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不同生长期荞麦中降糖因子含量的测定及保健饮料的研制 摘要 荞麦又称乌麦、花麦或三角麦，是蓼科( p o l y g o n a c e a e ) 荞麦属( f a g o p y r u m m i l l ) 的短季草本双子叶植物，适于在冷凉气候下生长。植物分类学上主要有苦荞和甜荞两 个品种。本地荞麦主产于吉林省西部地区，为甜荞。荞麦在种植过程中不需旋用任何 农药，是真正的“绿色食品”资源，而且其药用价值独特，荞麦中含有的营养成分有： 手性肌醇、黄酮类化合物、高活性蛋白、维生素、高活性膳食纤维、淀粉，矿物质等。 手性肌醇( c h i f o i n o s i t a l ) ，是肌醇的旋光异构体，分为l 、d 两种结构，分子 式为：c 。h 。0 6 ，分子量为1 8 0 1 6 。外观为白色粉状结晶，粉碎性好，溶于水和乙醇。养 麦中含有的荞麦糖醇，它是手性肌醇( c h i r o i n o s t i o l ，d c i ) 及其半乳糖苷，手性肌醇 结构类似p h 2 0 型胰岛素调节介体，膳食补充手性肌醇及黄酮类物质，能促进胰岛素 的敏感性，对糖尿病人控制血糖有效； 本研究旨在建立荞麦中手性肌醇的快速定性检测方法以及绘制不同生长期盘播 养麦中手性肌醇和黄酮类物质含量的曲线，并进一步以最高峰值期为原料研制对糖尿 病有辅助治疗功能的荞麦汁保健饮料。 手性肌醇的定性检测采用薄层层析方法，在定性检测养麦中，确定手性肌醇薄层 板展开的最佳条件为：点样量为l u l ；展开剂为：正丁醇：冰醋酸：水= 4 ：1 ：1 ； 显色剂为高碘酸钠、联苯胺溶液；展开次数为1 次。另外，手性肌醇的定性检测还可 以采用气相色谱、液相色谱和气相色谱质谱联用等方法。一般上述方法中检测仪器 和试剂昂贵、条件严格、检测费用较高。本检测方法的优点是操作容易、方法简便、 经济实用，可简便快捷的对样品进行手性肌醇的定性检测。 对不同生长期的盘播荞麦苗中手性肌醇含量的定量采用h p l c 法。盘播荞麦苗手 性肌醇的含量在生长至第3 5 天时达到高峰为5 5 7 5 u g g ，是荞麦种子含量的4 2 7 倍 ( 种子中手性肌醇的含量为1 3 0 5 u g g ) ；对不同生长期的盘播莽麦苗中黄酮类化合 物的定量采用分光光度法。测得其总黄酮的含量在生长第1 7 天时含量达到最高，为 1 0 5 6m g g ，是荞麦种子中黄酮类化合物含量的7 2 3 倍。第3 5 天时总黄酮的含量 为9 6 5 m g g ，较高峰值略有下降。综合考虑两种糖尿病有效因子的含量变化情况， 确定生长期第3 5 天的盘播荞麦苗具有开发利用的价值。 采用生长期为3 5 天的盘播荞麦苗为原料研制的保健饮料，经护绿、打浆、离心、 调配、灭菌后制成绿色透明的清爽型保健饮料，经检测，本饮料中手性肌醇的含量为 6 5 5 u g m l ，黄酮类化合物的含量为0 5 2 6 m g m l 。如每天饮用5 0 0m l 本保健饮料则 可摄入3 2 7 5 u g 的手性肌醇和2 6 3 o m g 的黄酮类化合物，因此在日常生活中饮用本 保健饮料对于糖尿病人可以起到辅助治疗的功效，而对于正常人则可以起到一定的预 防作用。 关键词：荞麦，手性肌醇，黄酮类化合物，定性检测，保健饮料 m o n i t o rt h e v a r i e t y o fd e c l i n e h y p o g l y c e m i aa g e n ti n d i f f e r e n t g r o w i n gp e r i o ds e e d l i n gb u c k w h e a ta n dm a n u f a c t u r i n gb e v e r a g e a b s t r a c t b u c k w h e a t ，a g a i nc a l l e db l a c kw h e a t 、f l o w e rw h e a to rt r i a n g l ew h e a t ，a d i p e p t i d ec o t y l e d o n sh e r b a c e o u sc r o pa d a p t e dt oc o o l ，m o i s tc l i m a t e sa n ds h o r t g r o w i n gs e a s o n ，b e l o n g rt ot h ep o l y g o n a c e a c ef a m i l y , b o t a n i c a l l yd i v i d e di n t ot w o m a i n c a t e g o r i e s ：f a g o p y r u mt a t u r i c u m g a e r t na n d f a g o p y r u me s c u l e n t u m m o e n c h ，t h en a t i v eb u c k w h e a tb e l o n g st of a g o p y r u me s c u l e n t u mm o e n c hi sm a i n l y c u l t i v a t e di nt h ew e s t e r nr e g i o no f j i l i np r o v i n c e s b u c k w h e a ti np l a n tp r o c e s sd o e s n o tn e e d a n ya g r o c h e m i c a l ，i ti sr e a l g r e e nf o o d ”r e s o u r c e s ，a n di t sm e d i c a lu s e v a l u ei ss p e c i a l i nt h eb u c k w h e a ti m p l i e s ：c h i r o i n o s t i o l ，f l a v o n ec o m p o u n d ，h i g h a c t i v i t ya l b u m e n ，v i t a m i n ，h i g ha c t i v i t ym e a lf i b e r , s t a r c h ，m i n e r a le t c c h i r o i n o s t i o li st h es t e r e o i s o m e rt h ei n o s i t o l ，d i v i d e di n t ot w ok i n d so f s t r u c t u r e so fla n dd d c h i r o i n o s t i o lh a sb i o l o g i c a la c t i v i t y i t sm o l e c u l a rf o r m u l ai s c 6 h 1 2 0 6 ，m o l e c u l a rw e i g h ti s18 0 1 6 i t sa p p e a r a n c ei sw h i t ea n dc r y s t a lp o w d e r d c h i r o i n o s t i o lh a sap o s i t i v ee n t h a l p yo fs o l u b i l i z a t i o n d i s s o l v e di nw a t e ra n d e t h a n 0 1 t h es t r u c t u r eo fd - c h i r o i n o s t i o la n a l o g yi n s u l i na d j u s tt h ea m b o c e p t o r , m e a la d d e dd c h i r o i n o s t i o l a n df l a v o n em a t t e r , c a l lp r o m o t ei n s u l i no fs e n s i t i v i t y ，t o t h ed i a b e t i cc o n t r o lb l o o ds u g a ra v a i l a b i l i t y t h i sr e s e a r c ha i m st ob u i l du pb u c k w h e a tc h i r o i n o s t i o lo ff a s td e t e c t i o nm e t h o d a n dc e r t a i nd i f f e r e n tg r o w i n gp e r i o db u c k w h e a ti nc h i r o - i n o s t i o la n df l a v o n em a t t e r c o n t e n to fh i g hp e a kp e r i o d ，a n df u r t h e rt a k ei ta sr a wm a t e r i a lt om a n u f a c tc a r e b e v e r a g ea s s i s t a n t l yt ot h ed i a b e t e sm e l l i t u st r e a t m e n t u s i n gt l ct od e t e r m i n et h ed c h i r o - - l n o s i t o lp r o p e r t y , i nt h i sr e s e a c ht h eb e s t c o n d i t i o ni sl a u n c ht r i e slu l ，v o l u m no fs a m p l en - b u t y la l c o h o l ：g l a c i a la c e t i c a c i d ：a q u a = 4 ：l ：l ，u s es o d i u mp e r i o d a t ea n db e n z i d i n ea q u as h o wt h ec o l o r ， s p r e a d i n gt i m e si so n et i m e m o r e o v e r , t h ec h i r o i n o s t i o ld e t e c t i o nc a na l s oa d o p tt h e g a sp h a s ec o l o rs p e c t r u m ，t h el i q u i dp h a s ec o l o rs p e c t r u mp h a s ec o l o rs p e c t r u m - t h e q u a l i t ys p e c t r u md i a m i d i n ew i t he t c t h ea b o v e - m e n t i o n e dm e t h o di n d e t e c t i o n a p p a r a t u ss h i ni se x p e n s i v e ，c o n d i t i o ns t r i c t ，d e t e c t i o ne x p e n s e sh i g h e r t h ea d v a n t a g e o ft h i sd e t e c t i o nm e t h o di so p e r a t i o ne a s y , m e t h o ds i m p l e ，e c o n o m yp r a c t i c a l ，s i m p l e f a s to f t ot h es a m p l ee a r l yo nc h i r o i n o s t i o lo f d e t e c t i o n u s i n gh p l cm e t h o dt od e t e r m i n et h ed - c h i r o - - i n o s i t o lp r o p e r t yi n d i f f e r e n t g r o w i n gp e r i o ds e e d l i n gb u c k w h e a t t h ee f f e c ts h o w i n gt h a tt h ed c lp r o p e r t ya u m n s t h ep e a ko f5 5 7 5u gw h e ng r o w i n g3 5d a y s ，i ti s4 2 7t i m e so fd c ip r o p e r t yi n b u c k w h e a ts e e d t od e t e r m i n et h et h ev a r i c t yo ft o t a lf l a v o n ei nd i f f e r e n tg r o w i n g p e r i o ds e e d l i n gb u c k w h e a tu s es p e c t r o p h o t o g r a p h y t h et o t a lf l a v o n ep r o p e r t ya t t a i n s t h ep e a ko f10 5 6 m g gw h e ng r o w i n g17d a y s ，i ti s7 2 3t i m e so ft o t a lf l a v o n e p r o p e r t yi nb u c k w h e a ts e e d a n d3 5d a y so f9 6 5m g g ，c o m p a r i s o nt h ep e a ks l i g h t l y d e s c e n d s ot h es e e d l i n gb u c k w h e a to fg r o w i n g3 5d a y sh a sd e v e l o p m e n tv a l u e k e y w o r d s ：b u c k w h e a t ，c h i r o - i n o s i t o l , f l a v o n o i dc o m p o u n d ，q u a l i t a t i v e d e t e c t i o n ，n y g i e n i e a lb e v e r a g e 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：多1 仁葵- 、 签字闩期：泖多年月2 徊 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 学位论文作者签名：勇j 仁袭、签字日期：d 扩巧年月斟日 导师签字日期：知年6 月巧旧 宣楚些查! 塑受士学位论文 不同生长期荞麦中降糖因子含量的测定及保健恢料的研制 第一章绪论 荞麦又称乌麦、花麦或三角麦，是蓼科( p o y g o n a c e a e ) 养麦属( f a g o p y r u m i i l l ) 的短季草本双子叶植物，适于在冷凉气候下生长。荞麦起源于中国，是我国最古老的 栽培作物之一。荞麦性喜凉爽，耐瘠薄、生长期短，适应能力强，可以在雨水较少、 土地贫瘠的地区种植。我国东北、青藏高原、内蒙古高原和西南各地，广泛种植荞麦。 荞麦植物分类学上主要有苦荞( f a g o p y r u mt a t a r i c u m ( l i n n ) 6 a e r t n ) 和甜养 ( f a g o p y r u ms c u l e n t u mm o e n c h ) 两个品种，本地栽培的养麦为甜荞。养麦生育期较短， 春、夏、秋三季皆可播种，逢灾年用荞麦进行补种，可获得一定的收成，是较好的救 灾备荒作物。荞麦也是世界上许多地区的一类重要粮食作物，主要生产国是中国、俄 罗斯、日本、波兰、法国、加拿大、美国等 。养麦中含有多种具有保健功能的 营养成分，如生物类黄酮、高活性蛋白、维生素、高活性膳食纤维、淀粉，荞麦中脂 肪酸含量较高且结构合理，矿物质含量也十分丰富，是一种很有开发前景的粮食资 源。 1 1 荞麦中主要营养成分概况 1 1 1 荞麦的主要成分及作用 养麦营养成分全面，富含蛋自质、淀粉、脂肪、粗纤维、维生素、矿物元素等。 与其他的粮食作物相比，具有的独特的优势见表1 。荞麦种子的蛋白质、脂肪含量高 于大米和小麦，蛋白质含量也高于玉米，而且其蛋白质的氨基酸组成十分平衡；维生 素b 。高于其他粮食的4 2 4 倍，且含有其他禾谷类粮食所没有的叶绿素、芦丁即维生 素p 。荞麦中含有1 9 种氨基酸，其中人体必须的8 种氨基酸均较高。荞麦不仅营养丰富， 而且有较高的药用价值1 。荞麦气味甘、平、寒、无毒。入脾、大肠经。具有开 胃宽肠、下气消积、清热利湿之功效，治疮痛、疖游、丹毒、烫火伤，多外用。据农 政全书、本草纲目记载，荞麦可“实肠胃，益气力，续精神，做饭食可压丹石毒”， 也可“降气宽肺，磨积滞，清热肿风痛。降除白浊白带、脾积泄泻”。荞麦中含有的 黄酮类化合物具有防治糖尿病、高血压、冠心病、抗癌、防止内出血，延缓衰老等多 种生理功能。其中芦丁具有软化血管、保护视力的作用。同时食用荞麦能健胃消食、 促进消化、抑制肥胖，增加身体对疾病的免疫力。同时荞麦对儿童的生长和智力的开 发也很有作用。荞麦中所含的丰富矿物质有特殊的保健意义。c r ”等微量元素含量丰 富，可增加胰岛的功能起到降血糖的作用；含有的槲皮素可提高机体抗氧化能力；此 外还含有较多的水溶性维生素及糖醇类物质。这些成分对降血糖、血脂和血压以及软 吉林农业大学硕士学位论文 不同生长期荞麦中阵糖因子含量的测定及保健恢料的研制 化血管有一定作用 型。；蝤。豳。型0 型垒筮星盛耋曼叁：陋纠。掣。 墨曼。糕。鬣，。，尘怂。慈瑟 扭白( )65 1 05997885 曩膏胁( ) 1 ，72 1 5 18 1 3 43 趋糟( ) s 9 7 31 7 6 7 661 22 越f ( * )l0 l l6 2o - 6o 4 i3 v b l ( f 珥1 0 0 ) 00 8 01 8 04 601 103 l v 岛( n - j o o i ) 0 1 2 05 000 6o0 2 010 vp()0 0 9 5 02 1 30 300 0 v p p ( w f t 0 0 1 ) 2 ， 25 525l 2 0 叶曩( 眦1 0 0 9 )i3 0 4 04 2 000 ( - 0 ，2 9 04 0 01 9 51 t 7 20 - 2 7 钠(_)0o耗0 0 3 3o 0 0 1 80 t 0 0 1 7 0 0 0 2 ， 钙()0 0 3 8 00 1 600 3 80 呻9 00 2 2 t(0 1 4 02 2 00 5 1 0 0 6 3 00 6 0 馈( ) 00 1 4 00 8 600 0 4 200 2 4 00 0 1 6 一( 呻 4 ) 4 0 45 94022 一 镊w 小 1 03 u7一一 一 型竺尘! ! ! ! j 里! 一生l 三 注：中华人民共和国商业部谷物化学研究所1 9 8 9 1 2 荞麦中降糖特效因子手性肌醇的基本概况 荞麦中含有荞麦糖醇，它是手性肌醇( d - c h i r o i n o s t i o l ，d c i ) 及其半乳糖苷，结 构类似于p i t 2 0 型胰岛素调节介体。1 i 型糖尿病人代谢紊乱，体内不能进行手性肌醇 的生物合成，p h 2 0 型胰岛素调节介体水平低，膳食补充手性肌醇可有效减轻糖尿病 症状。试验证明：食用莽麦具有明显的降血糖、血脂效果，据研究报道其降血糖的 机理与此活性成分有关。 1 2 1 手性肌醇的结构与性质 手性肌醇( c h i r o i n o s i t a l ) 是肌醇的旋光异构体，分为l 、d 两种结构。，d 型手性肌醇具有生物活性，其分子结构为如图l 所示。分子式为：c e h l 。0 6 ，分子量为 1 8 0 1 6 。 删 h o 。一、，o 卜量 i d o ， ：。 、0 1 - 1 o h 鲴1 手性肌醇的分子结构 f i g 1m o l e c u l es t r u c t u r eo f c h i r o - i n o s i t a l 2 吉林农业大学硕士学位论文不同生长期养麦中降糖园子台董的测定及保健饮料的研制 1 2 2 手性肌醇的降糖机理与功效 在荞麦中手性肌醇有两种存在状态，即：游离态和结合态。其结构类似于p h 2 0 型的胰岛素调节介体。在唯一的降血糖激素胰岛素的信号传导过程中发挥极为重要的 作用，是胰岛素信号传递过程的信使，直接促进胰岛素与其受体结合，从而促进胰岛 素发挥作用，如果缺乏手性肌醇则将导致胰岛素抵抗。胰岛素是人体胰腺口细胞分 泌的身体内唯一的降血糖激素。胰岛素抵抗是指体内周围组织对胰岛素的敏感性降 低，组织对胰岛素不敏感，外周组织如肌肉、脂肪对胰岛素促进葡萄糖摄取的作用发 生了抵抗。研究发现胰岛素抵抗普遍存在于i i 型糖尿病中，为i i 型糖尿痫的根本病因 因此i i 型糖尿病的治疗应针对其病因，改善胰岛素抵抗，只有这样才能使糖尿病 患者得到及时有效及根本上的治疗，预防糖尿病慢性并发症的发生和发展。手性肌醇 可提高周围组织对胰岛素的敏感性，消除胰岛素抵抗，从根本上调节机体的生理机能 和代谢平衡，从而对糖尿病及其并发症起到显著效用。研究证明。，手性肌醇为新 一代胰岛素促敏剂，能有效地促进胰岛素功能，降低血糖、血中胰岛素、血甘油三脂 水平等。膳食补充手性肌醇可以有效减轻糖尿病症状。另外，荞麦中富含黄酮类物质， 与手性肌醇协同作用可以实现对糖尿病及其并发症的辅助治疗。 1 2 3 手性肌醇的研究现状 近年来资料表明，国内外科学家对手性肌醇的作用较为关注，其中以加拿大科学 家的研究尤为突出，研究结果表明1 ”：养麦提取物可以显著降低糖尿病大鼠的血糖。 目前为止，国外对手性肌醇的研究偏重于其治疗糖尿病机理方面，而对于手性肌醇的 制取，主要采用化学合成和从养麦中分离提取两种方法。其中，对荞麦中手性肌醇衍 生物的提取分离研究较多，到目前为止手性肌醇的制取还处于实验室阶段。 国内目前只有上海诺金科生物科技有限公司一家，利用酶工程技术将养麦中手性 肌醇的衍生物及肌醇的衍生物转化手性肌醇及肌醇单体，混合加入其他成分制成药 品。此外还有关于荞麦中可溶性糖醇的研究报道。，其中涉及到手性肌醇，但只限于 其含量的测定，其余未见更多报道。 吉林农业大学硕士学位论文 不同生长期荞麦中降捃因子含量的测定及保健饮料的研制 1 3 本论文的立题意义和研究内容 1 3 1 立题意义 随着现代社会人类生活水平的提高、饮食习惯的改变、体力劳动减少以及精神压 力增大，糖尿病患者也在逐年增多。世界卫生组织预测，全球搪尿病患者数到2 0 2 5 年将会翻一番。当前全球患糖尿病的人数多达i 5 亿。据世界卫生组织统计，糖尿 病人的死亡率目前仅次于意外死亡和肿瘤死亡，位居第三。我国糖尿病患者也逐年猛 增，患病率高达4 一5 。有超过8 0 0 0 万糖尿病异常人群，每年死于糖尿病并发症的患 者高达1 5 0 多万。据调查。5 ，在我国还将以每年7 5 万人的速度递增，其中9 0 以上为i i 型糖尿病。另外，我国葡萄糖耐量降低者和糖代谢异常者也占有相当大的比例，这些 人群都是潜在的糖尿病患者。在我国约有6 0 的i i 型糖尿病人未能得到及时诊断，耽 误了最佳医疗时期。为了预防、减少和延缓糖尿病及其合并症的发生和发展，就必须 全面控制好病人的病情，包括纠正异常的高血糖、高血脂等。 但是，由于糖尿病患者的血糖持续偏高，为控制病情长期服药带来胃、肠、肝、 肾等器官的损伤令病人痛苦不堪。因此，人们对既能治病又能养生的饮食疗法更为重 视，饮食疗法在我陶拥有悠久的历史，且符合现代生活人们追求原始回归自然的要求。 因而研制开发利于糖尿病防治的功能食品具有重要的现实意义，这也是科研工作者的 当务之急。 本文拟研制的以荞麦为主要原料的功能性保健饮料不仅能使糖尿病人通过饮食 补充手性肌醇及黄酮类物质，进而促进胰岛素的敏感性：同时还能实现对糖尿病人稳 定血压、降低血脂等的辅助防治功效；另外也可以能充分利用本地资源及促进农业结 构调整、农民增收并带动相关产业的快速协调发展。 1 3 2 研究内容 通过确定薄层层析最佳展开剂以建立手性肌醇的快速定性检测方法，并跟踪检测 不同生长期盘播荞麦中手性肌醇含量( h p l c 法) ，确定手性肌醇和黄酮类物质含量的 高峰期，并以其为原料，进行科学组方研制针对糖尿病有辅助治疗功能的清爽型莽麦 保健饮料。 主要研究内容： 1 建立荞麦的手性肌醇的定性检测方法； 4 吉林农业大学硕士学位论文不同生长期荞麦中降糖因子含量的测定及保健饮料的研制 2 跟踪检测不同生长期盘播莽麦中手性肌醇的含量，确定盘播荞麦手性肌醇最高含 量的生长期； 3 研制以荞麦为原料的保健饮料。 吉林农业大学硕士学位论文不同生长期荞麦中降糖因子含量的测定及保健饮料的研制 第二章手性肌醇的定性检测方法研究 养麦中还含有功能性的糖醇，它是手性肌醇( d c h i r o i n o s t i o l ，d c i ) 及其半乳糖 苷，结构类似于p h 2 0 型胰岛素调节受体。研究证明：，手性肌醇为新一代胰岛素 受体促敏剂，能有效地促进胰岛素功能，降低血糖、血甘油三酯水平等。进一步研究 发现! ：d 手性肌醇在唯一的降血糖激素胰岛素的信号传导过程中发挥极为重要的 作用，如果缺乏则导致胰岛素抵抗。膳食补充手性肌醇对糖尿病可起到防和治的双重 功效。目前关于手性肌醇的定量检测一般采用液谱或气谱法“。手性肌醇定性方法 还未见报道，本研究为手性肌醇的简便快速定性检测建立了方法 2 1 材料与方法 2 1 1 材料与设备 材料 荞麦种子：产自吉林省双辽市； 薄层层析板：s i l i z a g e l6 0g f 2 5 4 2 0c m * 2 0 c m 德国m e r c k 制 试剂：葡萄糖、麦芽糖、木糖醇、9 5 乙醇、j 下丁醇、冰乙酸、高碘酸钠、联苯 胺，以上试剂均为分析纯； 手性肌醇标准品：购自s i g m a a l d r i c h 公司，纯度9 5 。 设备 离心机：l g l o 一2 4 a 型，北京医用离心机厂 微型植物粉碎机：f z l 0 2 型，天津市泰斯特仪器有限公司 电热鼓风干燥箱：1 0 1 a - 2 型，上海试验仪器厂 水浴振荡器：d s h z - - 3 0 0 型，江苏太仓试验设备厂 移液器：0 1 l o u l ，购自s i g m a a l d r i c h 公司 分析电子天平：a l c 1 1 0 4 ，北京赛多利斯仪器系统有限公司 2 1 2 方法 原料的预处理 养麦种子脱皮后将籽粒粉碎成养麦粉，过1 0 0 目筛网的荞麦粉，6 0 o c 干燥6 h 备用。 6 吉林农业大学硕士学位论文不同生长期荞麦中降糖因子含量的测定及保健饮料的研制 荞麦中手性肌醇的提取i 精确称取经预处理的养麦粉末2 5 0 0 9 ，加入3 0 m l 的8 0 7 , 醇溶液中，2 5 。c 恒温 振荡浸提l h ，离心取上清液。离心后的沉淀再依次用2 5 m l ，1 5 m l 乙醇一水( 1 ：l ， 体积比) 浸提两次，离心，合并先后三次浸提离心后所得的上清液，抽滤后用0 4 5 u m 滤膜过滤，待用。 提取液中手性肌醇的薄层层析定性 将薄层板用剪刀剪成3 a m 5 c m 大小，并于1 0 5 。c 活化3 0 m i n 。取配制好的手性 肌醇标准品溶液和提取液分别点样。点样吹干后置于配制好的展开剂中进行薄层展 开，待展开剂前沿距板边缘1 c m 时停止展开，取出薄层板，自然晾干后浸入盛有显色 剂的溶器中进行显色。( 显色剂为高碘酸钠、联苯胺溶液) 2 2 结果与分析 2 2 1 点样量的确定 从左至右标样分别为葡萄糖、麦芽糖、木糖醇、手性肌醇( 浓度均为o4 0 ) 从上到下点样量为20 、1 0 、0 8 、0 4 02 、0 1u 1 圈互不同点样显色结果 f i 窖2r e s u l to f d i f f e r e n t v o l u m no f s a m p l e 将葡萄糖、麦芽糖、术藉醇、手性肌醇各标样分剐点在薄层板上( 浓度o 4 ) ，点样量分剐 为o 1 u l ，0 2 u l ，0 4 u 1 ，0 8 u i ，1 o u l ，2 o u l ，用显色剂显色后，经凝胶成像系统拍照结果如图2 所示，从显 色后备样品的斑点的大小及清晰度等方面综合考虑，确定点样量为l u l 吉林农业大学硕士学位论文不同生长期荞麦中降糖固子含量的剥定及保健饮料的研制 2 2 2 展开剂的确定 将点有标样的薄层板放入盛有不同展开剂的层析缸中，进行上行展开。用显色 荆显色后测定其r ，值，并取其平均值。结果见表2 ：从表2 可以判断展开剂2 、3 和 展开剂5 对四种物质的分离效果比较好，特别是展开剂3 的r f 值符合正常值的范围， 而且麦芽糖和手性肌醇的r f 差值更大，分离度较好。因此，确定展开剂3 作为本试 验的展开剂。 囊2 不同晨开剂对融值的影响 t a b l e 2 e f f e c t o f d i f f e r e m ts p r e a d i n ga g e n t t or f 展开刺1 ：正丁醇：冰醋酸：水= 4 ：l ：g 2 ：正j 醇：冰醋酸：水= 4 li ：i9 3 ：正丁醇：冰醋酸：水= 4 ：l ：l ；正丁群：球醋酸：j k - 4 ：2 ：4 5 ：正 酵：诛醋酸：承= 3 ：】：】 6 ；正丁醇；冰醋酸：术：吡啶：4 ：l ：5 ： 7 ：币丁醇：冰醋酸：水：吡啶= 4 ：l ：l ： 吉林农业大学硕士学位论文不同生长期荞麦中降糖因子台量的测定及保健饮料的研制 2 2 3 展开次数的确定 薄层层析的展开方法有多种，本研究采用上行展开法进行展开。为确定最佳展 开次数进行了1 次展开和2 次展开试验，展开剂为正丁醇：冰醋酸：水= 4 ：1 ：l 。试 验结果见表3 ：。 表3 不同展开次数对r f 值的影响 t a b l e 3 e f t e c to fs p r e a d i n g t i m e s t o r t 由表3 可以看出：1 次展开的手性肌醇与葡萄糖、麦芽糖的r f 值之差较大，而与 木糖醇的r ，值之差为0 0 1 7 ；2 次展开的手性规醇与葡萄糖、木糖醇的r f 值之差较大， 而与麦芽糖的r f 值之差为0 0 2 0 ，并没有使各样品问的r ，值之差明显增大；而2 次展 开所花费的时间却增加为原来的1 8 倍。综合考虑后确定采用1 次展开。 2 2 4 提取液中手性肌醇的定性 将手性肌醇提取液与手性肌醇、麦芽糖、葡萄糖、木糖醇标样( 浓度均为0 4 ) 在上述已确定的条件下进行薄层层析试验。经凝胶成像系统成像后结果见图3 。从图 可以看出：在此条件下提取液中的手性肌醇与其他物质分离度好，因此提取液中的手 性肌醇完全可以通过本试验采用的薄层层析方法加以定性。 从左至右点样样品依次为：手性肌醇，麦芽糖、葡萄糖术糖醇、提取渡 啊3 攫取液薄层层斩结粜 f i g 3 t l cr e s u l t o f e x t r a c t i o n 9 吉林农业大学硕士学位论文不同生长期荞麦中降糖因子含量的剥定及保健饮料的研制 2 3 讨论 手性肌醇的定性检测还可以采用气相色谱、液相色谱和气相色谱一质谱联用等方 法。一般上述方法中检测仪器和试剂昂贵、条件严格、检测费用较高。本章建立了手 性肌醇薄层层析的定性检测方法。本检测方法操作容易、方法简便、经济实用，可以 简便快捷的对样品进行手性肌醇的定性检测。采用薄层层析方法定性检测荞麦中手性 肌醇薄层板展开的最佳条件为：点样量为l u l ；展开剂为：正丁醇：冰醋酸：水= 4 ： l ：1 ；显色剂为高碘酸钠、联苯胺溶液；展开次数为1 次。 为节约时间、提高效率和较为准确的定性本研究采用预制板进行了薄层展开。预 制板的固定相是硅胶，在使用之前必须活化。常温保存的预制板硅胶能吸附环境中的 水分而降低吸附力，高温活化可以去除在空气中吸收的水分，增加硅醇基的数量，其 表面的硅醇基越多，吸附力越强，从而增加薄板的活性。本研究的预制板活化条件采 用1 0 5 下3 0m i n ，此时硅胶的含水量达到3 6 ，其活性达到要求，分离效果较好。 据报道：活性成分d c i 在苦养麦籽粒中的麸皮和外层粉中含量较多，而心粉中含 量较低。而本研究采用的养麦籽粒属于甜莽，其不同部位的手性肌醇含量有毖要迸一 步加以确定，以利于合理开发利用本地养麦资源。在本研究确定的手性肌醇定性检测 方法中，样品展开后进行显色，薄层板整体显蓝色，样品处显白色，但薄层板干燥后 略有褪色，不利于薄层扫描加以定量，因此有必要迸一步研究其显色方法以便于手性 肌醇的薄层扫描定量。 吉林农业大学硕士学位论文 不同生长期荞麦中降糖因子含量的测定及保健饮料的研制 第三章不同生长期盘播荞麦中的手性肌醇和总黄酮含量变化 的研究 本章以盘播方法进行荞麦苗的培育，然后取不同生长期的莽麦苗，经适当的预处 理后检测其中手性肌醇和总黄酮的含量，以确定二者最高含量期。总黄酮的定量采用 分光光度法；目前，手性肌醇的定量方法主要有气帽色谱法和高效液相色谱法，本章 将采用高效液相色谱法( h p l c ) 检测不同生长期荞麦中的手性肌醇含量，分析并确定手 性肌醇的最高含量期，为进一步对荞麦资源的合理开发利用提供理论依据。 3 1 材料与方法 3 1 i 材料 荞麦种子：产自吉林省双辽市 珍珠岩：购自长春市石材城 手性肌醇标准品：购自s i g m a - a l d r i c h 公司，纯度9 5 。 芦丁标准品：购自上海化学试剂公司，纯度9 5 试剂：麦芽糖、木糖醇、山梨醇、9 5 乙醇、正丁醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧 化钠，石油醚( 沸点3 0 6 0 ) 以上试剂均为分析纯级，乙腈为色谱纯级、水为去 离子水 3 1 2 方法 荞麦苗培育方法 ( 1 ) 设备和装置 微型植物粉碎机：f z l 0 2 型，天津市泰斯特仪器有限公司 分光光度计：7 2 2 型，山东高密分析仪器厂 电热鼓风干燥箱：1 0 1 a 一2 型，上海实验仪器厂 水浴振荡器：d s h z 3 0 0 型，江苏太仓试验设备厂 升降小太阳取暖器：n s b k b 0 2 ，上海步天电器有限公司 精密电子天平：j j 5 0 0 0 ，常熟双杰测试仪器厂 恒温水浴锅：d s y - 2 4 孔，北京国华医疗器械厂 吉林农业大学硕士学位论文不同生长期荞麦中阵糖因子含量的测定及保健饮料的研制 分析电子天平：a l c 一11 0 4 ，北京赛多利斯仪器系统有限公司 离心机l g l o 一2 4 a 型，北京医用离心机厂 强酸性苯乙烯阳离子交换树脂( 0 0 1 7 ) 、强碱性苯乙烯阴离子交换树脂( 2 0 1 x 7 ) 购自南开大学化工厂 离子交换柱：巾l c m l o c m ( 自制) 塑料育苗盘( 8 0 c m x 2 5 c m ，高5c m ) ，盘底平整，有摊水通气孔；木质的栽培架( 架 的长宽与育苗盘配套，层间距离5 0c m ) 栽培基质采用珍珠岩； ( 2 ) 种子选用及播种前处理选用当年新的荞麦种子，且发芽率在9 5 以上。播种前 提前晒种2 天，除去虫蛀、破残、畸形、腐霉，已发过芽的及特小、特瘪及成熟度不 够的种子，先用2 0 3 0 的洁净清水淘洗3 遍后于2 0 2 5 。c 温度下浸种3 6 h 。浸种 结束后，用清水冲洗3 遍，轻轻揉搓、冲洗，漂去附着在种皮上的粘液，捞出荞麦种 子并沥去多余水分。 ( 3 j 播种播种前须对苗盘和栽培基质消毒处理：苗盘用3 石灰水浸泡l 小时，再用 清水冲洗干净，珍珠岩用开水漂烫3 m i n 。准备工作结束后在苗盘底部平铺一层基质 纸，然后在纸上再铺厚约1 1 5 厘米经消毒处理的珍珠岩，刮平、轻轻压实，将经 过浸种的种子均匀地撒播到栽培基质上，播种量每盘用干种8 0 克。播种完毕后，将 苗盘置于栽培架上进行育苗。 媳) 培育管理每天进行1 次倒盘，调换苗盘上、下、前、后位置。均匀进行喷淋， 湿润度以苗盘内不存水为度。并保持室内空气相对湿度在8 5 左右，室温1 5 2 5 。 ( 5 ) 采样 出苗后，每天喷淋前采样一次，取莽麦苗茎高0 5 c m 为苗期的第l 天。至 荞麦苗出现霉烂时为生长最末期。在上述培育管理的条件下盘播养麦苗的生长期为 3 6 天。每天选取长势均匀的萤除去荞麦皮壳并紧贴根部剪割，于6 0 。c 6 h 烘干备用。 盘剥荞麦中手性肌醇含量测定的预处理! = 取不同生长期的荞麦苗经6 0 。c 烘干6 h 充分干燥后，用台式植物粉碎机将其粉碎 成粉末状。精确称取养麦苗粉末1 0 0 0 9 ，加入3 0 m l 的8 0 z , 醇溶液中，2 5 。c 恒温振 荡浸提l h ，取上清液。离心后的沉淀再依次用2 5 m l ，1 5 m l 乙醇一水( 1 ：1 ，体积比) 浸提两次。离心，合并先后三次提取离心后所得的上清液，抽滤后用0 4 s u m 滤膜过 滤。将滤液置于蒸发皿中放在1 0 0 。c 水浴锅上蒸千，蒸干后再加入8 m l 蒸馏水溶解， 并使之通过装有强碱、强酸离子交换树脂的混合玻璃填充柱( 阴阳离子树脂的比例为 4 ：1 ) ，取中间部分的流出液检测。 1 2 吉林农业大学硕士学位论文 不同生长期养麦中降糖因子含量的羽l 定及保健饮料的研制 总黄酮标准曲线的制备 本章定量总黄酮以芦丁为标准品。准确称取经干燥至恒重的芦丁标准品l o o m g ， 置于1 0 0 m l 容量瓶中，加9 5 乙醇溶解定容至刻度，摇匀，得u 浓度为0 1 m g m l 的芦 丁标准溶液。分别精确取上述芦丁标准溶液0 0m l 、1 o m l 、2 o m l 、3 o m l 、4 o m l 、 5 0m e , 6 o m l 、7 0m l 、8 o m l 于9 支2 5 m l 容量瓶中，各加入5 n a n o ：溶液l m l ， 摇匀后反应6 m i n ，加入i m l 的1 0 a 1 ( n o 。) 。溶液，摇匀后反应6 m i n ，再加入1 0 m l 的 4 n a o h 溶液，然后用9 5 乙醇溶液定容至刻度，放置1 5 m i n ，以o 号为空白对照，充 分反应后分别于5 1 0 n m 处测定吸光值，绘出标准曲线，求出回归方程。 分光光度法定量检测总黄酮” 称取经干燥的荞麦苗粉碎样品1 0 0 0 9 ，用脱脂滤纸包好置于索氏提取器中，加 入石油醚8 0t n l ，进行加热回流提取至提取器中石油醚无色，关掉电源室温冷却后，弃 去石油醚液。取出荞麦苗干粉样品待干燥后装入磨口三角瓶中，加入8 0m 1 的7 0 乙 醇溶液，再加热回流提取6 h ，取提取液经抽滤后加热至浆状以除去其中的乙醇，再 将浆状液用7 0 乙醇溶液定容至1 0 0m l 的容量瓶中备用，取上述经定容的溶液5 m l 置于2 5 m l 容量瓶中，加入5 n a n o 。溶液l m l ，摇匀后反应6 m i n ，加入l o a 1 ( n 0 3 ) 。溶 液1 m l ，摇匀后反应6 m in ，再加入4 n a o h 溶液1 0i i l l ，再用7 0 乙醇溶液定容至刻度， 放置1 5 m i n ，充分反应后于5 1 0 n m 处测定吸光值，以不含芦丁标准品的体系为参比液。 根据标准曲线的回归方程计算进而得出莽麦苗样品中总黄酮的含量。 h p l c 方法定量检测手性肌醇 采用岛津l c 一1 0 a v p 型高效液相色谱仪，示差检测器( r i d ) w a t e r s ( m a d e i 1 1 i r e l a n d ) ，c a r b o h y d r a t eh n a l y s i s 柱( 3 9 r m n i d x 3 0 0 h m ) ：柱温2 5 ：体积分数为 8 5 的乙腈溶液为洗脱液，流速1 8 m l m i n ：进样量2 0 u l ；用峰面积外标法定量。标准品 芦丁、山梨醇、手性肌醇、木糖醇和蔗糖浓度均为0 4 的水溶液，混合标准品为以 上五种标准品各2 0 0 u l 均匀混合物。手性肌醇含量的计算方法：c # c 镕= s # s 镕， c # g # 】0 0 = c 。( c * 一混合标样中手性肌醇的浓度；c # 一样品中手性肌醇的 浓度；s # 一h p l c 法测定的样品中手性肌醇的峰面积；s # 一h p l c 法测定