（动物学专业论文）抗人胃癌细胞ags单克隆抗体的制备和初步鉴定.pdf

黄翔华杭人胃癌细胞a g s 单克隆抗体的制备和初步签定 抗人胃癌细胞a g s 单克隆抗体的制备和初步鉴定 摘要 本研究用人胃癌细胞a g s 免疫b a l b c 小鼠，采用杂交瘤技术制备了抗人胃 癌细胞的单克隆抗体( m c a b ) ，初步鉴定了杂交瘤和m c a b 的生物学特性，包括： 杂交瘤的染色体、m c a b 的效价和亚类以及m c a b 的特异性。 一人胃癌细胞a g s ( 抗原) 的培养 常规方法体外培养人胃癌细胞a g s 。通过绘制生长曲线，研究了a g s 细胞 的增殖规律，结果表明：a g s 细胞生长增殖的潜伏期为1 2d ，对数生长期为2 5 d ，停滞期为5 - 8d 。以d m s o 为冷冻保护剂，对a g s 细胞进行冷冻复苏。以该 方法冻存的细胞解冻后的贴壁率为9 6 3 1 。这说明该方法对a g s 细胞进行冷 冻是切实可行的。 二抗人胃癌细胞a g s 单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备、筛选和克隆 1 制备 用a g s 细胞免疫5 只雌性b a l b c 小鼠，间隔3 周免疫1 次。双方阵法确定 了间接e l i s a 法的最佳抗原包被浓度为2 x1 0 5 皿，阳性血清最适工作稀释度为 1 ：1 0 4 。间接e l i s a 法检测抗体效价达到1 ：1 0 4 的3d 后，通过p e g 4 0 0 0 使免疫b 淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞s p 2 0 融合。融合3d 后出现杂交瘤细胞，7 1 0d 后 观察到杂交瘤细胞克隆生长。经h a t 培养基选择培养后，细胞的融合率为 5 1 0 4 。 内蒙古大学硕士学位论文 2 筛选 间接e l i s a 法的结果显示：只有1 8 4 孔的上清液重复3 次检测的p n 均大 于2 1 ，呈阳性。 3 克隆 用显微操作法挑出杂交瘤1 8 4 的单个细胞并接种于9 6 孔细胞培养板，将杂 交瘤培养上清液按1 ：1 0 4 稀释，间接e l i s a 法第一次检测后，有9 个孔呈阳性。 第二次检测后，仅有1 8 4 孔杂交瘤( 命名为1 8 4 ) 分泌的抗体仍呈强阳性。 三抗人胃癌细胞a g s 单克隆抗体杂交瘤细胞株和m c a b 的初步鉴定 1 杂交瘤细胞染色体 杂交瘤细胞染色体的平均数为9 2 条，符合融合细胞染色体的特点。 2 m c a b 的效价 间接e l i s a 法检测到杂交瘤1 8 4 上清液中m c a b 的效价可达l ：1 0 4 。 3 m c a b 的亚类 i g 类及亚类的鉴定结果说明该m c a b 属于i g g l 亚类。 4 m c a b 的特异性 免疫化学法和间接e l i s a 法的结果均提示：m c a b1 8 4 与宫颈癌细胞株h e l a 、 肝癌细胞株h e p g 和正常人胎肺细胞均呈阴性反应，即不存在明显的交叉反应； 但它与胃癌细胞株a g s 呈明显阳性反应，说明该m c a b 可能对人胃癌有一定的 特异性。 关键词：胃癌，单克隆抗体，制备，鉴定 黄翔华抗人胃癌细胞a g s 单克隆抗体的制备和初步签定 p r e p ara t i o na n di d e n t i f i c a t i o n no fm o n o c l o n a l a n t i b o d ya g a i n s th u m a ng a s t r i cc a n c e r a b s t r a c t b a l cm i c ew e r ei m m u n i z e dw i t hh u m a ng a s t r i cc a n c e rc e l ll i n ea g s t h e r e s e a r c hp r e p a r e dt h em o n o c l o n a la n t i b o d y ( m c a b ) a g a i n s th u m a ng a s t r i cc a n c e r c a r c i n o m aw i t ht h el y m p h o c y t e sh y b r i d o m at e c h n i q u ea n di d e n t i f i e dt h ee l e m e n t a r y p r o p e r t i e si n c l u d i n g ：h y b r i d o m ac h r o m o s o m e s ，t i t e r so f t h em c a b ，s u b c l a s so ft h e m c a ba n ds p e c i f i cr e a c t i o n 1 c u l t u r e o fh u m a n g a s t r i cc a n c e rc e l ll i n ea g s a g sc e l l sw e r ec u l t u r e di nv i t r ow i t ht h eg e n e r a lm e t h o d s p r o l i f e r a t i o n p r o m o t i n g r u l eo fa g sc e l l sw a ss t u d i e db yp r o t r a c t i n gt h eg r o w t kc u r v e a g sc e l l sw e r e c r y o p r e s e r v e dw i t hd m s o a sc r y o p r o t e c t a n t si nm a n u a lw a y a f t e rf r e e z e t h a wc e l l v i a b i l i t yw a s9 6 31 i na g s c e l l s t h er e s u l t si n d i c a t e st h a tt h ec r y o p r e s e r v a t i o n w i t hd m s oa sc r y o p r o t e c t a n t si nm a n u a lw a yi sa ne f f e c t i v ew a yf o rc r y o p r e s e r v i n g a g sc e l l s 2 h y b r i d o m ap r e p a r a t i o n ，s e l e c t i o na n dc l o n e ( 1 ) p r e p a r a t i o n ：5f e m a l eb a l b cm i c ew e r ei m m u n i z e do n c ee v e r yt h r e ew e e k sw i t h 内蒙古大学硕士学位论文 h u m a n g a s t r i cc a n c e rc e l ll i n ea g s c o n c e n t r a t i o no p t i m i z a t i o no f c o a t e da n t i g e n a n da n t i b o d i e si ni n d i r e c te l i s aw e r e2 x10 5 m la n d1 ：10 4 ，r e s p e c t i v e l y s p 2 0 c e l l sa n ds p l e e nc e l l sf u s e dw i t ht h eh e l po fp e g 4 0 0 0a f t e r3 dw h e nt h et i t e r so f a n t i b o d i e sw a s1 ：10 4 h y b r i d o m ac l o n e sc u l t u r e di nh a tw e r eo b s e r v e do n ew e e k l a t e r f u s i o nr a t ew a s51 0 4 ( 2 ) s e l e c t i o n ：h y b r i d o m aw e r es e l e c t e db yi n d i r e c te l i s a t h er e s u l ts u g g e s t st h a t p no ft h es u p e r n a t a n to f1b 4w e r em o r et h a n2 1i nt h r e ei n d i r e c te l i s a ，t h a ti s t os a y , h y b r i d o m a1b 4s e c r e t e sa n t i b o d i e s ( 3 ) c l o n e ：e v e r yc e l lw a sp i c k e do u to fh y b r i d o m a1b 4w i t hm i c r o m a n i p u l a t i o na n d c u l t u r e di n9 6c u l t u r ep l a t e a n t i b o d i e so n l yw e r ef o u n di nh y b r i d o m a1b 4 t h e a n t i b o d i e sw e r ec a l l e dm c a b1b 4 3 i d e n t i f i c a t i o no ft h ee l e m e n t a r yp r o p e r t i e so fh y b r i d o m ac e l l1b 4a n dm c a b 1b 4 ( 1 ) t h ea v e r a g eo ft h eh y b r i d o m ac e l l1b 4i s9 2w h i c ha c c o r d sw i t ht h ec h a r a c t e r i s t i c o ff u s i o nc e l l ( 2 ) t h et i t e r so fa n t i b o d i e si ns u p e r n a t a n to fh y b r i d o m ac e l l1b 4 ( m c a b1b 4 ) i s1 ：10 4 ( 3 ) i tw a sr e v e a l e dt h a tm c a b1b 4b e l o n g e dt oi g g ls u b c l a s s ( 4 ) t h er e s u l t so fi m m u n o c y t o c h e m i c a lm e t h o da n di n d i r e c te l i s a a l ls u g g e s t e dt h a t m c a b1b 4w a sn e g a t i v et oh e l ac e l ll i n e ，h e p gc e l ll i n ea n dl u n gc e l l sf r o m h u m a ne m b r y o ，b u tp o s i t i v et oa g sc e l ll i n e i ts h o w st h a tm c a b1b 4m a yb e s p e c i f i ct oh u m a ng a s t r i cc a n c e r k e y w o r d s g a s t r i cc a n c e r , m o n o c l o n a la n t i b o d y , p r e p a r a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o n i v 内蒙古文学硕士学位论文 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。除本文已经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得内蒙古大学及其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中做了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：缉 e l 期：迎2 ：五： 2 1 ( 抗体检测呈阳性) 的杂交瘤确定为分泌单克隆抗体的杂交瘤，挑选杂交瘤细胞进行 克隆并扩大培养。阴性孔3d 后检测一次，若仍为阴性孔则弃之。 2 3 杂交瘤细胞的克隆化 2 3 1 饲养细胞的制备 克隆前1 2d ，先用未免疫的8 周龄的健康b a l b c 小鼠摘除眼球采血后处死，分离血清作 为抗体检测时的阴性对照血清。依照2 1 2 的方法，制备饲养细胞。 2 3 2 杂交瘤细胞的克隆化 对阳性孔的细胞用显微操作法进行克隆。在直径6c n l 培养皿中，加入5m 1 1 1 0 5 m 1 细 胞悬液放置于5 c 0 2 饱和湿度，3 7 温箱中3 0m i n 以上，在倒置显微镜下，寻找那些与周 围细胞相距甚远的单个细胞，用口吸管将这些单个细胞移到预先加有2 1 0 4 个饲养细胞的9 6 孔板内培养，即可获得单个细胞形成的克隆。一周后用间接e l i s a 法检测抗体，标出阳性孔， 对所有的克隆细胞孔换液。换液3d 后，再用间接e l i s a 法检测，将两次o d 值进行对照。 对两次检测都是阳性的孔的细胞扩大培养，按照前述冻存a g s 细胞的方法在液氮中冻存杂交 瘤。 1 4 黄翔华杭人胃癌细胞a g s 单克隆抗体的制备和初步鉴定 3 结果 3 1 杂交瘤细胞的制备 3 1 1 间接el | s a 法和效价检测 3 1 1 1 间接el | s a 法的建立 采用双方阵法确定包被抗原、抗体的最佳工作浓度，由表2 1 的结果可以看出：当抗原浓 度为2 x1 0 5 m l 时，阳性血清l ：1 0 4 稀释测得的o d 值为1 3 7 1 ，阴性血清的o d 值为0 0 1 7 ， p n 值为8 0 6 4 7 ( 8 0 6 4 7 2 1 ) ；而抗原浓度为4 x 1 0 5 m l 时，阳性血清l ：1 0 4 稀释得到的p n 值为7 0 1 3 3 ( 7 0 1 3 3 2 1 ) ，8 0 6 4 7 7 0 1 3 3 。由此确定间接e l i s a 法中的最佳抗原包被浓度 为2 1 0 5 m l ，阳性血清最适工作稀释度为1 ：1 0 4 。 3 1 1 2 间接e l is a 法检测抗体的效价 将抗原a g s 细胞按2 x1 0 5 m l 包被9 6 孔板，用间接e l i s a 法测定免疫小鼠抗血清的效 价。由表2 2 可知：当抗原浓度为2 x1 0 5 m l 时，稀释度为1 ：1 0 、1 ：1 0 2 、l ：1 0 3 、l ：1 0 4 的孔p n 值均大于2 1 ，只有稀释度为1 ：1 0 5 的孔的o d 值小于2 1 。因此除稀释度为1 ：1 0 5 的孔外，其 余稀释度的孔均为阳性反应，而出现阳性反应的最大稀释度为l ：1 0 4 ，所以抗血清的效价为 l ：1 0 4 ，效价检测结果显示：免疫的小鼠可以用于细胞融合。 3 1 2 骨髓瘤细胞s p 2 0 的培养和饲养细胞的制备 在融合前2d ，用滴管将培养瓶内的s p 2 0 细胞吹起并离心收集，l ：3 进行传代( 图版2 1 ) 。 融合前1 2d 制备小鼠腹腔巨噬细胞( 饲养细胞) 并接到9 6 孔细胞培养板( 图版2 2 ) 。 3 1 3 细胞融合 实验只进行了一次融合，将融合的细胞接种到2 块细胞培养板。融合3d 后出现杂交瘤 细胞( 图版2 3 ) ，7 1 0d 后观察到杂交瘤细胞克隆( 图版2 4 ) 。2 块9 6 孔培养板中的9 8 个孔 出现杂交瘤细胞克隆，融合率为5 1 0 4 ( 9 8 1 9 2 ) 。 3 2 杂交瘤细胞的筛选 将a g s 细胞以2 x1 0 5 m l 接种于9 6 孔板，用间接e l i s a 法检测这些杂交瘤上清液中抗体 的结果显示：只有1 8 4 孔的上清液重复3 次检测的结果p n 均大于2 1 ，表明反应呈强阳性 ( 表2 3 ) 。在体外连续传代该孔杂交瘤细胞( 命名为1 8 4 ) ，液氮冻存。 内蒙古大学硕士学位论文 3 3 杂交瘤细胞的克隆化 用显微操作法挑出的杂交瘤1 8 4 接种于2 块9 6 孔细胞培养板，其中有8 2 个孔中有杂交 瘤细胞从单细胞( 图版2 5 ) 分裂形成单个克隆( 图版2 6 ) ，直至长满孔底的1 3 1 2 。将杂 交瘤培养上清液按1 ：1 0 4 稀释后，用间接e l i s a 法筛选一次。结果显示：9 个孔呈阳性( 表 2 4 ) 。对所有细胞孔换液3d 后，再用间接e l i s a 法检测，从表2 5 可知：仅有1 8 4 孔杂交 瘤( 命名为1 8 4 ) 分泌的抗体仍呈阳性，随后将1 8 4 孔在体外连续传代培养，液氮冻存。 表2 1抗原和血清包被最佳浓度( o d ) t a b l e2 1c o n c e n t r a t i o no p t i m i z a t i o no fc o a t e da n t i g e na n da n t i b o d i e s ( o d ) 注：上述结果为两次检测结果的平均值，每次检测均设3 个重复孔 1 6 黄翔华杭人胃癌细胞a g s 单克隆抗体曲制备和初步签定 表2 2 抗体效价( o d ) t a b l e2 2 li t e r so fa n t i b o d i e s ( o d ) 注：上述结果为两次检测结果的平均值，每次检测均设3 个重复孔 表2 3 杂交瘤1 8 4 的o d t a b l e2 3o do ft h eh y b r i d o m ac e l l s1b 4 检测次数 数值一抗稀释度 2 3 阳性o d 阴性o d p n 阳性o d 阴性o d p 瓜 阳性o d 阴性o d p n 1 ：1 0 3 0 5 9 6 3 2 5 7 0 5 3 1 3 0 5 2 0 4 9 3 2 5 8 1 1 ：1 0 4 0 5 7 7 o 1 8 3 3 1 5 3 0 4 9 6 0 1 7 4 2 8 5 l 0 4 6 7 0 1 9 1 2 4 4 5 注：上述结果为3 个重复孔的平均值 1 7 1 ：1 0 5 0 4 7 4 2 5 9 0 0 4 6 0 2 6 4 4 0 4 3 3 2 2 6 7 内蒙古史学硕士学位论文 表2 4 克隆后的杂交瘤的o d t a b l e2 4o do ft h ec l o n e dh y b r i d o m ac e l l s 注：上述结果为两次检测结果的平均值，每次检测均设3 个重复孔 表2 5 杂交瘤1 8 4 的o d t a b l e2 5o do f t h eh y b r i d o m ac e l l sib 4 注：上述结果为两次检测结果的平均值，每次检测均设3 个重复孔 黄翔华杭人胃癌细胞a g s 单克隆抗体的制备和初步签定 4 讨论 骨髓瘤细胞可在体外大量增殖但不能分泌特异性的抗体，而致敏的b 淋巴细胞能分泌特 异性的抗体，但这些细胞在体外不能长期存活。小鼠的骨髓瘤细胞与能分泌某种抗体的致敏 b 淋巴细胞融合的杂交瘤细胞既有肿瘤细胞在体外易增殖的特性，又有致敏b 淋巴细胞能分 泌特异性抗体的能力。由于每个致敏的b 淋巴细胞只针对单一的抗原决定簇产生抗体，所以 融合的杂交瘤细胞利用代谢缺陷补救机理筛选，再通过克隆化就能够分泌研究需要的、针对 单一抗原决定簇的、完全均一的( 某一类、亚类、型别等) 、单一特异性的抗体，即单克隆抗 体。这是制备单克隆抗体的基本原理【9 j 。由于m c a b 特异性很强，性质均一，易于大量生产， 已经在生命科学研究及医学实践方面的许多领域做出了重要的贡献。 制备特异性强的m c a b 的关键是抗原的纯度，但因目前还未分离到胃癌特异性抗原，文 献也多采用胃癌细胞株或新鲜分离的胃癌组织作为抗原来免疫小鼠【1 1 】。本研究用人胃癌细胞 a g s 作为抗原来免疫小鼠，制各了杂交瘤1 8 4 。 动物免疫是制备m c a b 的关键步骤之一。选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功， 获得高质量的m c a b 至关重要。一般根据抗原性质，免疫原性和小鼠的免疫反应性决定注射 途径、免疫次数、间隔时间和持续时间。首先要选合适的免疫动物。当选用小鼠骨髓瘤细胞 s p 2 0 与免疫脾细胞融合时，一般用6 8 周龄、与小鼠骨髓瘤细胞s p 2 0 同种系的雌性b a l b c 小鼠作为免疫动物。其次，根据免疫抗原的特性的不同，选择不同的免疫方法。( 1 ) 颗粒性 抗原：颗粒性抗原免疫原性强，如肿瘤细胞、淋巴细胞、细菌等可作为抗原，不加佐剂直接 免疫就可获得很好的免疫效果。例如用细胞性抗原免疫时，可用p b s 等溶液充分洗涤培养的 细胞，以去除可能存在的异源蛋白，第一次腹腔或尾静脉注射l x l 0 6 _ 1 x 1 0 7 细胞鼠。2 3 周后 以相同的方法进行第二次免疫。第二次免疫后，可使用间接e l i s a 法检测抗血清的效价，以 确定免疫的效果，当效价达到1 ：1 0 4 时，才可在融合前3d 用同样剂量腹腔或静脉注射加强免 疫一次，准备融合，否则要再进行一次免疫，直至效价达到要求才可进行融合。( 2 ) 可溶性 抗原：因为可溶性抗原的免疫原性较弱，一般要加佐剂。常用佐剂有福氏完全佐剂和福氏不 完全佐剂。目前用于可溶性抗原的免疫方案不断有所更新，如将可溶性抗原颗粒化或固相化， 可增强抗原的免疫原性和降低使用剂量；使用细胞因子作为佐剂可以提高机体的免疫应答水 平，促进免疫细胞对抗原的免疫反应性。蛋白质、荚膜多糖、病毒、立克次体以及与蛋白质 结合的半抗原等均可采用可溶性抗原的方法免疫。取5 1 0 0 岭抗原与等量完全福氏佐剂充分 1 9 内蒙古大学硕士学位论文 乳化后腹腔或皮下多点注射。以后每间隔2 周以同样剂量抗原加等量不完全福氏佐剂腹腔或 皮下注射，共3 5 次。一般在融合前3d 腹腔或静脉注射无佐剂抗原5 1 0 0 “g 加强免疫，此 次注射要缓慢，以防止动物发生过敏性休克而死亡。( 3 ) 脾内直接免疫：小鼠麻醉后，打开 腹腔，沿脾脏长轴方向缓慢注入2 0 - 4 0l x g 可溶性抗原或2 5 x 1 0 5 - 5 x 1 0 5 细胞，免疫后3 4d 即可取脾细胞进行融合。( 4 ) 体外免疫法：体外免疫是指在一定条件下，在体外将正常动物 或人的脾细胞( 或淋巴结细胞、外周血淋巴细胞) 与抗原共同培养，然后再与骨髓瘤细胞进 行融合。具体步骤是取未经致敏小鼠脾细胞，加入含微量抗原、5 0 条件培养液及5 0p m o l l 2 巯基乙醇的营养液体外培养致敏。如系可溶性抗原取1 5 0p g n d ，细胞抗原1 0 5 】0 6 个细胞 l m l 脾细胞悬液，细胞性抗原需经6 0 c o 照射或用固定剂短暂固定 1 】。 效价检测和杂交瘤筛选的体系必须在细胞融合之前建立好。该体系应具备灵敏度高、特 异性强、简便快速的特点。间接e l i s a 试验特异性强、灵敏、快速、检测量大，能满足抗体 效价检测和筛选所要的灵敏快速和一次检测大量样本的要求【9 】。而且间接e l i s a 的各条件是 经过多次试验优化并稳定下来的筛选系统，能够保证筛选过程中不漏选错选。目前主要有两 种细胞抗原的适宜包被浓度：2 x 1 0 5 m l 和4 x 1 0 5 m l ，均为体细胞抗原的包被浓度。本试验选 用这两种浓度作为a g s 细胞包被的候选适宜浓度来探索适宜a g s 细胞的包被浓度。结果显 示a g s 细胞更适合用2 1 0 5 m l 来包被。 在融合后的杂交瘤培养及克隆化过程中，均需要加入饲养细胞。饲养细胞主要来自小鼠 腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞。添加的饲养细胞对杂交瘤有下列作用：( 1 ) 它可以产生 某些细胞因子调节杂交瘤细胞生长。( 2 ) 它能吸收某些有害的代谢产物。( 3 ) 它还可以吞噬清 除死细胞。( 4 ) 它可以抑制可能污染的微生物生长。( 5 ) 它能增加细胞密度，促进分散的单个 密度依赖的杂交瘤细胞的增殖【1 0 j 经h a t 培养基选择后的杂交瘤克隆并不能保证一个孔内只有一个克隆，在实际工作中每 孔可能会有数个甚至更多的克隆，这些克隆中可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、目 的抗体分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。对于抗体检测呈阳性的杂交瘤克隆应尽早进行克 隆化。因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌细胞的生长速度快，二者竞争的结果会导 致抗体分泌细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞 的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。目前报道的克隆方法多为有限稀释法【1 2 域 软琼脂法。软琼脂法需要制备无菌的琼脂，步骤繁琐；而有限稀释法虽操作简便但不能保证 每孔仅有一个细胞，这就增力n - j 后续筛选单个克隆的工作量。本实验采用显微操作法，直接 挑选阳性孔单个细胞进行克隆。该法可以确保每个孔有单个细胞克隆，大大减少了工作量。 2 0 黄翔华i t 声- t 癌细胞a g s 单克隆抗体的制备和初步鉴定 5 结论 5 1 杂交瘤细胞的制备 5 1 1 免疫 用a g s 细胞作为抗原，按照5 x 1 0 6 只的细胞抗原量分别免疫5 只8 周龄雌性b a l b c 小鼠， 间隔3 周免疫1 次。用间接e l i s a 法检测的抗体效价达到l ：1 0 4 的3d 后融合。 5 1 2 间接e l is a 法的建立 双方阵法确定了以人胃癌细胞a g s 作为抗原时，间接e l i s a 法的最佳抗原包被浓度为 2 x 1 0 5 m l ，阳性血清最适工作稀释度为1 ：1 0 4 。 5 1 3 融合 通过p e g 4 0 0 0 的作用使免疫b 淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞s p 2 0 融合。融合3d 后出现 杂交瘤细胞，7 1 0d 后观察到杂交瘤细胞克隆生长。经p e g 4 0 0 0 诱导融合和h a t 培养基选择 培养后，细胞的融合率为5 1 0 4 。 5 2 间接e lis a 法筛选 间接e l i s a 法的结果显示：只有1 8 4 孔的上清液重复3 次检测的结果均呈阳性( 表2 3 ) 5 3 克隆 用显微操作法挑出杂交瘤1 8 4 的单个细胞并接种于9 6 孔细胞培养板，将杂交瘤培养上 清液按1 ：1 0 4 稀释后，间接e l i s a 法第一次检测后，有9 个孔呈阳性( 表2 4 ) 。第二次检测 后，仅有1 8 4 孔杂交瘤( 命名为1 8 4 ) 分泌的抗体仍呈强阳性( 表2 5 ) 。 2 1 内蒙古大学硕士学位论文 参考文献 【1 】f a l k e n b e r g f w m o n o c l o n a la n t i b o d yp r o d u c t i o n ：p r o b l e m sa n ds o l u t i o n j r e si m m u n o l 19 9 8 ，14 9 ( 6 ) ：5 4 2 5 4 7 【2 w e i n e rl m a no v e r v i e wo fm o n o c l o n a la n t i b o d yt h e r a p yo fc a n c e r j s e m i no n c o l ，19 9 9 ，2 6 ( 4 s u p p l1 2 1 ：4 1 - 5 0 3 】3 g r e e nm c ，m u r r a y 儿，h o r t o b a g y ig n m o n o c l o n a la n t i b o d yt h e r a p yf o rs o l i dt u m o r s j c a n c e rt r e a tr e v , 2 0 0 0 ，2 6 ( 4 ) ：2 6 9 2 8 6 4 】p a r kj w , s m o l e nj m o n o c l o n a la n t i b o d yt h e r a p y j a d vp r o t e i nc h e m ，2 0 01 ，5 6 ：3 6 9 - 4 2 1 5 】a u s u b e lf ，b r e n tr ，k i n g s t o nr e ，e ta 1 c u r r e n tp r o t o c o l si nm o l e c u l a rb i o l o g y j j o h n w i l e y & s o n s ，19 9 4 ，9 ：3 3 3 7 6 巴德年主编当代免疫学技术与应用 m 】北京：北京医科大学中国协和医科大学联合 出版社，1 9 9 8 ，9 8 1 0 2 【7 鄂征组织培养和细胞学技术【m 】北京：北京出版社，1 9 9 5 ，3 7 7 0 【8 】张继主编酶联免疫技术及应用 m 】北京：化学工业出版社，2 0 0 4 ，2 0 1 21 4 【9 】王重庆分子免疫学基础 m 】北京：北京大学出版社，1 9 9 7 ，2 4 6 【1 0 】王捷主编动物细胞培养技术与应用 m 北京：化学工业出版社，2 0 0 4 ，7 0 7 2 【1 1 朱永良，钱可大，唐训球，等抗胃癌细胞单克隆抗体的制备 j 】浙江医科大学学报， 1 9 9 6 ，2 5 ( 6 ) ：2 4 9 2 5 1 1 2 】冯仁青，郭振泉，宓捷波现代抗体技术及其应用 m 】北京：北京大学出版社，2 0 0 6 ， 7 0 7 2 黄翔华杭人胃癌细胞a g s 单克隆抗体的制备和初步签定 第三章抗人胃癌细胞a g s 单克隆抗体杂交瘤细胞株 和m c a b 的初步鉴定 - 上- j 一 刖吾 单克隆抗体技术目前已经广泛地应用于免疫学、微生物学、肿瘤学、遗传学以及分子生 物学等各个研究领域，也为临床疾病的诊断、防治和检测提供了新的工具。 单克隆抗体的鉴定主要包括：( 1 ) 抗体特异性的鉴定：用抗原与其抗原成分相关的其他 抗原通过e l i s a 法、免疫荧光测定法( i m m u n o f l u o r e s c e n ca s s a y , i f a ) 或免疫组化进行交叉试 验( 2 ) 单克隆抗体类和亚类：一般用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已基本上确 定了抗体的i g 类型。如果用的是酶标或荧光素标记的山羊抗鼠i g g 或i g m ，则检测出来的抗 体类型一般是i g g 或i g m 类。单抗的亚类一般用标准亚类抗血清系统做琼脂糖双向免疫扩散 或夹心e l i s a 来确赳1 1 。 s a b c ( s t r e p ta v i d i n - - b i o t i nc o m p l e x ) 即链酶亲和素一生物素一过氧化物酶复合物，是专 为免疫组化和其他免疫检测而设计的，用以显示组织和细胞中抗原分布。链霉亲和素是一种 从链霉菌中提取的蛋白质，分子量4 7 0 0 0 。同亲和素一样，对生物素分子有极高的亲和力， 是一般抗原抗体亲和力的一百万倍。亲和素是一个碱性蛋白质，经改造后可以转变成中性蛋 白质。链霉亲和素等电点接近中性，对组织和细胞的非特异吸附很低，因此链霉亲和素的免 疫组化方法背景很低。s a b c 大约可形成一百个左右的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和 素所构成的复合物。大量的酶将保证s a b c 具有很高的敏感性。s a b c 兼具高敏感性，低背 景和操作简便的优点，适于检测抗原抗体的免疫反应，特别是对于以纯度不高的细胞等颗粒 型物质作为免疫原、需要检测结果具有高敏感性的细胞免疫化学实验来讲，s a b c 效果较理 想。第二部分虽已得到m c a b1 8 4 ，但鉴于癌细胞抗原的不确定性和复杂性，所以选用s a b c 法来提高反应的敏感性。 第二部分的研究结果已经得到了生长状态良好且能够分泌抗人胃癌细胞a g sm c a b 的杂 内蒙古土学硕士学位论文 交瘤。这一部分的研究主要针对杂交瘤的染色体特征和它分泌的m c a b 对胃癌细胞a g s 的特 异性，检测了它与其他肿瘤细胞和正常胎儿肺细胞之间是否存在交叉反应。这为进一步研究 该m c a b 的特异性程度和寻找与它作用的、胃癌细胞a g s 的抗原奠定了基础。 1材料 人胃癌细胞株a g s 、肝癌细胞株h e p g 、宫颈癌细胞株h e l a 和人胎肺细胞( 本校细胞工 程实验室传代保存) 。 2 方法 2 1 杂交瘤细胞染色体的检测 向传代2 4h 的杂交瘤细胞中加入秋水仙素( 1 0g g m 1 ) ，继续培养4 - 6h 。加细胞消化液消 化并离心收集细胞。加低渗液1 0m l 低渗处理2 0m i n ，固定液1 0r n l 固定2 5m i n ，g i e m s a 染 色3 0m i n 后，镜下检测染色体2 1 。 2 2m c a b 的初步鉴定 2 2 1 杂交瘤上清液m c a b 效价的测定 按照第二章2 2 的间接e l i s a 法测定杂交瘤上清液中所含抗体的效价。 2 2 2m c a b 亚类的鉴定 将杂交瘤的上清液与山羊抗鼠i g g 不同亚类抗血清进行琼脂糖双向免疫扩散实验。将琼 脂糖凝胶平铺在干净的载玻片上。待琼脂糖凝胶冷却后，用打孔器打圆孔，中心孔与周围孔 的圆心距离为8m m 。中心孔加入1 ：1 0 稀释的杂交瘤细胞培养上清液，周围孔分别加入抗小 鼠免疫球蛋白标准亚类血清i g g l 、i g g 2 a 、i g g 2 b 和i g g 3 。3 7 。c 水浴2h 后重复上述加样过 程，2 4h 后观察沉淀线p 】。 2 2 3m c a b 特异性的鉴定 2 2 3 1 肝癌细胞株h e p 6 、宫颈癌细胞株h e ia 和正常人胎肺细胞的培养 按照第一章2 1 的方法将肝癌细胞株h e p g 、宫颈癌细胞株h e l a 和正常人胎肺细胞解冻， 用含1 0 新生牛血清的高糖d m e m 培养液和1 5 新生牛血清的低糖d m e m 培养液分别培 黄翔华抗人胃癌细胞a g s 单克隆抗体的制备和初步苍定 养两种癌细胞和正常人胎肺细胞。选择生长状态良好的细胞进行爬片。 2 2 3 2 细胞爬片免疫化学法鉴定单抗的特异性。 ( 1 ) 将胃癌细胞株a g s 、肝癌细胞株h e p g 、宫颈癌细胞株h e l a 和正常人胎肺细胞消化并 离心收集，计数，分别将3 种细胞的浓度调整至2 x 1 0 4 m l ，向有无菌载玻片的1 2 个培 养皿( 共4 组) 中加1 0m l 细胞悬液，放入细胞培养箱中培养。 ( 2 ) 第二日用p b s 清洗载玻片3 次，干燥。 ( 3 ) 加4 多聚甲醛固定2 5m i n ，干燥。 ( 4 ) p b s 清洗载玻片3 次，干燥。 ( 5 ) 加0 5 t r i t o n x 1 0 03 7 温育1 5m i n 。 ( 6 ) p b s 清洗载玻片3 次，干燥。 ( 7 ) 加3 h 2 0 2 温育1 0m i n 。 ( 8 ) p b s 清洗载玻片3 次，干燥。 ( 9 ) 加5 b s a 于3 7 封闭2 0m i n 。到时甩去载玻片上的封闭液即可。 ( 1 0 ) 加一抗：以效价达到1 ：l x l 0 4 的杂交瘤1 8 4 上清液为一抗，同时用人胃癌细胞a g s 免 疫的小鼠阳性血清作阳性对照，用阴性血清作阴性对照，分别滴加于每种细胞的3 张 载玻片上，4 过夜。 ( 1 1 ) 第三日将4 c 的载玻片在3 7 。c 复温4 5m i n ，p b s 清洗载玻片5 次，干燥。 ( 1 2 ) a n - 抗：分别向每张载玻片滴加生物素化山羊抗小鼠二抗，在3 7 。c 温育3 0m i n 。 ( 1 3 ) p b s 清洗载玻片5 次，干燥。 ( 1 4 ) 分别向每张载玻片滴加s a b c ，温育3 0m i n 。 ( 1 5 ) p b s 清洗载玻片5 次，干燥。 ( 1 6 1d a b 显色：按照d a b 试剂盒的说明，取5 0i i l l 蒸馏水，加试剂盒中a ，b ，c 试剂各 5 滴，混匀后加至载玻片。室温暗处显色，显微镜下将反应时间控制在5 3 0m i n 。当镜 检出现细胞着深棕色而背景色淡时，将载玻片放入0 0 1 mp b s 中终止反应，用蒸馏水洗 2 次【4 3 1 。 2 2 3 3 间接e l l s a 法鉴定m c a b 与不同细胞系的反应性 用杂交瘤1 8 4 的上清液与人胃癌细胞a g s 、人肝癌细胞株h e p g 、宫颈癌细胞株h e l a 分 别做间接e l i s a 分析，每种细胞接种量为2 x 1 0 5 m l 。 内蒙古大学硕士学位论文 3 结果 3 1 杂交瘤细胞的染色体 所计数的1 0 0 个细胞染色体的平均数为9 2 条，高于小鼠骨髓瘤细胞s p 2 0 ( 2 n = 7 2 ) 和小鼠 脾细胞( 2 n = - 4 0 ) 的染色体数目( 图版3 1 ) 【1 1 。 3 2m c a b 的初步鉴定 3 2 1杂交瘤上清液m c a b 效价的测定 间接e l i s a 测定1 8 4 的上清液效价的结果显示：当抗原浓度为2 1 0 5 m l 时，稀释度为 1 ：1 0 ，1 ：1 0 2 ，1 ：1 0 3 ，1 ：1 0 4 的孔p n 均大于2 1 ，只有稀释度为1 ：1 0 5 的孔的o d 值小于2 1 。 因此除稀释度为1 ：1 0 5 的孔外，其余稀释度的孔均为阳性反应，而出现阳性反应的最大稀释度 为1 ：1 0 4 ，所以抗血清的效价为1 ：1 0 4 。 3 2 2m c a b 亚类的鉴定 2 4h 后的琼脂糖免疫双扩散法的结果显示：1 8 4 与i g g l 抗血清之间出现一条白色的弧形 沉淀线，而1 8 4 与其它抗血清之间没有沉淀线出现。这说明制备的抗人胃癌细胞a g s 的m c a b 1 8 4 属于i g g l 亚类( 图版3 2 ) 。 3 2 3 m c a b 特异性的鉴定 选择生长状态良好的h e p g 细胞( 图版3 3 ) 、h e l a 细胞( 图版3 4 ) 和正常人胎肺细胞( 图 版3 5 ) 进行细胞爬片。对比胃癌细胞a g s 与阳性血清( 图版3 6 a ) 和阴性血清( 图版3 6 c ) 的反应，杂交瘤1 8 4 分泌的m c a b 与a g s 呈阳性反应( 主要为细胞膜上出现棕黄色，图版 3 6 b ) ，而该m c a b 与宫颈癌细胞株h e l a ( 图版3 6 d ) 、肝癌细胞株h e p g ( 图版3 6 e ) 和正 常人胎肺细胞( 图版3 6 f ) 均呈阴性反应。 3 2 4 间接e l i s a 法鉴定m c a b 与不同细胞系的反应性 间接e l i s a 法测定的结果表明：仅m c a b1 8 4 与a g s 细胞的反应结果p n 均大于2 1 ， 呈明显阳性；而h e l a 细胞和h e p g 细胞与该m c a b 反应的p n 均小于2 1 ，不存在阳性反应 ( 表3 2 ) 。 黄翔华e l z - t 癌细胞a g s 单克隆抗体的制备和初步筌定 表3 1 抗体的效价( o d ) t a b l e3 1t i t e r so fa n t i b o d i e s ( o d ) 注：上述结果为两次检测结果的平均值，每次检测均设3 个重复孔 表3 21 8 4 上清液与不同细胞系反应的结果( o d ) t a b l e3 2t h er e a c t i v i t yo f1b 4s u p e m a t ew i t hd i f f e r e n tc e l ll i n e s ( o d ) 注：上述结果为两次检测结果的平均值，每次检测均设3 个重复孔 内蒙古大学硕士学位论文 4讨论 杂交瘤1 8 4 的染色体平均数为9 2 条，高于小鼠脾细胞( 2 n = 4 0 ) 和小鼠骨髓瘤细胞s p 2 0 ( 2 n = 7 2 ) 的染色体数【l 】，接近两种亲本细胞染色体数目总和，这进一步证实了经选择培养基h a t 筛选到的细胞i b 4 具有杂交瘤的特点。1 8 4 杂交瘤上清液中的m c a b 为i g g l 亚类。鼠源性 m c a b 有5 种，包括i g a 、i g d 、l g e 、i g g 和i g m 。其中i g g 又分为4 个亚类，分别是l g g l 、 i g g 2 a 、i g g 2 b 和i g g 3 。有研究表明，在培养基中刺激b 细胞分化，发现会依次出现i g m 、l g g 3 、 i g g 2 和i g g l 【4 1 。本次实验免疫动物共4 次，3 周次的免疫时间相对较长，产生的m c a b 为i g g l ， 与文献【4 报道相符。 细胞爬片免疫化学检测1 8 4 单抗特异性的结果显示：该m c a b 与宫颈癌细胞株h e l a 、肝 癌细胞株h e p g 和正常人胎肺细胞均呈阴性反应，即不存在明显的交叉反应；但它与胃癌细 胞株a g s 呈明显阳性反应，这说明该m c