（食品科学专业论文）梭子蟹下脚料酶法制备活性肽的研究.pdf

梭子蟹下脚料酶法制备活性肽的研究 摘要 梭子蟹下脚料是梭子蟹蟹肉加工的废弃物，包括蟹脚、背壳和内脏等，其 中蛋白质含量占3 0 - 4 0 。从梭子蟹下脚料中提取抗氧化肽及抗菌肽，使其 中的蛋白几乎全部利用，不仅提升梭子蟹的附加值，还能减少废弃物造成的环 境污染，具有良好的经济和社会效益。 本课题以梭子蟹下脚料为原料，对梭子蟹下脚料酶法提取两种活性肽一抗 氧化肽与抗菌肽的工艺进行研究。包含以下三个方面：制备蟹抗氧化肽最佳工 艺条件的研究；葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蟹抗氧化肽及其理化特性的研究： 制备蟹抗菌肽的最佳工艺条件的研究。实验结果如下： ( 1 ) 制备蟹抗氧化肽最佳工艺条件研究结果表明：中性蛋白酶制备蟹抗氧 化肽为最适蛋白酶；通过单因素与正交试验确定酶解最佳工艺条件为，料液比 1 ：6 ，水浴预处理时间1 5 h ，酶解温度5 0 ，酶解p h 值7 5 ，加酶量3 0 0 0 u g ， 水解时间4 h 。此条件下水解液的多肽含量为6 5 6 6 。蟹抗氧化肽粗品得率为 4 3 3 。 ( 2 ) 葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蟹抗氧化肽及其理化特性的研究结果表 明：经过葡聚糖凝胶g 5 0 与g 2 5 两步分离纯化得到的3 个组分中组分3 抗氧化性 较强，经h p l c 分析组分3 已基本达到纯化；分子量在1 0 9 6 5 左右；组分3 由1 1 种 氨基酸组成，其中具有抗氧化能力的酪氨酸、半胱氨酸和组氨酸所占比例很高。 组分3 具有很好的溶解性及溶解稳定性，吸油性强，在食品加工中可以得到很好 的应用。蟹抗氧化肽得率为1 3 3 。 ( 3 ) 制备蟹抗菌肽的最佳工艺条件的研究结果表明：风味蛋白酶为制备蟹 抗菌肽的最适蛋白酶；通过单因素与响应面试验确定酶解最佳工艺条件为，料 液比1 ：5 9 ，水浴预处理时间1 5 h ，酶解温度4 5 ，酶解p h 值6 ，加酶量3 6 1 6 2 u g ， 水解时间4 5 h 。此条件下水解液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径最大为 1 9 0 m m ，水解液的多肽含量为5 8 4 6 。蟹抗菌肽粗品得率为3 8 3 。 关键词：梭子蟹下脚料；酶解；蟹抗氧化肽；蟹抗菌肽；分离纯化 s t u d i e so nt h ep r e p a r a t i o no fp e p t i d e sf r o me n z y m a t i c h y d r o l y s i so fs w i m m i n gc r a bw a s t e a b s t r a c t t h es w i m m i n gc r a bw a s t e sw e r el i t t e r sf r o mt h ep r o c e s s i n go ft h es w i m m i n g c r a b ，c o n s i s t i n go fc r a bc l a w s ，c r a bt e r g u m ，v i s c e r aa n ds oo nw h i c h a r er i c hi n p r o t e i n so f30 4 0 t h ee x t r a c t i o n o fa n t i o x i d a n tp e p t i d e sa n da n t i b a c t e r i a l p e p t i d e sf r o ms w i m m i n gc r a bw h i c hn e a r l ym a k e sf u l lu s eo ft h e i rp r o t e i n sc a n n o t o n l yi n c r e a s ei t sv a l u e - a d d e d ，b u ta l s or e d u c ee n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n s oi th a s s o u n de c o n o m i ca n ds o c i a lb e n e f i t s t h i sr e s e a r c hw a sa i m e dt os t u d yo np r e p a r a t i o no fp e p t i d e s a n t i o x i d a n t p e p t i d e sa n da n t i b a c t e r i a lp e p t i d e sf r o me n z y m a t i ch y d r o l y s i so fs w i m m i n gc r a b t h es u i t a b l ec o n d i t i o no fe n z y m a t i ch y d r o l y s i sf o rm a k i n ga n t i o x i d a n tp e p t i d e s f r o mc r a bw a ss t u d i e d ；m e t h o d sf o rp u r i f i c a t i o no fa n t i o x i d a n tp e p t i d e sw i t h s e p h a d e xc h r o m a t o g r a p h ya n dp h y s i c a l a n dc h e m i c a l p r o p e r t i e s o fp u r i f i e d a n t i o x i d a n tp e p t i d e ss u c ha sm o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o nw e r ed e t e r m i n e d ；t h e s u i t a b l ec o n d i t i o no fe n z y m a t i ch y d r o l y s i sf o rm a k i n ga n t i b a c t e r i a lp e p t i d e sf r o m c r a bw a ss t u d i e d t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w i n g ： ( 1 ) t h es u i t a b l ec o n d i t i o no fe n z y m a t i ch y d r o l y s i sf o rm a k i n ga n t i o x i d a n t p e p t i d e sf r o mc r a bw a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tn e u t r a lp r o t e a s ew a s s u i t a b l ef o r t h eh y d r o l y s i so fs w i m m i n gc r a bw a s t e ；t h eo p t i m a lh y d r o l y s i s c o n d i t i o nw a s1 ：6o fm a t e r i a l l i q u i dr a t i o ，1 5 ho fw a t e r - b a t hh e a t i n gt i m e ， t e m p e r a t u r e5 0 。c ，p h7 5 ，3 0 0 0 u go fe n z y m ea m o u n t ，4 ho fh y d r o l y s i st i m e t h e c o n t e n to fp o l y p e p t i d e si nh y d r o l y s a t e sw a s6 5 6 6 y i e l do fc r u da n t i o x i d a n t p e p t i d e so fc r a bw a s4 3 3 ( 2 ) t h ea n t i o x i d a n tp e p t i d em a d eb ye n z y m eh y d r o l y z i n gs w i m m i n gc r a bw a s s e p a r a t e db ys e p h a d e xg - 5 0a n ds e p h a d e xg - 2 5 t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e p e p t i d ec o l l e c t e di nt h et h i r de l u t i o np e a kh a sb e t t e ra n t i o x i d a n ta c t i v i t y ；i tw a s p u r i f i e db a s i c a l l yb yh p l ca n a l y s i s ；i t sm o l e c u l a rw e i g h tw a sa b o u t10 9 6 5 ；i tw a s c o m p o s e do f1 lk i n d so fa m i n oa c i d ，r i c hi nt y r ，c y sa n dh i sw h i c hh a v e a n t i o x i d a n ta c t i v i t y i n g r e d i e n t3h a sg o o dd i s s o l v i n gc a p a c i t ya n dd i s s o l u t i o n s t a b i l i t y ，a n dh a ss t r o n go i la b s o r p t i o n ，w h i c hc a l lb eb e t t e ru s e di nf o o di n d u s t r y y i e l do fa n t i o x i d a n tp e p t i d e so fc r a bw a s1 3 3 ( 3 ) t h es u i t a b l ec o n d i t i o no fe n z y m a t i ch y d r o l y s i sf o rm a k i n ga n t i b a c t e r i a l p e p t i d e sf r o mc r a bw a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tn e u t r a lp r o t e a s ew a s s u i t a b l ef o rm a k i n ga n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s ；t h eo p t i m a lh y d r o l y s i sc o n d i t i o nw a s 1 ：5 9o f m a t e r i a l - l i q u i dr a t i o ，1 5 ho f w a t e r - b a t hh e a t i n gt i m e ；t e m p e r a t u r e4 5 ，p h 6 ，3 6 16 2 u go fe n z y m ea m o u n t ，4 5 ho fh y d r o l y s i st i m e t h eh i g h e s ti n h i b i t i o n z o n ed i a m e t e ro fa u r e u sw a s19 0 r a mi nh y d r o l y s a t e so b t a i n e du n d e rt h eo p t i m a l h y d r o l y s i sc o n d i t i o na n dt h ec o n t e n to fp o l y p e p t i d e si nh y d r o l y s a t e sw a s5 8 4 6 y i e l do fc r u da n t i b a c t e r i a lp e p t i d e so fc r a bw a s3 8 3 k e y w o r d s ：s w i m m i n gc r a bw a s t e s ；e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ；a n t i o x i d a n tp e p t i d e so f c r a b ；a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e so fc r a b ；s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n 插图清单 图2 一l 酶活力测定标准曲线图1 5 图2 - 2 四种蛋白酶水解液还原力的比较1 6 图2 3 水浴热处理时间对抗氧化效果的影响1 7 图2 4 水解时间对抗氧化效果的影响1 7 图2 5 加酶量对抗氧化效果的影响1 8 图2 - 6p h 值对抗氧化效果的影响”1 8 图2 7 水解温度对抗氧化效果的影响1 9 图3 1 葡聚糖凝胶g 5 0 分离抗氧化肽粗品的洗脱图2 6 图3 2s e p h a d e xg - 2 5 分离组分a 的洗脱图一2 6 图3 3 组分3 的h p l c 分离图2 7 图3 4 用葡聚糖凝胶g 2 5 层析测定分子量的标准曲线2 8 图3 5 蟹抗氧化肽的溶解性2 9 图3 - 6 蟹抗氧化肽的吸水性与保湿性一一3 0 图3 7 蟹抗氧化肽的吸油性3 0 图4 1 加酶量与料液比的等高线与响应面图4 0 图4 2 加酶量与水解时间的等高线与响应面图4 1 图4 3 料液比与水解时间的等高线与响应面图4 1 v 表格清单 表2 1 各种酶的酶解条件一1 2 表2 2 脱脂蟹下脚料基本成分表一一1 5 表2 3 各种酶活力表一一1 6 表2 - 4 正交试验设计与结果1 9 表3 1 蟹抗氧化肽的抗氧化特性一2 7 表3 2 蟹抗氧化肽的氮溶解指数2 8 表3 3 蟹抗氧化肽的溶解性2 9 表3 4 组分3 的氨基酸组成3 1 表4 - 1 水解时间对水解液抑菌效果的影响3 6 表4 - 2 料液比对水解液抑菌效果的影响一3 6 表4 3 加酶量对水解液抑菌效果的影响3 7 表4 4 温度对水解液抑菌效果的影响3 7 表4 - 5p h 值对水解液抑菌效果的影响3 7 表4 - 6 试验因素水平编码表3 8 表4 - 7 表响应面分析试验点安排及试验结果3 9 表4 - 8 回归方程系数及显著性检验3 9 i x 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所 知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得盒胆王些太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一阿工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文储签字：悲造兄 签字日期：驯。年年月芍日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金胆王些态堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人授权 金目垦王些太 兰l 可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文者签名：范重履 签字日期：矽i ( 辉f 月万日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 致谢 本论文是在导师王泽南教授的悉心指导下完成的。从论文的选题，试验开 展，到论文的修改完成都凝聚着导师大量的精力和心血。三年来，王老师在学 习、科研上一直对我悉心指导，严格要求、热情鼓励，为我创造了很多锻炼提 高的机会。王老师平易近人，他渊博的知识、宽广无私的胸怀、诲人不倦的教 师风范和对问题的敏锐观察力，都将使我毕生受益。在此，谨向尊敬的王老师 致以我崇高的敬意和深深的感谢! 感谢余顺火老师、陈从贵老师、陆剑锋老师、王武老师、马道荣老师、杨 雪飞老师、吕顺老师、陈晓燕老师等在实验过程中给予我的热心帮助和大力支 持! 感谢陶学明、王晓倩、姜震、卢进峰、刘鹏、吴红引、张秋子、李莹、胡 林林、杨柯、周小芬等师兄、师姐、师弟和师妹们在学习过程中给予的帮助； 另外感谢帮助过我的同学郭俊珍、李洪波以及郑钰、张安、陈丽梅、孟凡莉、 易守连、范婷婷等! 特别感谢一直默默关心着我的父母、哥哥及男友许周，他们在我的学习和 生活中给了我莫大的支持和鼓励，在此向他们表示我最真诚的祝福和感谢! 最后，感谢生物与食品学院的领导和老师三年来对我的培养! 由衷地感谢 关怀、教诲、帮助、支持和鼓励我完成学业的老师、朋友和亲人。 i v 作者：范建凤 2 0 1 0 年4 月 第一章绪论 1 1 梭子蟹的概况 1 1 1 梭子蟹形态及营养价值 三疣梭子蟹又名梭子蟹、海螃蟹、枪蟹、海蟹等。梭子蟹在动物分类上属 于节肢动物门、甲壳纲、十足目、梭子蟹科。梭子蟹是一种温带、热带的经济 蟹类。广泛分布于大西洋、太平洋和印度洋【1 1 。中国沿海梭子蟹约有1 8 种。 梭子蟹的形态特征是：全身分为头胸部、腹部和附肢。梭子蟹头胸甲的前 缘左右两侧各有9 枚锯齿，最后一齿最为长大，横向两侧方突出，使头胸甲中 部宽大，两侧尖细，形似织布用的梭子，胸甲上的颗粒细小，无花白云纹，有 3 个疣状突，一个在胃区，两个在心区，故名三疣梭子蟹。梭子蟹头胸甲表面 有横行的颗粒棱线或成群的颗粒。甲面分区明显，额缘具有4 枚小齿。复眼一 对，具柄。步足5 对，第一对大而坚硬，称螯足，螯足发达，长节呈棱柱形， 内缘具钝齿，第五对步足平扁如桨，称游泳足，有较强的游泳能力。所以梭子 蟹被列为底栖游泳动物。腹部扁平，雄蟹腹部呈三角形，雌蟹呈圆形。雄蟹背 面茶绿色，雌蟹紫色，腹面均为灰白色【2 1 。 在地球上多种蟹类中，体型大，食用价值及经济价值最高的是三疣梭子蟹。 三疣梭子蟹个体较大，肉色洁白，肉质细嫩，味道鲜美，尤其是两钳状螯足之 肉，呈丝状而带甜味，蟹黄色艳味香，食之别有风味，因而久负盛名。5 0 9 蟹 肉含蛋白质1 4 9 、脂肪2 6 9 及其他营养元素若干，对身体有很好的滋补作用。 梭子蟹的烹制方法有很多，或蒸或炒或煎。我国自古代便有了食用蟹的传统， 唐代大诗人自居易有言“陆珍熊掌烂，海味蟹鳌咸 。梭子蟹鲜食以蒸食为主， 还可加工成冻蟹肉块等冷冻小包装食品，也可以加工成蟹肉罐头、烤蟹、蟹酱、 炝蟹等食品。蟹卵经漂洗晒干即成为“蟹子，是海味中之上品。 梭子蟹是中国较重要的出口畅销品之一，除了鲜活蟹出口外，沿海各省生 产的梭子冻蟹、蟹罐头等在美国、德国、法国、澳大利亚等国家及亚太市场也 非常走俏d j 。以本文课题来源的产学研单位侨丰集团所在地汕头市为例，汕头 市海洋资源丰富，侨丰集团海捕梭子蟹产量在全国所占比重较大，拥有全国最 大的天然梭子蟹加工出口基地，每年生产梭子蟹水产品1 万多吨，居全国首位。 1 1 2 梭子蟹的研究开发现状 我国现有的梭子蟹产品主要有：一是全蟹加工，包括冷冻全蟹、冰鲜全蟹、 冷冻熟全蟹；二是蟹肉加工，主要利用蟹肉制成冷冻蟹肉、蟹肉罐头等各种产 品；三是蟹汁综合利用，即将蒸煮蟹汁经蒸发浓缩后冷藏，可作食品增味剂， 添加剂。 4 - s 】 目前，我国对梭子蟹的加工主要是取蟹肉，经处理后作为商品大部分出 口。在冷冻蟹肉、蟹肉罐头等加工出口的过程中，会产生大量蟹壳、蟹腿等 1 下脚料，而这些废弃物中不仅有富含甲壳素的蟹外壳，还有占废弃物大约3 5 的蟹肉。蟹加工后的废弃物始终困绕着企业，不仅限制了蟹加工规模的总 量，造成水产品资源的浪费，还由于废弃物多被弃于大自然而对周边环境造 成污染，这也严重影响了企业的形象。梭子蟹废弃物中富含蛋白质，钙及甲 壳素等高附加值产品，国内外学者对其在化工、医药、功能等发面的利用做 了较多的研究，对虾蟹下脚料的利用研究主要集中在甲壳素，壳聚糖的制备 和利用上【6 。8 】，除可用于制取高分子絮凝剂，降解塑料，净化废水，制备分离 膜和保鲜膜外还可用于医药方面，其制品对胃蛋白酶活力有一定增加作用 9 1 o 此外，也可以虾蟹下脚料为原料提取脂肪，蛋白粉【1 0 0 1 1 。但从蟹下脚料中提 取多肽的研究方面却鲜有报道，本文通过从梭子蟹废弃物中提取抗氧化肽及 抗菌肽，使梭子蟹的蛋白几乎全部利用，蟹废弃物加工为原料的零成本，却 创造不小的价值，产生良好的社会和经济效益。 梭子蟹废弃物利用产业化的实现，不仅可以促进梭子蟹养殖业的发展， 拓展梭子蟹加工产业链，更重要的是为其它水产品的精深加工提供出一条新的 思路，对水产品领域的综合加工利用具有特别重要的意义，将会使我国水产品 加工上一个崭新的台阶。 1 2 活性肽的开发 1 2 1 活性肽简介【1 2 】 生物活性肽指的是一类分子量小，在构象上比较松散，由不到1 0 个氨基酸 组成的小肽，具有多种生物学功能及特定生理作用，对生物机体的生命活动有 益的肽类物质( 李旭华与张石蕊，2 0 0 6 ) 。 1 9 8 6 年的诺贝尔生理学奖颁给了第一位发现活性肽生长因子的科学家，以 表彰他为基础科学的研究开辟了一个具有广泛重要性的新领域( 薄玉红与刘功 权，2 0 0 2 ) 。经研究发现，人类摄入的蛋白质经消化酶作用后，不是像以前认为 的那样，仅以氨基酸的形式吸收，更多的是以小肽( - - 肽、三肽等) 的形式吸收， 而以游离氨基酸形式吸收的比例很小。小肽比游离的氨基酸消化的更快、吸收 更多( 杨建军，2 0 0 3 ；陈历俊等，1 9 9 9 ) 。这表明肽的营养价值和生物效价比游 离氨基酸更高。自此活性肽被吸收的观点及其生理功能才逐渐引起人们的重视， 与其相关研究也变得异常活跃起来。 许多活性肽不仅能提供人体生长及发育所需的营养物质与能量，而且还具 有防治疾病、调节人体生理机能的重要作用。这些功能是食品蛋白质或其组成 的氨基酸所不具备的，这也是目前生物活性肽引起食品学术界广泛重视的重要 原因之一。蛋白质营养价值的评述也从蛋白质的消化性，氨基酸的含量及组成 发展到氨基酸序列中某些特定活性肽的生理保健功能上来。实现了蛋白质生物 学、生理与营养学的一大飞跃。 2 1 2 2 活性肽的性质及分类 肽是由2 个以上的氨基酸分子联结而成，是构成及发挥活性蛋白质作用的 结构片段。但是肽的功能及性质与蛋白质是有不同之处的。小分子的短肽具有 较好的溶解性，在酸碱离子浓度或受热条件下抗凝性好，即使是在高酸碱浓度 条件下仍具有较好的热稳定性和流动性，且相对于游离氨基酸具有耗能低、吸 收快、载体不易饱和等特点( 李富伟，2 0 0 2 ) 。实际上体内的功能性蛋白质多为 载体，它们的作用大多是由挂在其上的活性肽段来完成，活性肽具有非常重要 的不可替代的调节作用，这种作用几乎涉及到人体所有的生理活动川。活性肽 按其生理功能可分为以下几种肽【1 4 d 5 】： ( 1 ) 抗菌肽：抗菌肽是具有广谱的高效杀菌活性的碱性多肽类物质，是动、 植物尤其是昆虫非特异性免疫系统的重要组成部分。1 9 7 2 年，瑞典科学家 b o m a ng 等首次从天蚕蛹中发现抗菌肽c e e r o p i n s ( b o m a nh ge t a l ，1 9 7 2 ) ，此后 又从植物( m v m a rd a h e t ，1 9 9 9 ) 及各种动物( 哺乳动物、两栖类等) 体内分离得到 抗菌肽，一些细菌也能产生或分泌出抗菌肽。由s o r e n s o n 首先从动物乳中发现 的乳铁蛋白( l a e t o f c r r i c i m ) 是牛乳中研究最多的抗菌肽( 张馒等，2 0 0 2 ) 。随着 研究的不断深入，人们发现某些抗菌肽还对部分真菌、病毒甚至癌细胞具有明 显的杀伤作用，是一类具有潜在应用价值的重要的活性物质( 张煌等，2 0 0 6 ) 。 ( 2 ) 抗氧化肽：一些动、植物蛋白在适宜的作用条件下可产生具有抗氧化能 力的活性肽。动物蛋白以鱼类蛋白进行的研究较多，植物蛋白则以大豆蛋白研 究较多。这些活性肽是蛋白水解物，具有抑制脂质过氧化、清除自由基等作用。 如s u e t s u n a & u k e d a - - h ( 2 0 0 0 ) 从利用酶法从沙丁鱼中得到了抗氧化肽；徐力等 ( 2 0 0 4 ) 利用碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉得到一种玉米抗氧化肽：刘大川、沈蓓 英等分别利用碱性蛋白酶和酸性蛋白酶水解大豆蛋白得到了大豆抗氧化肽( 刘 大川与钟方旭；1 9 9 8 沈蓓英，1 9 9 6 ) 。 ( 3 ) 抗高血压肽：抗高血压肽具有通过抑制血管紧张素i 转换酶达到降血压 的作用。抗高血压肽的来源大致有以下几种：来自酸奶的肽类；来自乳蛋白的 肽类( p i h i a n t o - - l e p p a a ，2 0 0 0 ) ) ；来自植物的肽类( 玉米醇溶蛋白、无花果) 等( 石 岗，2 0 0 2 ) ；来自鱼贝类( 沙丁鱼、金枪鱼) 。的肽类。 ( 4 ) 免疫活性肽：免疫活性肽的生理功能是多方面的，它不仅能增强动物体 内的免疫能力，起重要的免疫调节作用，还能刺激机体淋巴细胞的增殖及增强 巨嗜细胞的吞噬能力，从而提高机体对外界病原物质的抵抗能力( 肖涛等， 2 0 0 6 ) 。 ( 5 ) 抗血栓肽：来源于牛k 酪蛋白c 末端的酪蛋白血小板因子( e a s o p l a t e l i n s ) 是一类生物活性肽，它能抑制a d p 激活的血小板聚合作用，同时还能抑制血小 板与人血纤维蛋白原y 链表面特异位点的结合，所以具有防止抗血栓形成的生 理功能( 庞广昌等，2 0 0 1 ) 。 3 1 2 3 活性肽的生产方法1 1 6 】 1 2 3 1 天然活性肽的分离提取 存在于动植物、细菌、真菌等生物体内的天然活性肽，经生物化学技术分 离提取而得。 1 2 3 2 基因重组法制取活性肽 采用d n a 重组技术制取活性肽的研究尚在进行试验中，如成功将会有广 阔的发展前景。 1 2 3 3 化学合成法 活性肽的合成是把氨基连到羧基上，羧基先与一种试剂二环己基二亚胺 ( d c c ) 反应，使之活化，然后游离的氨基对被活化的羧基进攻导致肽键的形成 和二环己基尿素的释放。在反应时要注意保护其它可能发生反应的基团，如含 有活化的羧基的那一部分的a 氨基可用于第三丁基氧羧基( b o c ) 与之反应， 这种一b o e 保护基团可在释放中被除去【1 7 j 。此方法目前仅在实验规模中使用， 还未见其有应用于工业生产的报道。 1 2 3 4 食品蛋白质水解制取活性肽 蛋白质的水解方式较多，有化学降解法和酶降解法等。化学降解方法是利 用酸或碱法水解蛋白质，虽然成本低廉，方法简单，可是反应条件过于剧烈， 氨基酸生成过程中受损严重，破坏了其构形，使l 氨基酸变成a 氨基酸，并能 形成像赖氨酸一丙氨酸等有毒副作用的物质，且很难按规定的水解程度控制水 解，故现在很少采用【1 8 1 ；而酶解法能在温和的条件下进行，水解的程度易于控 制，可以在特定的条件下进行定位水解，分裂产生特定的肽，因而能很好的满 足生产活性肽的需要。反应产物与相同组成的氨基酸具有特殊的理化性能和生 理功能，己成为蛋白质水解制品的主要发展方向。蛋白水解物的功能特性与酶 的种类、底物蛋白质、p h 值、酶反应的温度、酶与底物的浓度比等条件有密切 关系，此外，还与反应体系的产物类型、离子强度等构成因子有关。 1 3 抗氧化肽的概况 1 。3 1 抗氧化肽的抗氧化机理 关于抗氧化肽作用机制多集中于与抗氧化肽活性密切关联的三类氨基酸 ( 即抗氧化性氨基酸、疏水性氨基酸和酸性氨基酸) 及其构象方面的研究。脂质 过氧化链式反应是由于在多不饱和脂肪酸分子中，双键减弱了与之连接的碳原 子与氢原子之间的碳氢键，使与两个双键相连的亚甲基上的氢易被自由基抽去 而引发的【1 9 】。该反应导致脂质分子不断消耗和脂质过氧化物如c o o h 等大量形 4 成。疏水性丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸的非极性脂肪烃侧链能够加强抗氧化肽与 疏水性多不饱和脂肪酸作用，含疏水性氨基酸肽通过与氧结合或抑制脂质中氢 的释放，延缓脂质过氧化链反应，从而保护脂质体系中膜质完整性，起到抗氧 化作用 2 0 - 2 1 】。许多氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力，如组氨酸、酪氨酸、半 胱氨酸、色氨酸、亮氨酸等。已知游离金属离子，如：c u 2 + 、f e 2 + 等，可催化h 2 0 2 产生极活泼的o h ，含组氨酸肽能通过螯合这些过渡金属起到抗氧化作用，组 氨酸上有羧基、0 【氨基和活性侧链基团咪唑基，羧基和0 【氨基与金属离子可形 成五元环，咪唑基和a 氨基与金属离子可形成六元环，咪唑基和羧基与金属离 子可形成七元环 2 2 】。酸性肽不含组氨酸、酪氨酸等，其酸性氨基酸侧链羧基与 金属离子作用能起到钝化金属离子的氧化作用，减弱自由基的链反应，从而达 到抗氧化效果【2 引。 肽构象是蛋白质功能活性基础，抗氧化肽的自由基清除作用通常依靠含氢 供体提供质子猝灭未配对的自由基及电子。另外，组氨酸、酪氨酸、亮氨酸、 甲硫氨酸能加强肽的抗氧化活性，但l i 等从猪胶原蛋白酶解物中纯化的抗氧化 肽q g a r 并不含有可以作为强质子供体的上述氨基酸【2 4 1 。此外，荣建华等指出 大豆多肽抗氧化活性与其抑制氧化酶、激活抗氧化酶和提高免疫有关【2 引。 1 3 2 抗氧化肽的分离纯化方法 多肽提取分离常用的方法，包括水泡法、化学萃取法( 如醇提、丙酮法) 、 沉淀法、冻融法、酶解法、离心法、超滤法、层析法、电泳法等。在实际应用 中，对特定多肽类物质进行分离纯化常常采用上述几种方法的组合【2 6 1 。 1 3 2 1 各种柱层析方法 ( 1 ) 凝胶过滤色谱( s e c ) s e c 是利用多肽形状差异、分子大小来分离纯化多肽类物质的一种方法。 倪莉将丝素经碱性蛋白酶酶解后的酶解产物采用凝胶色谱s e p h a d e x g 15 分离 纯化出丝素肽。 ( 2 ) 离子交换色谱( i e c ) i e c 按物质所带电荷的差异而加以分离的一种方法。可分为阴离子交换色 谱与阳离子交换色谱两大类。根据所需分离的多肽类物质的性质选择合适的离 子交换剂与洗脱条件，其中洗脱剂的p h 值和离子强度是对分离过程影响最大 的两个因素。 ( 3 ) 反相分配色谱( r p l c ) r p l c 主要用于分子量低于5 0 0 0 的小分子多肽的分析和纯化，是根据溶质、 极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱模式【2 。7 1 。 ( 4 ) 高效液相技术( h p l c ) h p l c 作为高效的分离纯化技术是多肽类物质纯化的一个有力手段。尚庆 s 坤等应用h p l c 分离虻虫中的多肽样品，收集到了4 种主要成分，经检测各组 分均达到很高的纯度。由于8 0 年代解决了载体制造中的刚性问题，色谱中的各 种载体在h p l c 中都能应用 2 8 - 2 9 。 1 3 2 2 毛细管电泳( c e ) c e 是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离 技术。毛细管电泳具有多种分离模式：毛细管等电泳( c i t p ) 、毛细管区带电泳 ( c z e ) 、毛细管等电聚焦( c i e f ) 等。应用毛细管电泳分离多肽类物质具有分析 时间短、柱效高、所用样品量和试剂少等优点。黄志东等使用m e c c 在8 m i n 分离了7 种肽类物质。与h p l c 相比，c e 的制各总量低，只适用于微量制备； 对于扩散系数小的生物大分子，c e 比h p l c 的分辨率高得多，因此c e 作为微 量制备手段被用来收集非常纯的单一馏分【3 们。 1 3 3 抗氧化肽的国内外研究现状 纵观国内外对抗氧化性物质的研究，主要来源有如下几个方面：食物、蛋 白质水解物、氨基酸、香辛料、中草药、及m a i l l a r d 反应产物、微生物和藻类 等f 3 。无疑水解蛋白、氨基酸方面的是抗氧化性物质的主要来源之一( 魏安池， 2 0 0 0 ) 。韩国的s e 。k w o nk 等人利用该国丰富的鱼类资源，从鱼类加工厂的废弃 鱼皮中经三步酶解反应制得了抗氧化肽( s e k w o nk i me ta l ，2 0 0 1 ) ，s u c t s u n a - k ( 2 0 0 0 ) 从沙丁鱼、k a n i os u e t s u n a ( 2 0 0 0 ) 等人从酪蛋白、m a k a t o h a t t o r i ( 1 9 9 8 ) 等人从不溶性弹性蛋白中利用酶或h c l 水解都得到了抗氧化肽【1 2 j ；在阿拉斯加 青鳍鱼( j a c y o u n ge ta l ，2 0 0 5 ) 、c a p c l i n 鱼( a m a r o w i e z & s h a h i d i ，1 9 9 6 ) 、发酵蚌 的寿司( n i r a n j a ne ta l ，2 0 0 4 ) 3 2 】，蛋黄水解物( s e n j is a k a n a k ae ta l ，2 0 0 3 ) p 3 。， 鹿肉蛋白( e u n k y u n gk i m e ta l ，2 0 0 8 ) 【3 4 】等产物中均发现了具有抗氧化作用的 活性肽。 国内近几年也在植物与动物水解蛋白的抗氧化肽方面做了大量研究：如沈 蓓英( 1 9 9 6 ) 通过酸性蛋白酶解大豆蛋白获得抗氧化肽；郭兴凤( 2 0 0 4 ) 通过 碱、中性蛋白酶解菜籽蛋白获得抗氧化肽；许庆陵( 2 0 0 4 ) 通过木瓜蛋白酶解 鲢鱼获得抗氧化肽；阎欲晓( 2 0 0 4 ) 通过木瓜、酸性蛋白酶解文蛤肉获得抗氧 化肽；胡文琴( 2 0 0 4 ) 通过木瓜蛋白酶解酪蛋白获得抗氧化肽。但国内在抗氧 化肽的研究方面仍处于初级探索阶段，具体的水解产物中抗氧化肽的结构、性 质尚无研究，与国外研究存在一定的差距。 随着生物工程技术( 包括上游技术和下游技术) 的发展，许多种特性各异、 来源不同的商品蛋白酶的出现和酶成本的降低，使利用特定蛋白质资源进行限 制性酶解生产各种生物活性肽已成为可能【3 1 1 。此外，各种新型分离技术( 膜分 离技术、亲和层析技术、离子交换树脂吸附分离技术、等电点分离技术等) 的相 6 继产业化应用，进一步使各种生物活性肽的系列组分分离纯化和富集成为可能。 因此，虽然采用水解蛋白方法获取抗氧化肽还有很多方面需进步深入研究， 可以确信在不久的将来，限制性酶解蛋白的技术将是制备抗氧化肽的一项重要 方法，符合“天然、安全、营养”的食品发展潮流。 1 4 抗菌肽的概况 1 4 1 抗菌肽的生产 多肽抗生素的研究是从2 0 世纪8 0 代开始真正兴起的。1 9 8 0 年b o m a n 等 从美国天蚕蛹中分离得到了具有抗菌活性的多u c e c r p i n s ，a 于次年在( n a t u r e ) 上公布氨基酸序列，同年l e f u r 等从兔的巨噬细胞中分离到一种多肽抗生素 - d e f e n s - i n s ，并于三年后公布了其氨基酸序列。此后，人们从两栖类、真菌、 昆虫、高等植物、哺乳动物及人类体内发现了多肽的抗生素。由于多肽类抗生 素具有很强的抗菌活性，在医疗等领域都能得到广泛应用【3 5 】。 目前，抗菌肽的获得方法主要有以下几种：天然抗菌肽的分离提取法；化 学合成法、基因工程合成法、酶解法【3 6 。3 引。其中蛋白酶酶解法由于成本低，便 于操作，易于实现工业化生产，因此，该方法比较受到欢迎。 l a c t o f e r r i c i n 是从牛乳铁蛋白中得到的活性肽，比乳铁蛋白更加有效抵抗 革兰氏阴性细菌和白色念珠菌的活性。c o r n e l i al i e p k e 等用胃蛋白酶在模拟婴 儿消化道的酸性环境下对人乳进行酶解获得了相当于人乳k 一酪蛋自的6 3 1 1 7 位氨基酸残基的肽，能够抑制革兰氏阴性、革兰氏阳性酵母菌的生长【39 1 。o h a s h i 等研究发现人乳铁乳铁传递蛋白中的y 6 7 9 k b 9 5 短肽和牛乳p 一酪蛋白中的 1 1 3 3 q 7 5 1 短肽可以通过抑制细菌、病毒的半胱氨酸蛋白酶活性而发挥抗菌和 保护肠道的作用，而且由于人体肠道中没有半胱氨酸蛋白酶，所以不会影响人 体对食物蛋白质的消化，抗菌肽类一般都有很高的热稳定性，可以在食物和动 物饲料的加工过程中成为比较理想的防腐剂，应用前景较广泛。 1 4 2 抗菌肽的理化特征及生物学活性 多数抗菌肽的等电点在8 9 1 0 7 之间，水溶性较好。郭玉梅等( 1 9 9 5 ) 报道，家蚕抗菌肽在1 2 1 、1 5 x1 0 5 p a 的高温高压下处理3 0 r a i n 仍能保持原 有活性，说明抗菌肽具有热稳定性。抗菌肽在较大的离子强度和较低或较高的 p h 值下仍可保持较强的活性1 40 1 。此外，部分抗菌肽还有抵抗胰蛋白酶和胃蛋 白酶水解的能力。 抗菌肽的抗菌作用：抗菌肽与传统的抗生素相比，其抗菌作用有以下特点： ( 1 ) 抗菌谱广：对g + 、g 、真菌都具有高效的抗菌作用【4 1 】； ( 2 ) 杀菌快速：大多数抗菌肽都可以在5 r a i n 引起细胞的死亡； ( 3 ) 不产生耐药性【4 2 j ； 7 ( 4 ) 无致畸作用； ( 5 ) 作用专一：肿瘤细胞、原核生物与正常的真核细胞膜机构不同，抗菌 肽可以选择地作用于肿瘤细胞、原核细胞，而对正常细胞的作用不明显； ( 6 ) 不易产生蓄积中毒。 抗菌肽的抗肿瘤活性：肿瘤细胞的细胞骨架系统不发达，抗菌肽易插入细 胞脂膜，形成离子通道，破坏肿瘤细胞。大部分化疗药物具有较大的副作用， 往往同时杀害癌细胞与正常细胞，而抗菌肽对人体正常细胞无害，它能特异性 地抑制某些肿瘤细胞的生长，l l 咀g m l 的人源性抗菌肽与肿瘤细胞作用1 4 h 有明 显的杀瘤作用。爪蛙素、天蚕素、鼠抗菌肽n p 2 1 和n p 2 2 及人抗菌肽h n p 2 1 均表 现出对肿瘤细胞如、纤维瘤细胞等的杀伤活性【4 3 1 。 抗菌肽还有抗寄生虫活性、抗病毒活性、促进伤口愈合等生物学活性1 4 引。 1 4 3 抗菌肽的作用机制 形成离子通道进行细胞膜攻击：构成抗菌肽分子的氨基酸大都带正电荷， 它们可以与细菌细胞膜上带负电荷的胞浆磷脂分子形成静电吸附，然后将抗菌 肽分子结合到细菌的脂质膜上。接着，抗菌肽分子的疏水端插入细胞膜中并引 导整个分子进入质膜。由于抗菌肽具有脂水两亲性结构，它能破坏质膜上原有 脂质和蛋白质的排列方式，从而改变膜的构象。这样，多个抗菌肽分子的相互 聚集作用就形成了离子通道【4 5 1 。关于离子通道的形成过程，目前有几种不同的 看法。一种认为，抗菌肽作用于细胞膜是n 端的两亲螺旋结合在细胞膜表面，c 端疏水残基螺旋插入膜中并形成离子通道；而另一种则认为，抗菌肽与细胞膜 蛋白作用引起蛋白质凝聚失活，导致细胞膜变形而形成离子通道。总的来说， 离子通道的形成引起细胞内水溶性物质大量流失，细胞因不能维持正常渗透压 而死t ：1 4 6 】。 诱导细胞凋亡和抑制细胞呼吸：m a i 等研究发现，将抗菌肽d p i 局部注射到 小鼠的体瘤内，d p i 可以迅速诱导小鼠肿瘤细胞凋亡，从而推断诱导细胞凋亡 可能是抗菌肽作用机制中的一种。f e h l b a u m 等在用t h a n a t i n 处理细菌发现，当用 4 0 i t m 的t h a n a t i n 处理大肠杆菌1 h 后，细菌的呼吸作用明显的减弱，处理6 h 后则 停止呼吸作用，因此t h a n a t i n 可能是通过抑制细胞的呼吸作用来杀灭细菌【4 川。 抑制细胞外膜蛋白质及细胞壁的合成：h a r d e r 等研究发现，人的抗菌肽 1 3 - d e f e n s i n 3 能抑制细菌胞壁的形成，使细菌不能维持正常的形态而使其生长受 阻，并使细胞壁穿孔，导致细胞死亡【4 引。c a r l s s o n 等研究发现，a t t a c i n f l 皂够抑制 大肠杆菌细胞外膜蛋白相关基因的转录，从而导致细胞的通透性增加，抑制细 菌的生长。 1 5 立题依据与研究内容 8 1 5 1 立题依据 国内目前的水产品加工企业的产品只有蟹肉罐头，冷冻蟹肉等几个传统的 品种，加工工艺相对简单，整