栽培大豆非生物胁迫诱导的蛋白激酶基因GmGSK的克隆及功能分析_硕士学位论文.pdf

摘要 高盐、干旱、低温等非生物胁迫是影响作物产量的重要环境因素。植物通过 长期进化逐渐形成特定的机制来抵御外界环境造成的胁迫，减轻对自身的伤害。 其中蛋白激酶可通过对底物可逆的磷酸化来参与胁迫信号的传导，从而进一步调 节外界胁迫对作物造成的伤害。因此，蛋白激酶在植物的抗逆途径中起到了非常 重要的作用。 我们以小麦的T a G S K l 基因序列为探针，通过电子克隆在栽培大豆中得到一 条类似糖原合成酶激酶的c D N A 序列，并通过R T - P C R 的方法将其克隆。序列分 析表明，此c D N A 包含一条1 2 3 0 b p 的完整开放阅读框，编码4 1 0 个氨基酸，估 计的分子量为4 6 5 k D ，等电点P I 为8 6 4 。蛋白序列分析表明，其编码一个与G S K 3 同源的蛋白，含有丝氨酸苏氨酸蛋白激酶活性位点，命名为G m G ( G e n b a n k 登录号：F J 4 6 0 2 2 8 ) 。 S o u t l l e m 杂交表明，G m G S K 基因在栽培大豆基因组中至少有两个拷贝。 N o , h e m 杂交显示，在栽培大豆的根、茎、叶、叶柄及子叶中均能表达锄G 踊， 但不同的组织器官中G m G S K 基因的表达量不同，在根中分布较多。半定量 R T - P C R 分析结果显示，G m G S K 基因的表达可以被N a C l 、N a H C 0 3 、干旱、A B A 和低温所诱导，这表明G m G 豚可能参与了大豆非生物胁迫的信号传导过程或对 非生物胁迫的耐受。 利用p C A M B I A l 3 0 2 构建G m G S K ：G F P 融合载体，通过农杆菌渗入法在烟 草中叶片细胞中瞬时表达G m G S K ：G F P 融合蛋白。对G m G S K 进行亚细胞定位 发现，其分布在细胞膜与细胞质中。为了进一步研究其功能我们分别将其转入大 肠杆菌( B L 2 1 ) 和酿酒酵母( I N V S c l ) 中，原核表达显示其蛋白大小确为4 6 5 k D 左右；在转G m G S K 基因的酿酒酵母中，其对N a c l 、N a H C 0 3 和干旱等非生物胁 迫的耐受能力明显强于非转基因酿酒酵母。 最后，通过构建p C A M B I A 3 3 0 0 G m G S K 植物双元表达载体，将G m G S K 转 入烟草，过量表达G m G S K 基因，验证其在植物中的生物学功能。结果表明，在 高盐胁迫下转基因植株的生长状态、相对生物量、根系发达程度与对照相比均得 到了明显的提高。对转基因烟草和非转基因烟草植株共同浇灌适当浓度N a C l ， 结果显示转基因烟草能明显提高对高盐的耐受性，而非转基因烟草则在不久后死 亡。对其生理指标进行测定显示，在盐胁迫下转基因烟草的可溶性糖含量增长幅 度明显快于非转基因对照，而外渗相对电导率增长速率则明显慢于非转基因对 照，这些有助于提高转基因烟草的耐盐性。 以上结果表明，栽培大豆G m G S K 基因在生物抵御外界非生物胁迫过程中有 重要作用，过量表达G m G S K 基因，能显著提高生物的抗逆性，这也为将来利用 耐盐基因改善栽培大豆耐盐性方面，提供了一条新途径。 关键词：非生物胁迫；糖原合成酶激酶；栽培大豆；亚细胞定位；酿酒酵母； 转基因烟草 I l A b s t r a c t H i 曲s a l t ，d r o u g h t ，l o wt e m p e r a t u r ea n do t h e ra b i o t i cs t r e s s e sa r ei m p o r t a n t e n v i r o n m e n t a lf a c t o r st oa f f e c tc r o py i e l d P l a n t sr e d u c et h e i ro w n d a m a g et h r o u g h l o n g - t e r me v o l u t i o nt or e s i s tt h ee x t e r n a le n v i r o n m e n ts t r e s sr e s i s t a n c e P r o t e i nk i n a s e m a yb er e v e r s i b l et h r o u g ht h ep h o s p h o r y l a t i o nt op a r t i c i p a t e i ns t r e s ss i g n a l t r a n s d u c t i o n ，t h e r e b yf u r t h e rr e s p o n dt oe x t e m a ls t r e s s e so np l a n t s P r o t e i nk i n a s e p l a y e dav e r yi m p o r t a n tr o l ei nt h es t r e s s - t o l e r a n tp a t h w a yi np l a n t s W eu s e dw h e a tT a G S K lg e n es e q u e n c ea saq u e r y Af u l l l e n g t he D N Ao ft h e G S K 3 l i k e g e n ew a so b t a i n e db yi ns i l i c oc l o n i n gf r o mS o y b e a nd a t a b a s eo f G e n B a n ka n dw a sf u r t h e ri s o l a t e df r o mGm a xb yR T - P C R T h ec o m p l e t ee D N A o p e nr e a d i n gf r a m es e q u e n c ei s 12 3 0b pi nl e n g t ha n de n c o d e d410a m i n oa c i d r e s i d u e sw i t hat h e o r e t i c a lm o l e c u l a rw e i g h to f4 6 5k Da n da l li s o e l e c t r i cp o i n to f 8 6 4 P r o t e i ns e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a ti te n c o d e dap r o t e i nh o m o l o g o u sw i t h G S K , c o n t a i n i n gs e r i n e t h r e o n i n ep r o t e i nk i n a s ea c t i v es i t e 。n a m e dG m G s K ( G e n b a n k A c c e s sn u m b e r ：F J 4 6 0 2 2 8 ) S o u t h e r nb l o ta n a l y s i sr e v e a l e dt h a ti th a da tl e a s tt w oc o p i e si nGm a xg e n o m e N o r t h e r nb l o ta n a l y s i si n d i c a t e dt h a tG m G S K e x p r e s s e di na l l t e s t e dt i s s u e s ，w i t h h i g h e s te x p r e s s i o ni nr o o t S e m i - q u a n t i t a t i v eR T - P C Ra n a l y s i sr e v e a l e dt h a tG m G S K g e n ec o u l db ei n d u c e db yN a C l ，N a H C 0 3 ，d r o u g h t ，A B Aa n dc o l d ，w h i c hs u g g e s t e d t h a tG m G S Km i g h tb ei n v o l v e di ns o y b e a na b i o t i cs t r e s ss i g n a lt r a n s d u c t i o np r o c e s s o rt o l e r a n c et oa b i o t i cs t r e s s W eu s e dp C A M B I A l3 0 2t oc o n s t r u c tG m G S K ：G F Pv e c t o ra n dG m G S K ：G F P f u s i o np r o t e i nW a si n t r o d u c e di n t ot o b a c c ob yA g r o i n f i l t r a t i o n T h es u b c e l l u l a r 1 0 c a l i z a t i o no fG m G S Ki n d i c a t e dt h a ti tw a sd i s t r i b u t e di nt h ee e l lm e m b r a n ea n d c y t o p l a s m i c G m G S Kw a st r a n s f o r m e di n t oE s c h e r i c h i ac o i l ( B L 21 ) a n ds u c c e s s f u l l y e x p r e s s e d w i t ha4 6 5 k Dd e t e c t e d A n d S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ( I N V S c l ) t r a n s f o r m e dw i t hG m G S Ki n c r e a s e dt h e i rt o l e r a n c eo b v i o u s l yt ON a C l N a H C 0 3a n d d r o u g h ts t r e s s e st h a nw i l dt y p e F i n a l l y , i no r d e rt o f u r t h e rv a l i d a t eG m G S Kb i o l o g i c a lf u n c t i o n si n p l a n t s a r e c o m b i n a n tv e c t o rp C A M B I A 3 3 0 0 一G m G s Kw a sc o n s t r u t e da n dt r a n s f e r r e di n t o t o b a c c of o ro v e r - e x p r e s s i o na n a l y s i s T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eg r o w t h r e l a t i v e b i o m a s sa n dr o o t i n gr a t eo ft r a n s g e n i ct o b a c c o sw e r es i g n i f i c a n t l yi m p r o v e dt h a nw i l d J t y p e T r a n s g e n i ct o b a c c ow a st r e a t e dw i t hN a C ls o l u t i o na n dr e s u l t ss h o w e dt h a t t r a n s g e n i ct o b a c c oc o u l di n c r e a s et h e i rs a l tt o l e r a n c es i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dw i t hw i l d t y p et o b a c c o P h y s i o l o g i c a la n a l y s i s s h o w e dt h a tt r a n s g e n i ct o b a c c oi n c r e a s et h e s o l u b l es u g a rc o n t e n ts i g n i f i c a n t l yf a s t e rt h a nw i l dt y p et o b a c c oa n de x t r a v a s a t i o n r e l a t i v ec o n d u c t i v i t yg r o w t hr a t eW a ss i g n i f i c a n t l ys l o w e rt h a nw i l dt y p et o b a c c o u n d e rs a l ts t r e s s ，w h i c hh e l pt h et r a n s g e n i ct o b a c c ot oi m p r o v es a l tt o l e r a n c e T h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a ts o y b e a nG m G S K g e n ep l a y e da ni m p o r t a n tr o l et o r e s i s ta b i o t i cs t r e s s O v e r - e x p r e s s e dG m G S Kg e n ec o u l ds i g n i f i c a n t l yi m p r o v et h es a l t t o l e r a n c eo fy e a s ta n dt o b a c c o ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tG m G S Kg e n ec o u l db ea p r o m i s i n gg e n ei ns t r e s st o l e r a n c ei m p r o v e m e n ti ns o y b c a na n do t h e rp l a n t si n t h e f u t u r e K e yw o r d s ：A b i o t i cs t r e s s ；G l y c o g e ns y n t h a s ek i n a s e ；S o y b e a n ；s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n ；S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ；T r a n s g e n i ct o b a c c o I V - f 目录 摘要I 英文摘要 目录V 引言1 1 植物蛋白激酶研究进展1 1 1 植物蛋白激酶1 1 2 植物蛋白激酶家族的分类1 1 3 植物蛋白激酶的结构2 1 4 植物蛋白激酶的生理功能3 1 5 研究展望6 2 糖原合成酶激酶( G S K - 3 ) 研究进展6 2 1G S K 一3 的类型6 2 2G S K - 3 的结构和生物特性7 2 3G S K - 3 的生物学功能8 2 4 研究展望1 1 3 立题依据及研究目标1 1 3 1 立题依据和背景1 1 3 2 研究目的和意义1 1 3 3 研究目标与内容1 2 材料与方法1 3 l 实验材料1 3 1 1 植物材料1 3 1 2 菌种与质粒1 3 1 3 主要分子生物学试剂1 3 1 4 缓冲液及主要试剂配制1 3 1 5 主要仪器1 6 2 实验方法1 6 2 1G m G S K 基因的克隆与鉴定1 6 2 2 删基因在栽培大豆中的表达2 2 2 3 锄饺跗的亚细胞定位2 5 2 4 大豆G m C , S K 基因在大肠杆菌中的表达2 6 2 5 大豆删基因在酿酒酵母中的表达2 8 V 2 6G m G S K 基因在烟草中的表达及其相关功能鉴定3 0 结果与分析3 4 1G m C , S K 基因的克隆与序列分析3 4 1 1G m G S K 基因的克隆3 4 1 2 测序及序列生物信息学分析3 6 2 删基因在栽培大豆中的表达分析4 0 2 1G m G S K 在大豆不同器官的表达4 0 2 2G m G S K 在不同胁迫条件下的表达4 0 3G m G S K 基因的亚细胞定位分析4 1 3 1 表达载体构建与验证4 1 3 2 渗入法表达融合蛋白4 3 3 3 激光共聚焦显微镜观察4 4 4 大豆C - m G S K 基因在大肠杆菌中的表达分析4 4 4 1 含G m G S K 基因的原核表达载体构建与验证4 4 4 2 蛋白质表达产物的获得和鉴定4 6 5 大豆删基因在酿酒酵母中的表达分析4 7 5 1 含G m G S K 基因的酿酒酵母表达载体构建与验证4 7 5 2p Y E S 2 一的酵母转化及鉴定4 8 6G m G S K 基因在烟草中的表达及其相关功能分析4 9 6 1 含G m G S K 基因的植物双元表达载体构建与验证4 9 6 2 转基因烟草的耐盐性鉴定5 4 讨论5 7 1 电子克隆技术的应用5 7 2G m G S K 基因的生物信息学分析5 7 3 删基因的特异性表达分析5 8 4 用农杆菌渗入法( A g r o i n f i l t r a t i o n ) 进行亚细胞定位5 8 5 删的转基因研究5 9 结论6 2 参考文献：6 3 附录7 2 致谢7 4 在学期间公开发表论文及著作情况7 5 V I 东北师范大学博士学位论文 1 植物蛋白激酶研究进展 己I吉 丁I 口 1 1 植物蛋白激酶 蛋白激酶是一类磷酸转移酶，真核生物蛋白激酶的作用是将A T P 的Y 磷酸 基团转移到底物特定的氨基酸残基上，使蛋白质磷酸化。蛋白激酶在信号转导中 主要作用有两个方面：其一是通过磷酸化调节蛋白质的活性，磷酸化和去磷酸化 是绝大多数信号通路组分可逆激活的共同机制，有些蛋白质在磷酸化后具有活 性，有些则在去磷酸化后具有活性；其二是通过蛋白质的逐级磷酸化，使信号逐 级放大，引起细胞反应H J 。 蛋白质磷酸化与去磷酸化过程，在细胞信号的转导过程中起到非常重要作 用，是自然界中的生物普遍存在的一种调节机制。科研工作者对于蛋白激酶的研 究在动物和微生物中比较多且详细，但在植物中的研究还是在近十年才逐步发展 起来，但研究的进展很快。 目前已在很多植物中分离了蛋白激酶，如玉米圆、拟南芥【3 1 、豌豆【4 】、小麦【5 1 、 紫花苜蓿嘲、西红柿同、烟草嗍、大豆【9 1 和水稻【1 0 】等，这些蛋白激酶的磷酸化过 程被证实参与到许多信号，包括光、病原体的侵入、高盐、激素、干旱、营养匮 乏及低温分子应答等，一些植物的新陈代谢和酶的调节的活动，也存在可逆磷酸 化。 1 2 植物蛋白激酶家族的分类 近些年来，在植物中已经发现了很多的蛋白激酶相关基因，人们根据其底物 蛋白被磷酸化的氨基酸残基种类，可将它们分为五类： 第一类：丝氨酸苏氨酸蛋白激酶：丝氨酸苏氨酸的羟基被磷酸化；第二类： 酪氨酸蛋白激酶：酪氨酸的酚羟基被磷酸化；第三类：组氨酸赖氨酸精氨酸蛋 白激酶：蛋白质的组氨酸、赖氨酸或精氨酸的咪唑环，胍基，- 氨基被磷酸化； 第四类：半胱氨酸蛋白激酶：半胱氨酸的巯基被磷酸化；第五类：天冬氨酰基 谷氨酰基蛋白激酶：蛋白质的酰基被磷酸化【l 。目前已发现的植物蛋白激酶大多 是前三类。 1 9 9 5 年，H a n k s 和H u n t e r 通过对蛋白激酶催化域氨基酸序列的比较分析， 将植物蛋白激酶又分为五个组，这五个组分别为： 第一组( A G C 组) ：以环核苷酸家族成员P K A 、P K G 、P K C 家族及核糖体 5 6 激酶家族为代表；第二组( C a M K 组) ：包括C a 2 * C a M 依赖的蛋白激酶和需 S N F l A M P 活化的蛋白激酶为代表，该组蛋白激酶的基本都依赖第二信使；第三 东北师范大学博士学位论文 组( C M G C 组) ：包含C D K 、M A P K 、G S K - 3 、C K I I 家族等，该组激酶作用于 下游的磷酸化级联系统；第四组( 常规的P T K 组) ：此组主要是酪氨酸蛋白激酶， 这种蛋白激酶在高等动物中作用于T y r 残基的磷酸化，但目前在植物中发现的酪 氨酸蛋白激酶功能还不明确；第五组( 其它组) ：如类受体蛋白激酶R L K 和胞质 级联蛋白激酶M A P K K K 等I I 2 1 。 这种分类模式把蛋白激酶家族的成员按照相似的序列和功能进行分组，在目 前看来是有用的。此外，在以上分类基础上，根据有无信使依赖将蛋白激酶还分 为信使依赖的蛋白激酶和非信使依赖的蛋白激酶。 1 3 植物蛋白激酶的结构 植物蛋白激酶都有一个由2 5 0 3 0 0 个左右的氨基酸残基组成的催化区，根据 这些蛋白激酶催化区氨基酸序列同源性高低，可分为1 2 个亚区，而且有些亚区包 含一些不变或几乎不变的氨基酸残基【1 3 】。蛋白激酶的晶体结构测定表明，这些 保守残基在催化和保护蛋白激酶整体三维结构有着重要的作用【1 4 1 。 图卜1 蛋白激酶的三维结构图( 摘Z h a n gc ta 1 2 0 0 2 ) 【”1 F i g u r el - 1T h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f t h ec a t a l y t i cs u b u n i to f p r o t e i nk i n a s e 植物蛋白激酶除了具有同源性很高的催化区外，都还有一个调节区。没有活 性的蛋白激酶全酶是由催化亚基和调节亚基共同构成的四聚体结构，当调节因子 与调节区结合后，就把催化区给暴露或游离出来，用来磷酸化底物。另外，游离 的催化亚基还可以转移到细胞核中，用以介导某些基因的表达【1 6 1 。 2 - ， 一 ， 东北师范大学博士学位论文 1 4 植物蛋白激酶的生理功能 1 4 1 参与植物抗逆性 高盐、干旱和低温都会导致植物的水分失衡从而使得渗透势发生变化，进而 引起渗透性胁迫植物在感受这些非生物胁迫造成的渗透胁迫信号后，会通过一 系列信号传递过程，最后诱导某些在生理生化上有特定功能的基因进行表达对渗 透胁迫作出各种适应性反应。 1 9 9 4 年，U r a o 等从拟南芥中分离了c A T C D P K l 和c A T C D P K 2 ，N o r t h e m 杂交表 明在干旱和高盐胁迫下，这两个基因的m R N A 被迅速诱导表达。R P JS 【2 基因是一个 拟南芥的抗病基因，通过对它的序列进行分析表明，它是一个含有一系列 A T P G T P 结合位点的蛋白激酶【l 7 1 。1 9 9 6 年，S h e e n 等在玉米中利用报告基因和效 应基因共表达的方法，发现玉米的C D P K l 基因，能激活被高盐和干旱胁迫诱导 的启动子，然而敲掉C D P K l 激酶区的突变体对胁迫则没有反应【l8 1 。同年， P e s t e n a a c z 等发现玉米和高粱根中的a 臌因，经P E G 处理1 h 后，活性明显升高， 表明其可能与干旱胁迫有关【l 引。 1 9 9 7 年，H o n g 等对R P K l 的研究表明，剧_ 7 在植物的根茎叶和花中都能够表 达，干旱或高盐胁迫处理和低温处理均能使R P K l 的表达显著增强，因此认为 R P K ，激酶在干旱、高盐及低温引起的水分胁迫的感受和信号传递中起作用【2 0 1 。 同年，M i z o g u c h i 等在拟南芥中分离到彳Z 凇K 罗和A T M E K K l ，它们属于促分裂原 活化蛋白激酶( M A P ) ，对它们的研究表明，在干旱高盐或低温胁迫处理条件下 从5 m i n 起，能持续表达至U 2 4 h 后达到最大值【2 1 1 。 2 0 0 0 年，P a t h a r k a r 等从冰叶日中花中分离的M c C D P K l 基因是盐胁迫和干旱 诱导的【2 2 】。同年，S a i j o 等在水稻中分离了O s C D P K 7 基因，此基因受盐胁迫和低 温诱导【2 3 1 ，过量表达伪啾7 加速了盐和干旱胁迫，但不是冷胁迫应答基因的 诱导【2 4 1 。2 0 0 3 年，C h e o n g 等鉴定蛋白激酶基因A t C B L l 在拟南芥不同生育时期不 同组织中都有表达，受高盐、干旱、低温、A B A 和伤害强烈诱导，过量表J 这A t C B L l 引起干旱诱导基因表达上调，低温诱导基因表达受抑制，转A t C B L l 基因的拟南芥 植株耐旱性和耐盐性提高，耐寒性降低【25 | 。拟南芥蛋白激酶基因R P K l 是丝氨酸 苏氨酸类蛋白激酶，2 0 0 7 年，W a n g 等在玉米中克隆得到了Z m C B L 4 基因，在拟 南芥中过量表J 杏Z m C B L 4 基因，能明显提高转基因拟南芥的耐盐能力【2 6 】。 病害和机械损伤也是植物生长发育过程中经常遇到的外界伤害，随着人们对 植物抗病基因和伤害诱导基因的研究的深入，逐渐揭示了蛋白激酶与抗病基因和 伤害诱导基因之间有着密切的联系1 2 7 。 1 9 9 5 年，S e o 等从烟草中分离到的明嗍因是受伤害诱导的基因，机械损伤 能诱导W I P K 的快速表达，在转基因植株过表达W I P K , 发现W I P K 参与了茉莉酸 和水杨酸诱导的伤害信号传递途径【2 8 1 。另外，1 9 9 9 年，S e o 等发现，烟草愀 3 东北师范大学博士学位论文 还可被病原激发子激活，因此可能作为多种信号传递体起作用【2 9 1 。1 9 9 7 年，Z h a n g 等发现烟草悬浮培养细胞中的蛋白激酶S I P K 在水杨酸处理下能迅速诱导S I P K 催 化M B P 磷酸化的活性，5m i l l 内酶活性可达到峰值，4 5 m i n 后又恢复正制3 0 1 。 1 9 9 3 年，M a r t i n 等通过图位克隆，从番茄中克隆了一个蛋白激酶类抗病基因 P t o ，将砌基因的e D N A 克隆转化的番茄可以抵抗病原菌丁香假单孢菌的侵入【3 l 】。 1 9 9 5 年，S o n g 等克隆了一个S e r T h r 蛋白激酶，他是一个水稻抗白叶枯病基因， 与拟南芥菜中的受体蛋白激酶类似，蛋白质序列分析表明在其氨基端还含有L R R 区，L R R 区参与蛋白质相互作用，表明L R R 蛋白与X a 2 1 在植物抗病的信号传导过 程中相互作用【32 | 。1 9 9 7 年，F e u i l l e t 等克隆了一个编码胞外含有S 结构域的受体蛋 白激酶基因脚D ，它被鉴定为小麦抗叶锈病基因【3 3 】。2 0 0 2 年，B r u e g g e m a n 等在 大麦中分离了一个受体蛋白激酶基 R p g I ，它被鉴定为大麦抗禾柄锈菌基因【3 4 】。 2 0 0 6 年，R o b a t z e k 等鉴定了一个拟南芥含L R R 结构域的蛋白激酶基因F L S 2 ，研究 表明它在植物抗病和病原菌识别中起重要作用【3 5 】。2 0 0 7 年，S a s a b e 等从烟草中分 离的3 个凝集素样受体激酶N t l e c R K s ，N t l e c R K s 能被激发子诱导【3 6 1 。 1 4 2 调控植物生长发育 植物组织、器官的正常发育，对保持植物正常生理功能有着至关重要的作用。 植物蛋白激酶基因在植物体中具有调控植物器官正常生长发育的作用。例如， 1 9 9 1 年，S t e i n 等从烟草中克隆了一个可编码受体蛋白激酶的酃基因而孓豚基 因中S 位点多等位基因控制植物自交不亲和，表明其作用可能和烟草的花粉自交 不亲和性有判”J 。1 9 9 4 年，M u 等从矮牵牛中克隆出的P R K l 基因在花粉粒和生长 的花粉管中能特异性表达，又将反义P R K ，基因转入矮牵牛中，发现转基因植株半 数的花粉败育，这表明P R K l 保证花粉正常发育中有重要作用【3 8 】。 1 9 9 8 年，C a l d e r i n i 等研究发现，烟草的M A P 类蛋白激酶基因N T F 6 , 在分裂中 期被激活，在后期和末期活性最强，而N T F 6 的活性只在分生组织和幼嫩器官被检 测出来，而在细胞分裂过程中它们的蛋白质和m R N A 水平始终保持不变，这表 B f J N T F 6 可能在植物细胞有丝分裂中起某种调控作用【3 9 】。1 9 9 9 年，F r a t t i n i 等研究 发现水稻O s C D P K 2 和O s C D P K l l 在种子发育过程有着不同的表达模式， O s C D P K 2 在种子发育早期表达水平低，随后增加到高水平并保持到种子发育后 期，而O s C D P K l l 却在种子早期表达水平高，但从受精1 0 天后迅速降低【删。2 0 0 0 年，J i n n 等在拟南芥中克隆了一个质膜丝苏氨酸蛋白激酶基因H A E S A ，它在萼片、 花瓣、雄蕊的离区、花梗的底部和叶柄的底部都有表达，利用反义R N A 技术得 到的拟南芥H A E S A 突变体，表现出抗花器脱落的表型特性，证明它对控制花的脱 落有着重要作用1 4 。 2 0 0 0 年，A n i l 等通过对檀香树蛋白激酶基因S w C D P K ，W e s t e r n 杂交分析和蛋 白激酶生化分析发现S w 啾参与檀香树的胚胎发育、种子形成及萌发过程，并 4 - 厂 东北师范大学博士学位论文 具有时空特异性【4 2 】。2 0 0 1 年，L a l l y 等构建拟南芥蛋白激酶W A K s 家族成员黝尉 基因的反义突变体，发现转基因的突变体莲座叶较小，也比正常植株短，初生根 也较短，证明w A K 4 基因与细胞膨胀有判4 3 1 。2 0 0 5 年，D a v i d 等通过对拟南芥L R R s 受体蛋白激酶基因S U B 的研究发现，S U B 参与细胞的形态形成、分裂平面的定位 和细胞的增殖，推断拟南芥S U B 基因影响部分器官的形成和性状m 】。 1 4 3 参与激素信号传递 激素在植物的生长发育中起重要的调节作用，人们对已分离的一些植物蛋白 激酶研究发现，许多植物激素的信号如脱落酸、生长素、细胞分裂素和乙烯等转 导都有蛋白激酶的参与。 1 9 9 3 年，C h a n g 等和K i e b e r 等分别利用拟南芥抗乙烯突变体e t r 和组成型“三 重反应 突变体c t r 已分离出E T R l 、C T R l 两种与乙烯信号传递有关的蛋白激酶， 拟南芥E T R l 蛋白就是由信号感受器和调节器组成的同时具备信号感受和传递两 种功能的蛋白激酶，这种双组分系统可以在最短的时间内完成信号的接受和传导， 在植物对外界信号的快速反应中起作用【4 习；C T R l 功能的丧失导致拟南芥在无外 源乙烯存在下显现组成型“三重反应”，因此C T R l 在乙烯信号传递中起负调控作 用M 。 1 9 9 4 年，M i z o g u c h i 等用2 ，4 D 处理烟草B Y - 2 细胞，可激活M A P 激酶彳T M P K 2 和一种具有M B P 激酶活性的蛋白，说明M A P 激酶参与2 ，4 D 信号的传导【4 。1 9 9 5 年，A b o E L - S a a d 等发现，水稻原生质膜C D P K 口- - J 被赤霉素诱导【4 8 J 。1 9 9 8 年，K o v t u n 等发现植物N P K l ( M A P 张类激酶) 能抑制生长素诱导的基因G H 3 表达，N P K l 在生长素信号的传导过程中可能起负调控作用【4 刿。 2 0 0 1 年，W a n g 等鉴定了拟南芥的B R l l 是一个R L K s 类蛋白激酶，通过它的胞 外区感知油菜素类固醇( B R ) ，并通过胞内激酶信号进行下游信号转导【5 0 】。2 0 0 2 年，L i 等研究发现，扁豆保卫细胞中蛋白激酶剧脚以被A B A 诱导，A A P K 调 节气孔开张和阴离子通道，以雕的一个底物A A P K 2 相互作用蛋白( h r d P ) ，参与 A B A 转录后R N A 代谢的调节【5 l 】。2 0 0 2 年，S h a r m a 等报道，赤霉素能够提高水稻 僦基因的活性，赤霉素生物合成抑制剂则使之明显下降，而C D 尸：2 阿以促使 赤霉素的结合蛋白发生磷酸化【5 2 1 。同年，U l l a n t a 等发现细胞分裂素能提高黄瓜根 系C D P K 的转录水平，但对下胚轴无效，2 , 4 D 对根系和下胚轴C D P K 的转录均无 明显影响，这说明细胞分裂素在诱导a 燃录时具有明显的组织特异性【5 引。 2 0 0 2 年，M u s t i l l i 等在拟南芥中分离了蛋白激酶基因O S T l ，它是删胀的同源 基因，它可被A B A 激活，而且通过A B A 来调节气孔的开放，参与生成活性氧的上 游代谢过程【5 4 1 。2 0 0 5 年，Y u r i k o 等对R P K l 基因的鉴定发现，其参与拟南芥对脱 落酸( A B A ) 的早期识别，在发芽、生长和气孔关闭期间，R P K l 基因的抑制表达 将降低植物对脱落酸识别的敏感性【5 引。 5 东北9 币范大学博士学位论文 1 5 研究展望 植物蛋白激酶的研究虽然起步较晚，但随着越来越多植物蛋白激酶的发现， 蛋白激酶在植物细胞信号转导中的作用研究的也越来越深入，这也为了解植物抗 逆性及生长发育等的机理提供了新的手段。目前，研究人员已经从植物中克隆了 大量的蛋白激酶基因，但人们对大多数植物蛋白激酶的功能研究的还不够深入， 比如蛋白激酶的生化活性控制、基因表达的调节机制、不同蛋白激酶的互相作用 等，仍需要我们进一步的研究。 2 糖原合成酶激酶( G S K - 3 ) 研究进展 2 1G S K - 3 的类型 糖原合成酶激酶( G S K - 3 ) 是一种丝氨酸苏氨酸类蛋白激酶 5 6 1 ，G S K - 3 在 所有真核生物中都有分布。在哺乳动物体内发现有两种亚型存在，即G S K 30 【和 G S K 3 p 参与糖原代谢调控【5 7 1 、稳定细胞骨架5 明和许多相关的癌变过程 5 9 1 。在酿 酒酵母中的G S K 3 同源基因M C K l 和M D S l 发挥染色体分离作用【6 0 , 6 1 】，在裂殖酵母 中G S K - 3 同源基因S k p l 起着调节胞质的作用【6 2 】。和在哺乳动物中只有两类G S K 基因不同，在植物中G S K 3 是一个多基因家族【6 3 】。2 0 0 6 年，Y o o 等对1 0 个拟南芥 和9 个水稻的G S K 3 蛋白激酶进行了第一次广泛的植物G S K - 3 基因家族的系统发 育分析，将其分为四个主要分支1 6 4 ，如图2 1 所示。 图2 - 11 0 个拟南芥和9 个水稻矗孵雩趋激酶基因的基因分类( 摘Y o oe ta 1 2 0 0 6 ) F i g 2 1G e n e s t r u c t u r eo ft e n A r a b i d o p s i sa n dn i n er i c eG S K - 3l i k ek i n a s eg e n e s 6 - 气 二二 I 【 二三三i L = 卺0 1 薯量o = 一 f；L I毫置。 东北师范大学博士学位论文 2 2G S K - 3 的结构和生物特性 G S K - 3 拥有一个较小的N 端区域和一个较大的C 端区域，N 端区域由一个Q 螺 旋和7 个反平行的B 折叠构成，这7 个B 折叠形成一个桶状结构，C 端区域主要由仅 螺旋构成【6 5 1 。用G S K 3 的底物需要经过另一个酶的预磷酸化，才能与G S K - 3 发生 作用，大多数G S K - 3 底物共有的序列为：S e r T h r - X XXS e r T h r - P ，其中前一个 S e r 厂r h r 是磷酸化的目标残基，X 表示任何氨基酸，后一个的S e r n 小P 表示预磷酸 化位剧6 6 1 。 G S K - 3 类蛋白激酶的活性中心是一个T - l o o p 结构，由于G S K - 3 的T - l o o p 结构缺 少了一个磷酸化的苏氨酸残基，于是由底物预磷酸化的苏氨酸丝氨酸来代替，哺 乳动物G S K 3 的T - 1 0 0 p 的关键位点分别是G s K - 3 仅的T 妒7 9 和G s K - 3 B 的T 妒1 6 ；由 A r 9 9 6 、A r 9 1 8 0 和L y s 2 0 5 三个带正电的氨基酸组成的口袋结构( 底物结合位点) 【6 7 1 。 A T P 结合E l 袋位于N 端和c 端的结合部，A T P 结合口袋中含有两个M l ；2 + ，底物结合 口袋与A T P 结合口袋相邻，同样位于N 端和C 端的结合部，在进行底物磷酸化反应 时，A T P 和底物分别结合到G S K - 3 上相应的结合口袋中，在G S K 3 的催化下，A T P 的Y 磷酸根被转移到底物的丝氨酸或苏氨酸上【6 8 】，如图2 2 所示。 一o ”、蠹H 田v o 争 东北师范大学博士学位论文 2 3G S K - 3 的生物学功能 糖原合成酶激酶( G S K 3 ) 是一种丝氨酸苏氨酸类蛋白激酬7 1 】，1 9 8 0 年， E m b i 等在研究兔子骨骼肌时发现了G S K - 3 类蛋白激酶【_ 7 2 】，在动物中G S K - 3 已经研 究了将近3 0 年，并证实G S K 3 至少在三条细胞通路上有作用：W n t w i n g l e s s ， P 1 3 - 妯郴e 以及H e d g e h o g 信号通路，该酶的作用主要包括调节糖原的合成代谢， 参与细胞的分化与增殖，胰岛素调节等【7 3 1 。 G S K - 3 类蛋白激酶在植物中开始被重视，还是最近十几年的事。1 9 9 3 年P a y 等在紫花苜蓿中分离了一个G S K - 3 同源基因，并发现它在紫花苜蓿的不同器官和 发育阶段有着不同的表达模式，这是在植物中首次发现G S K - 3 家族成员【7 4 】。随着 分子生物学的发展，在植物中已经有许多G S K 3 同源基因已经被分离鉴定出来 7 5 - s 0 。遗传与生化分析表明，在植物中G S K - 3 是一个多基因家族，而且涉及多个 功能，例j t I N a C l 胁迫、器官发育、信号传导和伤害应答掣8 1 】。 2 3 1G S K 一3 参与非生物胁迫应答 许多实验表明，植物G S K 3 类蛋白激酶有的参与植物的非生物胁迫应答反应 通路的信号传导。例如，1 9 9 9 年，P i a o 等分离了拟南芥G S K - 3 类蛋白激酶A t G S K l ， 彳f G J 可以互补盐敏感型酵母钙调磷酸酶突变体，使其对高N a C I 具有耐受力； 为了进一步研究t A t G S K l 在酵母中的功能，P i a o 等构建了一个突变掉酵母G S K - 3 类 蛋白激酶基因M C K l 的突变体，发现突变体表现出了对盐胁迫的不耐受，用 A t G S K l 互补此