抗原的提取与制备.ppt.ppt

绪言,第一节免疫学技术的范畴与应用,一、免疫学技术的范畴二、免疫学技术的应用特点,免疫学技术的范畴,1、对免疫系统的组成成分的数量、状态的测定2、对具有免疫活性物质的定性、定量测定（范围较广）,免疫学技术的应用特点,1、对象“包罗万象”2、方法“兼容并蓄”（牵涉到物理，化学，生物，医学，计算机等各学科）,*如何学习和使用免疫学技术？基本原理的理解+说明书和手册（向仪器或试剂盒供应商索取或网上下载）,第二节有关免疫学基本概念,一、抗原的概念与属性二、免疫细胞的概念与分类三、免疫应答的概念与过程,1、与抗体结合的物质2、能够被免疫系统识别的物质3、能够激活免疫细胞并与免疫效应物起反应的物质,抗原,免疫原性可识别、可反应性（诱导机体产生免疫应答的特性）免疫反应性选择结合性（和免疫应答产物特异性结合的特性）,抗原的概念与属性,*抗原和半抗原,免疫细胞的概念与分类,免疫细胞（immunecells）泛指所有参与免疫应答及与免疫应答活动相关的细胞。免疫活性细胞（immunecompetentcell，icc）能够接受抗原刺激、产生特异性的活化、增殖、分化并形成效应产物的淋巴细胞。,免疫细胞的类型,红细胞血小板肥大细胞中性粒细胞巨噬细胞树突状细胞浆细胞t细胞nk细胞,免疫应答的概念与过程,免疫应答（immuneresponse）免疫系统接触抗原后，免疫细胞对抗原进行识别；并使特异性淋巴细胞活化、增殖；表现出免疫效应的过程。免疫应答的阶段1、抗原识别阶段（antigen-recognizingphase）2、淋巴细胞活化阶段（lymphocyte-activatingphase）3、抗原清除阶段（antigen-eliminatingphase）,第三节抗原抗体反应的基本原理,一、抗原抗体反应的原理二、抗原抗体反应的特点三、影响抗原抗体反应的因素,抗原抗体反应的原理,1、抗原抗体之间的作用力2、抗原抗体结合物析出原因,参与抗原抗体相互作用的力,1、电荷引力（库仑引力）2、分子力（vanderwaals力，分子随机产生的电偶极矩极化而引起的相互作用）3、氢键结合力（氢和电负性大的原子结合,带正电的原子核暴露于外,可吸引其它电负性大的原子）4、疏水作用力（由大分子中疏水基团相互接近.而形成的一种作用力）,*以上作用力均非共价键,单独的抗原或抗体不自行聚合析出的原因,亲水胶体的形成1、电荷排斥力（由蛋白质的等电点决定）2、水化层的形成,抗原抗体的析出,抗原抗体的结合：可以导致电荷的中和水化层破坏蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体，聚合析出,需要电解质的辅助,抗原抗体反应的特点,1、特异性2、可逆性3、适合比例性,特异性及其相对性,抗原a,抗原c,抗原b,特异性反应,交叉反应,无反应,抗体,可逆性,k（亲和常数）=,ag+ab,agab,适合比例性,抗体含量,抗原含量,前带,后带,等价带,网格学说（latticetheory）,抗体过剩,抗原过剩,抗体抗体比例合适,抗原抗体反应的影响因素,1、电解质2、酸碱度（ph值6-8）3、温度（37-42。c）,第四节免疫学检测技术的评价,一、评价标准二、特异性与敏感性的关系,评价标准,specificity（特异）：检测信号针对性和排它性sensitivity（灵敏）：可测出的最低含量simplicity（简便）：操作是否方便safety（安全）：是否有污染，对操作者的伤害saving（节约）：性能/价格比,特异性与敏感性的关系,灵敏度高、特异性低（假阳性）特异性高、灵敏度低（假阴性）,抗原的提取与制备,第一节抗原/免疫原制备的基本概念,一、抗原制备的目的二、抗原的“纯度”三、抗原制备的主要技术途径,抗原制备的目的,免疫原：激活t、b细胞半抗原：检测相应抗体,抗原的“纯度”,免疫原：除保留可被b细胞识别的抗原决定簇，还需保留足够的被t细胞识别的抗原决定簇半抗原：尽可能减少影响反应特异性的抗原决定簇,抗原制备的主要技术途径,天然抗原分离、纯化半抗原人工合成、载体联接抗原肽合成、基因工程制备,第二节完全抗原/免疫原的制备方法,一、颗粒性抗原的制备二、可溶性抗原的制备,颗粒性抗原的制备,1、抗原的获取：采集分离2、无害化处理：去除对机体有毒成分，如用甲醛,（细胞，细菌）,可溶性抗原的制备与纯化,1、处理与粉碎2、蛋白质分离富集3、单一组分提取4、抗原纯度鉴定,（蛋白质、糖蛋白、脂蛋白）,处理与粉碎,组织粉碎：机械高速捣碎机，研磨生物酶消化（蛋白酶、胶原酶）细胞破碎：物理反复冻融，冷热交替，超声化学表面活性剂生物溶酶，自溶,蛋白质分离,选择性沉淀：盐析，有机溶剂沉淀，水溶性非离子型聚合物沉淀（聚乙二醇）透析技术：半透膜超滤技术：负压+滤膜,单一组分提取的方法,层析技术：凝胶过滤离子交换亲和层析,凝胶层析（分子筛）,离子交换层析,亲和层析,单一组分提取的方法（续）,离心技术：差速离心密度梯度离心电泳技术：电泳洗脱等电聚焦,密度梯度离心法控制溶液的比重，将不同比重的分子或细胞通过离心方法加以分离分为：*不连续密度梯度离心法（单次密度梯度离心法）*连续密度梯度离心法,不连续密度梯度离心法（单次密度梯度离心法）分离液仅形成单一的密度层，可在该层中获取与其比重一致的细胞或分子。该法较多用于外周血单个核细胞的分离，常用的分离液为ficoll。,聚蔗糖泛影葡胺,不连续密度梯度离心分离法,连续密度梯度离心法分离液可形成一连续的密度梯度层，在不同的密度梯度层中可获取所需的不同种类的细胞。该法可一次分离得到几种所需的不同类型血细胞。常用于外周血细胞的分离，使用的分离液为percoll。,聚乙烯吡咯烷酮,连续密度梯度离心分离法,单一组分提取的方法,电泳技术：电泳洗脱：根据蛋白质的电荷和分子大小分离等电聚焦：根据蛋白质的等电点分离,电泳技术(等电聚焦),抗原纯度鉴定,方法：电泳法免疫法层析法指标：电泳纯（电泳法）免疫纯（免疫扩散法，纯度要求高）,第三节半抗原免疫原制备的方法,一、载体的选择二、半抗原与载体的联接,载体的选择结构复杂的大分子,蛋白质载体：bsa、hsa、ova（卵清蛋白）、klh（钥孔嘁血蓝蛋白）聚合多肽载体：多聚赖氨酸高分子聚合物载体：羧甲基纤维素,半抗原与载体的联接,1、连接方式：物理法（吸附）化学法2、化学连接方法：直接联接法：适用于带游离氨基或游离羧基的半抗原间接联接法：适用于没有游离氨基或游离羧基的半抗原,半抗原与载体直接联接,碳化二亚胺法蛋白质-coo+r-n+=cn-rh-n+-r蛋白质-coo-c-nh-r+半抗原-nh2o蛋白质-c-nh-半抗原+r-nh-co-nhr,半抗原与载体直接联接,戊二醛法蛋白质-nh2+半抗原-nh2+coh-（ch2）3-coh蛋白质-n=ch-（ch2）3ch=n-半抗原,半抗原与载体直接联接,氯甲酸异丁酯法半抗原-cooh+cl-coo-ch2ch（ch3）2oo半抗原-c-o-c-o-ch2ch（ch3）2+蛋白质-nh2半抗原-co-nh-蛋白质+ho-ch2ch（ch3）2,半抗原与载体间接联接,琥珀酸酐法oo半抗原-ch2oh+c-o-cch3ch3o半抗原-ch2o-c-(ch2)2-cooh,半抗原与载体间接联接,o-（羟甲基）羟胺法半抗原-c=o+h2n-o-ch2-cooh半抗原-c=n-o-ch2-cooh,半抗原与载体间接联接,一氯醋酸钠法半抗原-oh+cl-ch2-coona半抗原-ch2-cooh,半抗原与载体间接联接,重氮化的对氨基苯甲酸法hooc-nh2+nano2hooc-n=n半抗原-oh