外，一种高效的用于可溶性蛋白的纯化方法也被研究出来。第一步，制 各细胞裂解液：取冷冻的细胞浆，解冻后，大肠杆菌细胞用冰冻的水洗涤两次并 莺新悬浮于冰冻的b u f f e r a ( 2 0 r a m2 n 一吗啉基一乙烷基一磺酸( m e s ) ，p h 6 0 ，1 m m e d t a ) 。细胞通过连续的d y n o m i l l 进行破碎，流速为5 l h ，并通过显微镜检测 细菌破碎的情况。最后加入b u f f e r a 使细胞裂解液的电导率降至 1 0 m s c m 、p h 调到6 0 。第二步，沸腾床层析：直径5 0 m m 流线型层析柱( p h a r m a c i a 公司) 装 入0 6 ls p s t r e a m l i n e ，用2 5 倍树脂体积的b u f f e r a 洗涤层析柱。未经离心的细 胞裂解液直接加到树脂上，先用b u f f e r a 洗涤层析柱，再用去离子水洗涤层析柱， 然后用b u f f e rb ( 2 5 m mt r i s h c l ，p h 8 0 ，l m me d t a ) ，最后树脂用含有0 5 m n a o h 的2 mn a c l 进行再生。第三步，阴离子交换层析：直径5 0 m m 的层析柱装 填2 0 0 m lq s e p h r o s ef f ( p h a r m a c i a 公司) ，用b u f f e rb 平衡后，直接加入经 s p s t r e a m 1 i n e 洗脱的样品，然后分别用5 0 r a mn a c l 和1 0 0 m m 的n a c l 洗脱， 最后的样品贮存于一8 0 。c 的冰箱中。第四步，内毒素的去除：纯化后的i l i r a 经 过一个多粘菌素b 柱( d e t o x y g e l ，p i e r c e 公司) ，町以使内毒素的量从6p g 1 降 至2u g ，1 。经过全面的优化后，用s d s p a g e 分析样品的纯度，样品的纯度大于 9 5 ，最后i l i r a 的回收率为5 6 ，每升培养物可以得到0 2 4 9 纯的i l l r a ，不 需要经过复性和变性过程。最后经过纯化的样品用m a l d i t o p 和e s i m s 分析 和鉴定，纯化后样品的纯度非常高，而且测得的分子量的