选修3—现代生物科技专题.ppt

生物选修3现代生物科技专题,目录,专题1基因工程专题2细胞工程专题3胚胎工程专题4生物技术的安全性和伦理问题专题5生态工程,专题1基因工程,基础理论和技术的发展催生了基因工程,20世纪中叶，基础理论取得了重大突破1.DNA是遗传物质的证明2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立3.遗传密码的破译,技术发明使基因工程的实施成为可能1.基因转移载体的发现2.工具酶的发现3.DNA合成和测序技术的发明4.DNA体外重组的实现5.重组DNA表达实验的成功6.第一例转基因动物问世7.PCR技术的发明,基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的生物类型和生物产品。,一、基因工程的概念,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的生物类型和生物产品,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,基本工具：限制性核酸内切酶“分子手术刀”DNA连接酶“分子缝合针”基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,二、DNA重组技术的基本工具,黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,1、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。,当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。,识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(6个,4、5、8个),主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。,4000种。,（1）来源：,（2）种类：,（3）作用：,（4）结果：,形成两种末端,1、限制性核酸内切酶“分子手术刀”（小结）,要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端。,是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成重组的DNA分子了?,实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。,思考题：,1、种类：2、作用部位：,磷酸二酯键,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。,2、DNA连接酶“分子缝合针”,3、基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”,（1）运载体的作用,作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。利用运载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。（随载体的复制而复制）,（2）作为运载体必须具备的条件,能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接。具有某些标记基因，便于进行筛选。必需是安全的，不会对受体细胞有害。大小应适合，便于提取和操作,（3）常用的运载体,3、基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”,细菌细胞质的质粒噬菌体的衍生物动植物病毒,注意：真正用作运载体的质粒都是人工改造过的。,3、基因进入受体细胞的运载体“分子运输车”,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。,质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并且具有自我复制能力的双链环状DNA分子。,质粒是基因工程最常用的运载体。,（补充知识）基因的结构1、原核细胞的基因结构,与RNA聚合酶结合位点,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,2、真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。,启动子与起始密码,二、基因工程基本操作的四个步骤,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,（一）目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,2、获取目的基因的常用方法,未知序列,（1）从基因文库中获取目的基因：,基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(genelibrary)基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.,基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较,从基因文库中提取目的基因的依据见”世纪金榜”第4页,概念：PCR全称为_，是在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_(做启动子)、_等前提条件：。,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,结果：,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,TaqDNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,(2)利用PCR技术扩增目的基因,双链的解开,过程：,a、DNA变性（90-96）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-60）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,（3）人工合成,反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,杂交双链(单链RNA/单链DNA),单链DNA,反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA(目的基因),（3）人工合成,根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,1.用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。2.用_切断目的基因，使其产生_。,二、基因表达载体的构建,核心,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,质粒,DNA分子,DNA连接酶,4.过程:,（二）基因表达载体的构建,核心,5.基因表达载体的组成：,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,（二）基因表达载体的构建,核心,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质,终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录,标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,(三)将目的基因导入受体细胞,转化,方法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,(三)将目的基因导入受体细胞,农杆菌介绍:Ti质粒上有T-DNA,称为可转移的DNA,它可转移到受体细胞,并整合到受体细胞染色体DNA上.,2、将目的基因导入动物细胞(受精卵)显微注射法-世界上第一例“超级小鼠”的成功设备:显微注射仪,3、将目的基因导入微生物细胞,(三)将目的基因导入受体细胞,过程：,用Ca2+处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,过程:A.首先取出转基因生物的基因组DNAB.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针C.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了Mrna.,三、基因工程的应用,1、抗虫转基因植物方法：,从某些生物中分离出具有杀虫活性的基因，将其导入农作物中，使其具有抗虫性,Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等,（一）植物基因工程硕果累累,2、抗病转基因生物,目的基因包括：,病毒外壳蛋白基因、病毒的复制酶基因、抗真菌转基因植物中的有几丁质酶基因和抗毒素合成基因,3、抗逆转基因作物4、利用转基因改良植物的品质方法：,将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因，导入植物中，或者改变这些氨基酸合成途径中某种酶的活性。,1、用于提高动物生长速度2、用于改善畜产品的品质,目的基因：生长激素基因,（二）动物基因工程前景广阔,举例:将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，获得转基因牛，其他营养不变的情况下，乳糖含量大大降低。,3、用转基因动物生产药物-动物乳腺生物反应器,4、用转基因动物作器官移植的供体供体动物：存在的难题：解决方法：,猪,免疫排斥,将供体基因组导入某种基因调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。,（三）、基因工程药品异军突起工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系。我国已生产的产品：,白细胞介素-2、干扰素、乙肝疫苗等,（四）基因诊断和基因治疗,基因诊断,定义：基因诊断是用放射性同位素(如32P)、荧光分子等标记的DNA分子做探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。,生物芯片从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。,1、体外基因治疗：2、体内基因治疗：,从病人体内获得某种细胞，进行培养，然后，在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。,直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法。,用于基因治疗的基因种类A.从健康人体上分离得到的功能正常的基因，用以取代病变基因，或依靠其表达产物。B.反义基因。即通过产生的mRNA分子，与病变基因产生的mRNA进行互补，来阻断蛋白质合成。C.编码可以杀死癌变细胞的蛋白酶基因，又叫做自杀基因。,（四）基因诊断和基因治疗,基因治疗,1、环境监测基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。,2、环境污染治理基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。,（五）基因工程与环境保护,蛋白质工程的崛起,四、蛋白质工程,(一)蛋白质工程崛起的缘由,、基因工程（）基因工程的实质：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，使后者产生本身不能产生的蛋白质，从而表现出新的性状。,（）基因工程的不足：在原则上只能产生自然界已存在的蛋白质。,、天然蛋白质的不足,天然蛋白质的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。,在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生产中每一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高，在这种条件下，大多数酶会很快变性失活。提高蛋白质的稳定性是工业生产中一个非常重要的课题。一般来说，提高蛋白质的稳定性包括：1、延长酶的半衰期2、提高酶的热稳定性3、延长药用蛋白的保存期4、抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。,（二）蛋白质工程的概念通过物理化学与生物化学等技术了解蛋白质的结构与功能，并借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组技术改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质的技术。其中基因工程是关键技术，因此蛋白质工程又被称为第二代基因工程。,基础:以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础手段:基因修饰或基因合成：借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组技术目的:对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类生产和生活的需要。,蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;,（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。,一级结构,(二)蛋白质工程的基本原理,蛋白质的一级结构，专指多肽链中氨基酸（残基）的排列的序列（sequence）。,二级结构,(二)蛋白质工程的基本原理,三级结构,四级结构,(二)蛋白质工程的基本原理,、蛋白质工程的原理（1）了解蛋白质的结构方法：自动化测序快速测定大量蛋白质分子的一级结构用射线晶体衍射法测定三维空间结构，用核磁共振法了解其构象。（2）改造类型：大改、中改和小改。大改：根据氨基酸性质和特点，设计并制造出自然界不存在的全新蛋白质，使之具有特定的氨基酸序列、空间结构和预期功能。中改：是指蛋白质分子中替代某一个肽段或一个特定的结构域。小改：通过基因工程中的定点诱变技术，有目的地改造蛋白质的性质和功能。（定点诱变技术是改变蛋白质的核心技术之一。）,(二)蛋白质工程的基本原理,基因定点诱变技术的理解(苏教版),后代中半数为诱变的分子,脱氧核苷酸,聚合酶和连接酶,含突变顺序的分子片段,空间结构完全清楚的蛋白质,思考：基因定点诱变技术与基因突变的比较,DNA复制过程中,产生新基因，从而产生新性状,生物体外,生物体内,定向改造,不定向性,PCR技术,物理化学方法,、蛋白质工程原理,（）原理：由预期的找到相应序列,基因表达（转录和翻译）形成氨基酸序列的多肽链形成具有高级结构的蛋白质行使生物功能,天然蛋白质的合成途径：,蛋白质工程的途径：预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相应的脱氧核苷酸序列酸,天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素B23-B28氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。,科学家积极探索将蛋白质工程应用于微电子方面,如用蛋质工程制成电子元件具有体积小、耗能少和效率高的特点。,鼠人嵌合抗体可以防止机体高度过敏。,tPA（纤维蛋白溶解酶原激活因子）：用于溶解血栓块，医疗心肌梗死等。用蛋白质工程将天门冬酰胺改为谷氨酰胺后，tPA在血液中的停留时间大大加长。,干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病毒活性为106U/mg，只相当于天然产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的-干扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究发现，-干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第17位、31位和141位），推测可能是有一个或几个半胱氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第17位的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结果使大肠杆菌中生产的-干扰素的抗病性活性提高到108U/mg，并且比天然-干扰素的贮存稳定性高很多。,水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有多种变异体，由65或66个氨基酸残基组成。水蛭素在临床上可作为