PDCD5研究思路.ppt

1,PDCD5的发现和功能研究北京大学医学部马大龙,2,前言,“Lifecannotexistwithoutdeath”；每个人每天有5千万到7千万个细胞死亡。细胞凋亡（Apoptosis）是程序化细胞死亡（Programmedcelldeath,PCD）的一种形式，在细胞分化、增殖、生长和疾病中起着重要的作用。如果机体缺乏凋亡，一个80岁的老人将有2吨重的骨髓和淋巴节，16公里长的肠道（Nature,412:23,2019）.,3,凋亡缺陷导致的疾病：肿瘤、SLE、多发性硬化症、糖尿病、类风湿关节炎等凋亡过强导致的疾病：AIDS、中风、神经退行性疾病、脊髓损伤等,4,提出思路,克隆化新的凋亡调控基因，将有助于阐明凋亡机理，为凋亡异常疾病防治提供基础。细胞凋亡过程中，将有一些基因表达改变，特别是上调表达基因，可能发挥重要的凋亡调节作用。,5,2019年,利用cDNA-RDA（RepresentativeDifferencesAnalysis）技术,本室从诱导凋亡的TF-1细胞克隆了凋亡上调表达的人类新基因,命名为TFAR19(TF-1apoptosisrelatedgene),2019年国际基因命名委员会命名为PDCD5(ProgramCellDeath5),6,RDA技术路线图,7,正常培养的TF-1细胞(Driver),进入凋亡的TF-1细胞(Tester),三轮cDNA-RDA,DNA测序和基因库检索,用SlotBlots和NorthernBlots检测表达的差异,RACE方法克隆PDCD5的全长序列,PDCD5在E.coli中的表达、纯化,PDCD5真核表达载体的构建,PDCD5的胞内定位,抗体制备和免疫检测,PDCD5蛋白质的活性研究,PDCD5转染的活性研究,PDCD5在组织和细胞中表达检测,8,ResultofNorthernblotsofPDCD5/TFAR19,LeftisRNAfromnormal-culturedTF-1cellRightisRNAfromTF-1cellundergoingapoptosis,9,SequenceofPDCD5cDNA,CTGCTCCAGCGCTGACGCCGAGCCATGGCGGACGAGGAGCTTGAGGCGCTGAGGAGACAGAGGCTGGCCGAGCTGCAGGCCAAACACGGG90METAlaAspGluGluLeuGluAlaLeuArgArgGlnArgLeuAlaGluLeuGlnAlaLysHisGlyGATCCTGGTGATGCGGCCCAACAGGAAGCAAAGCACAGGGAAGCAGAAATGAGAAACAGTATCTTAGCCCAAGTTCTGGATCAGTCGGCC180AspProGlyAspAlaAlaGlnGlnGluAlaLysHisArgGluAlaGluMETArgAsnSerIleLeuAlaGlnValLeuAspGlnSerAlaCGGGCCAGGTTAAGTAACTTAGCACTTGTAAAGCCTGAAAAAACTAAAGCAGTAGAGAATTACCTTATACAGATGGCAAGATATGGACAA270ArgAlaArgLeuSerAsnLeuAlaLeuValLysProGluLysThrLysAlaValGluAsnTyrLeuIleGlnMETAlaArgTyrGlyGlnCTAAGTGAGAAGGTATCAGAACAAGGTTTAATAGAAATCCTTAAAAAAGTAAGCCAACAAACAGAAAAGACAACAACAGTGAAATTCAAC360LeuSerGluLysValSerGluGlnGlyLeuIleGluIleLeuLysLysValSerGlnGlnThrGluLysThrThrThrValLysPheAsnAGAAGAAAAGTAATGGACTCTGATGAAGATGACGATTATTGAACTACAAGTGCTCACAGACTAGAACTTAACGGAACAAGTCTAGGACAG450ArgArgLysValMETAspSerAspGluAspAspAspTyrStopAAGTTAAGATCTGATTATTTACTTTGTTTATTGTCTATAGCCTTTTAAAAAAATAAACTTGTTATGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA540AAAAAAAAAAAAAAAAAA,PDCD5编码蛋白结构比较简单,全长125个氨基酸，不含二硫键，pI5.65;无信号肽，无跨膜序列，与已知人类蛋白无同源性;S118可以被CK2磷酸化,10,PDCD5基因结构图,（染色体19q12-q13.1）,cDNA,867bp,2718bp,804bp,950bp,323bp,Exon1(90bp),ATG,TGA,Exon2(38bp),Exon3(62bp),Exon4(92bp),Exon5(72bp),Exon6(167bp),基因组DNA,558bp，编码125个氨基酸,11,PDCD5蛋白在不同种属中序列高度保守,12,PDCD53-Dmodeling,（根据1EIJ模建）,13,如何开展基因功能研究,1。构建真核表达质粒，转染细胞，通过基因过表达（Overexpression）研究基因功能。2。构建绿色荧光蛋白表达质粒，观察细胞定位。3。表达重组蛋白，观察其对细胞的影响。,14,pGEM-TTFAR19,EcoRI,EcoRI,LacZ,fiori,ori,TFAR19,AmpR,EcoRI,T4Ligase,ConstructionofpcDITFAR19,15,PDCD5过表达促进HeLa和MGC-803细胞撤除血清诱导的凋亡,16,DetectionofapoptoticcellsofstabletransfectantsofHeLacellinducedbywithdrawalofserumusingAnnexinV,pcDI,pcDITFAR19(+),pcDITFAR19(-),(488nm,X400),17,PDCD5对各种细胞具有促凋亡效应,但不能诱导凋亡,18,SV40polyA,pEGFP-C3,CMVIE,NeoR,EGFP,EcoRI,SalI,AmpR,SmaI,BamHl,SV40polyA,pEGFPC3PDCD5,CMVIE,NeoR,EGFP,BamHI,TFAR19,AmpR,SmaI,BamHl,SmaI,MCS,Tfar19PCRProduct,BamHI,SmaI,XhoI,XhoI,Klenow,SalI,EcoRI,Klenow,T4Ligase,ConstructionofexpressionvectorofpEGFPC3-TFAR19,19,CellularlocalizationofPDCD5innucleus,GreenFluoresceinProteinstaining(488nm),DAPIstaining(DAPIwavelength),20,NucleartranslocationofPDCD5inHelacellstreatedwithVP16,0hour30min,2hours8hours,21,NuclearTranslocationofPDCD5inTF-1CellsAfterGM-CSFdeprivation.,A:CellswerestainedwithFITC-labeled3A3antibodyatdifferenttimepoints,andobservedusingCLSM.B:CellswereculturedinGM-CSF-freemediumfor16h,thenstainedwithFITC-3A3andDAPI.NuclearaccumulationofPDCD5andcondensednucleiwereobviouslyobserved.,YingyuChenetal:FEBSLetter，2019，509:191,22,pL,pMTY-4,AmpR,XhoI,StuI,ThrombinLinker,MS2,EcoRI,PstI,PDCD5ORFPCRProduct(410bp),pL,pMTY-TFAR19,AmpR,XhoI,ThrombinLinker,MS2,EcoRI,PstI,TRAF19,SmaI,BglI,XhoI,XhoI,StuI,Klenow,XhoI,T4Ligase,ConstructionofE.coliexpressionvectorofpMTY4-TFAR19,23,ExpressionandpurificationofPDCD5inE.coli,M.proteinmarkerfromPromega1.uninducedwholebacteria2.inducedwholebacteria3.cutafterthrombin4.purifiedPDCD5protein,24,WesternBlotstodetectexpressionofPDCD5proteininnormal-culturedTF-1cellsandapoptoticTF-1cells,LeftisproteinfromapoptoticTF-1cellsRightisproteinfromnormally-culturedTF-1cells,25,PurifiedproteinofPDCD5couldpromotetheapoptosisofTF-1cellsinducedbycytokinewithdrawal,26,重组蛋白PDCD5能够明显抑制IDR诱导的K562细胞的克隆形成数目,27,人PDCD5蛋白的穿膜效应研究（JBC，2019，281:24803）,本实验室证明人PDCD5蛋白可以通过clathrin非依赖的途径从细胞外携带生物大分子到细胞内，109-115氨基酸是其活性功能区。通过细胞膜的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparansulfateproteoglycan,HSPG)介导.PDCD5的穿膜效应提示其可以作为重组蛋白药物发挥促进肿瘤治疗效应,28,Exogenousp53N-PDCD5inducesapoptosis,29,如何封闭PDCD5的功能？,PDCD5单克隆抗体的细胞内导入PDCD5反义寡核苷酸PDCD5反义RNA表达质粒PDCD5RNA干扰,30,(Ruietal,LifeScience，2019),MonoclonalantibodyofPDCD5caninhibitetoposideinducedHeLacellsapoptosis,31,ATG,SequenceofoligonucleotidesusedinpilotexperimentanddiagramofcorrespondingregionstoORFofPDCD5,32,FACSresultsofJurkatcellapoptosistreatedwitholigonucleotide,Nooligo,sense,AS3,AS2,AS1,33,SequenceofphosphorothioateoligonucleotidestoPDCD5,Antisenseoligos5-AAGCTCCTCGTCCGCC-3Controloligos5-CACCTACCCATCGGAC-3Senseoligos5-ATGGCGGACGAGGAGC-3,34,InhibitionofhumanPDCD5proteinthroughantisenseoligonucleotidetreatment,35,InhibitionofApoptosistriggeredbyVP16inJurkatcellsbyantisenseoligonucleotidetoPDCD5,36,MAINAPOPTOSISPATHWAYS,37,Caspaseactivationbyproteolyticcleavage,38,AntisenseoligonucleotidetoPDCD5inhibitCaspase-3Activityindose-dependentmanner,39,AntisenseoligonucleotidetoPDCD5inhibitCaspase-3Activation,1.Nooligo,VP16-2.Nooligo,VP16+3.senseoligo,VP16+4.Controloligo,VP16+5.Antisenseoligo,VP16+,40,AntisenseoligonucleotidetoPDCD5doesntinhibitactivationofpro-caspase-9,1.Nooligo,VP16+2.senseoligo,VP16+3.antisenseoligo,VP16+4.Controloligo,VP16+,41,ThetargetingsequencesofPDCD5siRNAs,42,TheeffectofPDCD5siRNA,pGC-Non-silencing,pGC-siPDCD5,A.,Non-silencingsiRNA,siPDCD5,B.,C.,43,siPDCD5attenuatescellapoptosisinducedbyBaxoverexpression,44,siPDCD5reducesprocaspase-3cleavageandcaspase-3activity,LinnanChenetal:Apoptosis.2019,11(1):101-111,45,分子机制研究,Pulldown、Co-IP？、ELISA实验证明PDCD5结合Caspase-3，促进Caspase-3的稳定性.,ELISAforPDCD5-Caspase3interaction,46,PDCD5对caspase-3稳定性的影响(invitro),47,德国Stelzl等2019年利用规模化酵母双杂交发现PDCD5结合HTATIP（组蛋白乙酰转移酶,TIP60）、EEF1（翻译延伸因子）、RIF1（酵母端粒蛋白同源分子）、ACP5（酸性磷酸酶）加拿大Ewing等2019年利用规模化质谱分析发现PDCD5结合VHL（抑癌基因）和GC20（可能的翻译起始因子）,48,本实验室利用多指标证明PDCD5结合TIP60，促进组蛋白乙酰化（XuLJetal:Neoplasia,2009,4:345-354）,49,PossiblemechanismfortheFunctionsofPDCD5inApoptosis,50,PDCD5,VHL,Activecaspase-3,Nucleartranslocation,TIP60,Histone,P53,Apoptosis,Acetylation,?,Acetylation,PDCD5可能的分子作用机制,51,PDCD5从基础到临床,在疾病时情况下的是否表达异常？遗传变异是否影响疾病易感性？有无临床诊断价值？是否有治疗价值？,52,ExpressionofPDCD5mRNAindifferenthumantissues,53,PDCD5在肿瘤中的下调表达,1。肝癌（PNAS，中国普通外科杂志）2。乳腺癌（NEJM）3。白血病（北医学报，LeukemiaRes）4。子宫颈癌（北医学报）5。口腔鳞癌（北医学报）6。卵巢上皮癌（中国妇产科临床杂志）7。甲状腺乳头状癌（中华内科杂志）8。银屑病（中华皮肤科杂志）9。胃癌，预后相关（Apoptosis）10。肺癌（JClinOncol）11.肾透明细胞癌，预后相关（南方医科大学学报）12。脑星型胶质瘤（OncolRep）13。多发性骨髓瘤（中南大学学报）14.骨肉瘤（Apoptosis），预后相关（JSurgOncol）15.前列腺癌（ChinMedSciJ）,54,PDCD5的表达与肾癌预后相关南方医科大学学报，2019，26(9)：1316-1318,55,PDCD5的表达与胃癌预后相关Apoptosis,2019,11(6):993-1001,56,PDCD5的表达与骨肉瘤预后相关(JSurgOncol.2019Sep24.Epubaheadofprint),57,上调表达1。系统性红斑狼疮（中华风湿病学杂志）2。老年性白内障（眼科研究）3。骨关节炎（ActaPharmacolSin）4。桥本病甲状腺（中华内分泌代谢杂志）5。多囊卵巢综合征（北医学报）,58,PDCD5启动子区的功能性SNP,本实验室首次发现在PDCD5启动子区存在2个连锁不平衡的SNP：-11G/-27Aor-11A/-27G前者比后者明显高表达PDCD5白血病患者的杂合子频率明显高于正常人XiMa,etal:Clin.Cancer.Res.2019,11:8592,59,PDCD55调控区两个新SNP的发现,SNPs的筛选：45个样本直接测序（-11位和-27位同时出现SNP）,60,PDCD5SNP在HeLa细胞的启动子活性,61,PDCD5SNP在HeLa细胞凋亡的启动子活性,HeLa细胞撤血清诱导凋亡,62,PDCD5启动子区SNP的CML基因型频率,Heterozygousratio:25.58%、11.85,63,PDCD5SNPs在AML患者中的研究,64,RQ-PCR检测不同基因型CML患者PDCD5的mRNA水平,65,66,Spinola等通过SNPs全基因组扫描技术，发现PDCD5基因上游35kb处的SNP与肺癌发病相关，GG或CG基因型携带者肺癌发病风险升高；肺腺癌组织中PDCD5的mRNA比正常肺组织低2.4倍。超表达该基因的人NCI-H520细胞系克隆形成能力明显下降。作者认为PDCD5可能是新的抑癌基因（JClinOncol，2019）,67,PDCD5在肿瘤治疗中的应用,根据肿瘤治疗现状来看，化学药物治疗仍然是目前主要的治疗手段之一，但由于化疗药的毒性作用，限制了化疗的应用。化疗增敏剂可在亚适剂量化学药物剂量下，提高化学药物疗效，降低其对正常组织细胞毒性，产生抗肿瘤细胞的协同效应，具有重要的临床意义。,68,PDCD5腺病毒在裸鼠体内对K562细胞的化疗增敏效应（Apoptosis.2019,13(5):641-648）,69,裸鼠瘤内注射PDCD5重组蛋白增加K562细胞对IDR的敏感性。单纯化疗药IDR的抑瘤率达60.27%时，IDR联合PDCD5抑瘤率可达92.03,(LinShietal:BBRC,2019,396:224),70,裸鼠腹腔注射PDCD5重组蛋白增加K562细胞对IDR的敏感性：平均瘤块57.7mm3开始治疗,71,重组PDCD5腹腔注射联合IDR治疗实验各组小鼠移植瘤重量,*同单独化疗药相比，差异具有统计学意义，P0.05；*同单独化疗药相比，差异具有统计学意义，P0.001；同伊马替尼治疗相比，差异具有统计学意义，P0.05；同伊马替尼治疗相比，差异具有统计学意义，P0.01,（肿瘤平均体积达到140mm3开始治疗）,72,重组PDCD5对骨肉瘤的化疗增敏作用研究,*p0.01vs.control*p0.001vs.control#p0.01vs.cisplatinCisplatin:2mg/kgPDCD5:50mg/kg,BALB/cnudemiceestablisheds.c.chondrosarc