病毒的提纯.doc

病毒的提纯(1)病毒只在活的细胞内寄生、复制和增殖，要在病毒不失活的前提下，使之从细胞中释放出来，去除细胞成份。有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒，病毒粒子被释放到细胞外，可以从培养液或尿囊液中提纯；而另一些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小DNA病毒，在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外，大量提纯时必须首先裂解细胞，使病毒大量释放。实验室常用冻融、研磨、高速捣碎、超声波处理或高压冲击、中性去污剂裂解、蛋白酶解等物理和化学的方法。通过这些方法处理获得的粗制的病毒悬液，其中常含有大量的细胞碎片，一个有效的方法是以2 000 6 000r/min离心3040分钟，可除去90以上的细胞碎片和杂质。(2)病毒粒子实际上是大的蛋白颗粒，可以应用提纯蛋白质的一些技术方法。(3)对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子，可以采用分级分离的技术。当然不同的病毒，其生长特性及理化学性质不同，因此提纯方法也不尽一致。(一)沉淀法主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。1.中性盐沉淀法病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。2.聚乙二醇沉淀法聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量为2 0006 000的PEG。将PEG配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在4搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。Tanncock(1985年)成功地用PEG浓缩了禽脑脊髓炎病毒。3.有机溶剂沉淀法甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。4.等电点沉淀法病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀。数病毒的等电点在pH4.55.5之间，因此在pH36范围内均可沉淀，由于一部分细胞成份在等电点时亦发生沉淀，此法效果不太理想，但从感染的组织培养液中浓缩病毒，可以获得较好结果。应用酸性范围的等电点沉淀或分级沉淀病毒时，必须注意pH对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。5.皂土法Girin(1989年)应用皂土在酸性条件下(pH44.5)吸附轮状病毒SA-11，再在碱性条件下（pH8.5），又使其洗脱下来，从而达到纯化目的。6.鱼精蛋白沉淀法鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质共沉淀的作用，能和直径大于50nm的病毒共同沉淀而不影响病毒的感染力。当向这种沉淀物加入1mol/L NaCl时，病毒又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然沉淀。直径小于50nm的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此，可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于50nm的异种蛋白质。（二）层析法病毒粒子表面携带特定的电荷群，因此病毒对离子交换树脂及类似的其它吸附剂具有亲和性。利用吸附剂的层析法分为两种，一种是正吸附法，即依据病毒粒子表面所携带的电荷进行特异性吸附，然后用适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收；另一种是负吸附法，即只吸附组织或宿主细胞成份等非病毒蛋白，而让病毒粒子通过。收集滤液后经差速离心沉淀法回收病毒。由于各种病毒的大小和表面结构等理化性质不同，因此对吸附剂的亲和性也有显著的差异。1.萄聚糖柱层析法将初步浓缩的材料，通过葡聚糖G-150或G-200柱层析，然后用0.020.15mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.6)洗脱，分部收集，测定280nm波长处的OD值，将含病毒的各部分相混合，再浓缩，透析之后，即可得到比较纯净的病毒，Nagano(1989年)用Sephacryls-1000柱层析纯化了鸡传染性支气管炎病毒。2.凝胶层析法磷酸钙凝胶：这是病毒吸附层析法中较为常用的凝胶，由0.5mol/L CaCl2和0.5mol/LNa2HPO4溶液混合制备凝胶状沉淀物。在中性条件下生成的凝胶称为“brushite”，在碱性条件下生成的凝胶称为羟基磷灰石(hydroxypatite)。两者均用0.001mol/L磷酸盐缓冲液悬浮，置于445天，使它充分沉淀后应用。氢氧化锌凝胶：是由7mol/L氨水与0.1mol/L醋酸锌溶液滴加混合(pH8.5)而制备的，在制备后数小时内较稳定，可作为吸附剂。Newton和Beris等将水泡性口炎病毒悬液与氢氧化锌凝胶混合，使其形成复合体后沉淀，然后用0.08mol/L EDTA(pH8.5)解离病毒，获得较好的回收量。 焦磷酸镁凝胶：是由0.1mol/L焦磷酸钠和0.1mol/L MgCl2，以2：10(体积)比例在室温中缓慢滴加混合而获得的较稳定的焦磷酸镁凝胶。西村等将牛痘病毒悬液同此凝胶混合，使病毒吸附于凝胶，然后用0.1mol/L盐水洗2次，最后用0.3mol/L枸橼酸钠溶液解离病毒，将病毒较好地回收于水相中。3.亲和层析法亲和层析是一种特殊的吸附层析，基质与待分离物具有特异的生物亲和力。通常是将特异的抗体经共价偶联作用结合在配基上组成一种不溶性配基。当相应的抗原物质通过固定配基装成的层析柱时，即被吸附。随后再改变实验条件，将其洗脱下来，达到纯化的目的。该法是于80年代初期开始用于病毒的分离提纯，不仅纯度好，敏感，而且回收率高。Njayou(1991年)应用此法成功地提纯了麻疹病毒。他们应用猴抗麻疹病毒的IgG进行共价偶联，获得了高纯度而有活性的病毒，回收率可达总回收成份的30。Rimmelzwaan(1987年)应用犬细小病毒的中和性单克隆抗体亲和层析，纯化了细小病毒，经SDSPAGE和ELISA鉴定，99以上的杂蛋白被洗除，收获了7090的病毒抗原成份。(三)两 相 溶 剂 间 分 配 系 数 法该法主要原理就是高分子物质以溶质形式存在于两相溶剂中，根据其分配系数的不同而选择性地分配于其中的一方，从而达到纯化的目的。所采用的溶剂主要有：葡聚糖硫酸盐(Dextran Sulphate，DS)和聚乙二醇(PEG)或甲基纤维素(MC)和聚乙烯醇(PVA)，形成DsPEG系、Ds-PVA系和Ds-MC系。利用病毒在有机溶剂中的分配原理，在适当的溶剂系统和葡聚糖层之间进行多次反复转换，不仅能够浓缩病毒，而且还可以纯化病毒。通常是将两相溶剂如Ds-PEG以适当的重量百分比混合，然后加入病毒液，数次激烈振荡混合，置于4 2436小时，即可分离为两层，病毒将特异地分布于其中一方(如Ds层中)。适当改变溶剂的混合比例时，分配于Ds层中的病毒可由Ds层转入PEG中，而得以浓缩。若调节适当，一步就可浓缩100倍，两步浓缩就可以达到10 000倍。非病毒物质通常以不同的方式进行分配，从而达到浓缩纯化的目的。Nammar(1991年)应用Ds-PVA系纯化了反转录病毒。两相溶剂间分配系数法简单、温和，并能使病毒得到较高的浓缩和纯化。但是为了获得高度纯化的病毒，还需配合应用其它方法。(四)红 细 胞 吸 附 法所谓病毒的红细胞凝集反应，就是指病毒被红细胞表面粘蛋白吸附的现象。自Hirst发现流感病毒的红细胞凝集性质以来，随后相继发现其它一些动物病毒也有红细胞凝集性。Stanley证明，流感病毒在0时被红细胞吸附，而在37时却从红细胞上脱离下来的性质，从而将此方法应用于病毒提纯。长春农牧大学应用醛化鸡红细胞吸附马流感病毒，取得较好效果。具体方法是：采取鸡血，以无菌生理盐水洗涤3次后制成压积红细胞。另取福尔马林和生理盐水等量混合，制成福尔马林盐水。在2份福尔马林盐水中加入1份压积红细胞，充分振荡15分钟，置28冰箱内48h，每天振荡23次。届时取出，再振荡1次，后用700r/min离心510分钟，弃上清，再加20倍量生理盐水，振荡混合后置28冰箱过夜。弃上清，加入20倍量生理盐水，如上洗涤3次。取沉淀红细胞，加入相当于初次压积红细胞量的生理盐水，混匀后即可应用。将马流感病毒感染的鸡胚尿囊液，作2 500r/min离心10分钟，吸取上清液。取保存于28的病毒液100ml，加入28的醛化红细胞悬液6ml，充分振荡15分钟，立即放入冰箱内每2小时振荡1次，共23次，随后置冰箱中过夜，待其自然沉淀。次日吸出上清，如其血凝价在115以下，则证明已经充分吸附，此时即可进行释放，否则需再补加醛化红细胞悬液继续吸附。在已充分吸附病毒的醛化红细胞沉淀中，加入相当于原病毒液1/10量的5mol/L NaCl 10分钟。吸取上清液，即为浓缩病毒液，必要时可对已释放过病毒的醛化红细胞作第二次释放，方法同前。上述吸附释放方法，可将病毒浓度提高10倍左右(以血凝效价表示)。(五)超滤法超滤法是利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将一定大小的大分子或病毒等颗粒截住从而使后者得到浓缩的一种方法。超滤膜的孔径有多种，可根据被截留的分子大小而选择。超滤法是浓缩大容量的病毒样品的一种非常有效的方法，其优点是可以在室温或低温下操作；对被浓缩的产物损害很小；浓缩的同时可达到部分纯化；如选择合适的膜和操作参数，可达到很高的回收率；此外，超滤系统可密封以防止外来污染。超滤系统目前主要有三种，即搅拌池式，浅道流动系统和中空纤维系统。搅拌池式是一种最简单的超滤系统，由超滤室及磁力搅拌器组成，通过正压而使液体通过滤膜。此方法简单，但浓缩样品量有限，一般在2 000ml以内，而且滤膜孔易于堵塞。浅道流动系统的特点是液体在膜表面的螺旋形浅道中流动，液体与膜的接触面积也大于搅拌池系统，因而滤过速度大为提高。中空纤维系统是由很多根空心纤维成束装配而成，每根纤维即为一个微细管型膜，因此，其有效的膜面积远远大于前二个系统，滤过速度很快，适用于大体积的浓缩。(六)病 毒 提 纯 举 例1.犬冠状病毒的提纯(1)病毒材料：正常犬粪便83g溶于250ml TEN(0.05mol/L Tris-HCl 0.01mol/L EDTA,0.15mol/L NaCl pH6.0)。(2)初步提纯：将上述病毒材料于5 000r/min离心20分钟，弃杂质沉淀物，取上清液，再于4，16 000r/min离心30分钟。获上清液约238ml；向238ml上清液中缓慢加入30%PEG(含7.85g NaCl)，置于4过夜；将PEG沉淀混合物19 000r/min离心30分钟，将沉淀悬浮于11ml TEN中；(3)进一步提纯：制备30%50%蔗糖线性浓度梯度；将PEG浓缩的11ml悬液层加于蔗糖浓度梯度的顶部，于30 000r/min4离心3小时。2.狂犬病病毒的提纯(1)病毒材料：狂犬病病毒弱毒株SRV9株接种于BHK21细胞单层，5天后收集细胞培养物2000ml，反复冻融3次后，即为提纯材料。(2)初步提纯：先将细胞培养物3 000r/min离心30分钟(4)，弃去细胞碎片及杂质，收集上清液，将上清液按照150比例用1mol/L醋酸锌(pH5.0)沉淀，混合之后调pH至6.8，在04放置2060分钟，1 000g离心40分钟收集沉淀，弃上清液，用Tris-EDTA(pH8.0)重悬沉淀，再1 000g离心20分钟，吸取上清液。(3)进一步提纯：将上面初步浓缩的病毒液加在5%30%(W/V)或10%60%蔗糖梯度离心柱上，相应在54 000g离心45分钟，随后从离心管底部或侧面穿刺回收病毒带，再用35倍体积的TEN(0.05mol/L Tris-HCl， 1mmol/L EDTA pH7.8， 0.13mol/L NaCl)稀释，189 000g离心3小时，用TEN悬浮。3.禽脑脊髓炎病毒的快速提纯(1)病毒材料：用0.2ml禽脑脊髓炎病毒接种7日龄SPF鸡胚的卵黄囊，37810天后，收获脑，以10%(W/V)浓度悬浮于PBS中，同时加入100U/ml青霉素和100g/ml链毒素。(2)初步提纯：将收获在PBS中的脑悬液经匀浆器研磨之后，经2 000g 15分钟， 10 000g 60分钟离心沉淀，含有病毒的上清液混加于10%PEG6 000(含pH7.8的0.125mol/L Tris-HCl)中。使PEG最终浓度为4%，此混合液在4搅拌过夜，6 000g离心收集沉淀。弃上清液，将沉淀重悬于含0.5mol/L NaCl的0.125mol/L Tris-HCl(pH7.8)中。病毒悬液10 000g离心3小时，重悬于此缓冲液中。(3)进一步纯化：等密度梯度 将上述初步浓缩的病毒悬液在4通过3ml40%60%(W/V) CsCl梯度24小时50000r/min离心，从离心管底分部收集、检测鉴定。速度梯度离心 将0.5ml提纯的病毒液通过9ml 15%40%(W/V)蔗糖梯度6 000r/min4离心4小时，从管底分部收集、鉴定检测。二、病毒蛋白亚单位的分离病毒粒子含有几种以上的蛋白质，每一种蛋白质通常都由分子量较小的许多相同的亚单位组成。病毒的结构蛋白决定着病毒粒子的结构及其与细胞受体部位结合的特异性。病毒的血清学特异性和酶活性也决定于蛋白质。结构蛋白还有保护病毒核酸的作用核酸处于蛋白外壳的内部，或与蛋白质互相缠绕而成核蛋白。因此病毒基因组受到有关蛋白质的保护，从而可以抵抗理化学因素的降解作用。蛋白质是病毒最主要的组成成份，病毒粒子的蛋白质可以单独地或与糖、脂类结合在一起，成为糖蛋白或脂蛋白.病毒结构蛋白可以从提纯的病毒制品中通过与核酸和其它蛋白分离，而又不打断肽键的处理方法得到。分离时须用中性去污剂、极性试剂或阻止蛋白聚合的保护剂如尿素、盐酸胍、去氧胆酸钠和SDS等，或改变值等方法加以处理。下面就几种病毒蛋白亚单位的分离加以介绍：1.流感病毒蛋白亚单位分离将提纯的流感病毒悬浮于0.05mol/L硫酸铵缓冲液中(pH7.2)，加入SDS、尿素、2-巯基乙醇，使其最终浓度分别为2%、0.5mol/L、0.04mol/L，在37保温30分钟，再于100加热1分钟，然后以含0.1%SDS、0.05mol/L尿素的0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)透析，以降低SDS的浓度，裂解的病毒亚单位用SDS-PAGE制备电泳分离。2.猫冠状病毒亚单位分离将提纯的病毒用1%Nonidet P-40(NP-40)裂解，然后层加于含有0.1%NP-40，15%到50%的蔗糖梯度，该梯度于38 500r/min离心17小时，部分(0.25ml)收集，用2%BSA封闭371小时，再用亚单位N、E和E2的单抗鉴定，浓缩收集。3.辛德毕斯(sindbis)病毒膜蛋白分离大约50mg提纯的辛德毕斯病毒溶于4倍重量的TritonX-100，在4过夜，样品然后稀释到50ml的PBS中。再过Sephacryl-400柱，收集不同的峰，合并浓缩至50ml，将含膜蛋白的部分浓缩后用PBS透析除去污剂。在没有去污剂的情况下第2次过Sephacryal-400柱，再次浓缩收集，SDS-PAGE电泳鉴定。4.非洲猪瘟病毒蛋白亚单位的分离(1)将提纯的0.7ml病毒和0.3ml猪胰脂酶在37孵育，对照管加入PBS，消化的前30分钟内出现大量的衣壳亚单位，而相应部位的病毒粒子减少，表现在内外层衣壳之间的壳粒同时释放出来，当然并不是所有的壳粒都同时释放出来，2小时消化很完全。(2)将脂肪酶消化物经线性梯度离心，35 000r/min2小时，明显出现两条带，上面的这条带含有壳粒亚单位，收集后检测抗原性及感染性。三、病毒脂质的抽提病毒中有许多种脂类化合物，包括磷脂、中性脂肪、脂肪酸、脂肪醛及胆固醇等。病毒脂质的主要成分是磷脂，它在许多病毒中具有结构上的功能。病毒的磷脂就在囊