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福建农林大学硕士学位论文臭氧杀菌结合液氮深冷冻结技术在鲍鱼加工中的应用研究 摘要 为了提高速冻鲍肉的品质，本文研究提供了最优的鲍肉杀菌工艺，建立了臭 氧杀灭微生物的动力学模型，并比较了液氮速冻鲍肉与传统方式冷冻的鲍肉在加 工品质上的差异，为研发一种臭氧杀菌结合液氮速冻新工艺提供初步的理论依 据。研究结果如下： 1 臭氧水减菌研究结果表明：单因素试验确定料水比为1 ：6 。臭氧水应用 于鲍肉杀菌处理的最佳条件是：臭氧水浓度为2 o m g l ，处理时间为8 m i n ，温度 为1 0 。臭氧处理后的鲍肉冻藏品质较好，t v b _ n 值较低。 2 通过臭氧对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌和副溶血弧菌这四种水 产品中常见微生物的杀灭效果研究，建立臭氧水浓度c 与微生物致死率的关系模 c 酚 多环芳香烃 醇 醛 链烷烃【2 9 1 。 3 ) 臭氧的毒性 环境中臭氧浓度高于一定限度，就会对动植物产生毒害作用。d a m e z 等人 3 0 - 3 1 、李怀【3 刁对臭氧的安全使用作了专门的论述。各个国家都对工作环境最高 限量做了规定【3 3 5 1 。 s c o t t 掣3 叼报道，o 0 4 0 0 9 m g m 3 的极低浓度的臭氧就可被人嗅知，所以世界 上使用臭氧虽然有1 0 0 多年的历史，但迄今还没有发现l 例因为臭氧中毒而死亡的 报道事例【3 7 ，3 蜘。 1 3 2 臭氧的灭菌原理及特点 1 3 2 1 臭氧灭菌的原理 臭氧对空气中和水溶液中的微生物都有较为明显的杀菌效果。关于臭氧灭菌 或抑菌机理研究尚无统一的定论，通常认为灭菌作用是物理、化学以及生物学等 方面的综合结梨4 】，作者研究前人的文献，将其作用机制归纳为以下2 点： 其一：通过其分解放出新生态氧并在空间扩散，能迅速穿过真菌、细菌等微 生物的细胞壁、细胞膜，使细胞膜受到损伤，并继续渗透到膜组织内，使菌体蛋 白质变性、酶系统破坏、正常的生理代谢过程失调和中止，导致菌体休克死亡而 被杀灭，达到消毒、灭菌、防腐的效果。 其二：臭氧作为气体消毒剂，其杀菌作用主要为强氧化作用。对于细菌和霉 8 福建农林大学硕士学位论文臭氧杀菌结合液氮深冷冻结技术在鲍鱼加工中的应用研究 菌类的微生物，s c o t t 、l a s h e r 和m u r r a y 等【3 9 删认为臭氧首先作用于细胞膜，使膜 构成成分受损，导致细胞渗透性的变化，最终导致溶菌。k i m 等【4 1 1 的研究表明臭 氧破坏了病毒的核糖核酸( i 斟a ) ，使之失活。臭氧在溶液体系中由臭氧分子直接 反应和臭氧分解成o ) 和但0 2 ) 等自由基的反应，以及附带生成的2 次氧化 剂的反应【4 2 】。 以上关于臭氧杀菌机理的共同点在于臭氧都是作为一个强氧化剂的前提条 件而存在的。不同点在于臭氧是直接作用于微生物的细胞壁或细胞膜上使其发生 溶菌死亡或是穿过细胞壁或细胞膜而作用于微生物内部的蛋白质、酶等，破坏正 常的生理代谢，最终使微生物死亡。 1 3 2 2 臭氧消毒灭菌的特点 臭氧灭菌为溶菌剂方法，杀菌彻底、无残留、广谱杀菌，可以杀灭细菌繁殖 体和芽孢、病毒、真菌等，并可以破坏肉毒梭菌毒素【4 3 1 。它与常规消毒灭菌方 法相比，具有如下特点。 ( 1 ) 广谱性。臭氧是一种广谱杀菌剂，可杀灭细菌繁殖体和芽孢、病毒、真 菌等，并可破坏肉毒杆菌毒素。臭氧在水中杀菌速度较液氯快3 0 0 0 倍以上。 ( 2 ) 高效性。臭氧杀菌速度是急速的，当浓度超过一定阈值后，消毒杀菌甚 至可以瞬间完成。其杀菌效果见表1 。 表1 臭氧灭菌消毒的实验数据 t a b 1e x p e r i m e n t a ld a t ao fo z o n es t e r i l i z a t i o n ( 3 ) 高洁净性。臭氧利用其强氧化性能消毒，不产生有害生成物，剩余臭氧 会自行分解为氧气，因而不产生残余污染。 1 3 3 臭氧的发生技术 根据工作原理的不同，生产臭氧的方法有很多，如：电晕放电法、紫外线照 射法和电解法等等。 ( 一) 电晕放电臭氧制造法( c d 法) 9 福建农林大学硕士学位论文臭氧杀菌结合液氦深冷冻结技术在鲍鱼加工中的应用研究 电晕放电臭氧制造法，o p c d 法( c o r o n ad i s c h a r g e ) ，是模拟自然界雷击放电 产生臭氧的原理制造臭氧，具有产量大的优点，因此在国外多应用于大型市政水 处理，但同时存在臭氧浓度低杀菌效果差，产生对人体和环境有害的氮氧化合物， 高频高压放电危险性高等缺点，不适合应用于食品工业。 ( 二) 紫外线臭氧制造法t t r v 法) 此方法是利用光波中的紫外光会使氧气分子分解并聚合成臭氧，大气上空的 臭氧层即是由此产生的。但是，存在臭氧发生量小，核心部件紫外灯管寿命短， 缺点。此种方法目前在国内主要应用于水消毒，或者实验室杀菌消毒，无法应用 于食品领域。 ( 三) 电解式臭氧制造方法 电解式臭氧制造方法分为化学电解和膜电解法等。其中，膜电解法是运用“膜 电极电解纯水技术 产生纯的臭氧和氧气，采用低压直流电导通特制的固态膜电 极正负两极电解去离子水，使水在特制的阳极界面上失去电子使氢氧分离，氧在 高密度电流作用下获得能量，并聚合成臭氧。 1 3 4 臭氧浓度的测定 目前，分析臭氧水浓度的方法很多，碘量法、紫外分光光度法、电化学法等。 ( 一) 碘量法 碘量法已成为美国等国家的标准方法，但这些方法都不很理想。 ( 二) 紫外吸收法 由于臭氧的不稳定、分解较快使得紫外吸收法的准确度较低，臭氧分子在 2 5 4 7 n m 处的直接紫外吸收受到来自同一吸收波长区域的溶解有机物或无机物的 潜在干扰，加之l 1 v 臭氧分析仪设备费用较高，其应用受到了较大限制。 ( 三) 靛兰法 测定臭氧浓度( 依据臭氧可以定量地使靛兰脱色的原理) 干扰少、准确度高且 快速，德国和瑞士已将其列入国家标准方法。利用还原性染料靛蓝与臭氧具有较 高的氧化还原反应速率采用比色测定。测定中他们通过标定臭氧标准溶液的浓度 求得标准工作曲线，但臭氧标准溶液的浓度难于测定准确，使系统误差较高根 据臭氧与靛蓝二磺酸钠( i d s ) i ：2 的摩尔反应关系，通过对靛蓝二磺酸钠溶液的 浓度而求得液相中臭氧的浓度【4 5 1 。 l o 福建农林大学硕士学位论文臭氧杀菌结合液氮深冷冻结技术在鲍鱼加工中的应用研究 1 4 臭氧在水产品保鲜加工中的应用 1 4 1 臭氧在水产品保鲜加工中的应用现状 国外早在19 3 6 年就开始对臭氧杀菌技术进行研究，s a l m o n 等用臭氧化水 洗涤鱼类及对贝类进行消毒净化。随后很多学者也在水产品上进行了研究 4 7 - 4 9 。 目前国内用臭氧处理的鱼种比较多，包括鳗鱼、比目鱼、章鱼、鱿鱼、金枪 鱼等。贝类有毛蚶、魁蚶、杂色蚶、蛏、文蛤等。虾蟹类主要是虾仁。臭氧不仅 能有效地杀灭鱼贝类表面的微生物，可以有效保持鱼贝类的鲜度，可以有效分解 鱼贝类及加工品的异臭等。另外臭氧还能用于降解水产品中的农残【5 0 5 。目前研 究较多的是臭氧降解果蔬表面的农残【5 2 ，5 3 1 。农药的结构式中含有磷氧双键、碳碳 双键或苯环结构。在臭氧强大的氧化作用下，双键断裂，苯环开环，农药的分子 结构被破坏。臭氧氧化农药的产物是酸类、醇类、胺类或相应的氧化物等低分子 化合物。这种打断连接键和基团氧化的双重作用使得上述物质的分子结构发生彻 底改变，从而起到解毒、降农残的作用【蚓。孙爱东等【5 5 】做了臭氧在出口小龙虾 生产中降解氯霉素、农残及杂菌应用的研究，研究结果表明将臭氧技术运用在小 龙虾生产工艺上，不仅可以起到杀菌作用，而且对农残、氯霉素都具有较好的降 解效果，同时它还具有作用时间短、无残留、运营成本低廉等特点。 1 4 2 臭氧水用于水产品保鲜加工处理的影响因素 水量与水产品处理量之间的比例关系、臭氧水浓度、处理时间、水温、酸碱 度、有机物等对臭氧杀菌效果有很大影响，其主要表现如下： ( 一) 臭氧水浓度对杀菌效果的影响 渔获后的水产品表面带有细菌，臭氧可以充分发挥其杀菌优势，但水产品本 身也是由有机质构成，也有可能成为臭氧的作用对象，因此在利用臭氧处理水产 品的时候，应注意臭氧的浓度，以免对水产品造成不利的影响。郝淑贤【蚓方敏 等【矧研究用不同浓度臭氧水对微生物的杀灭效果，表明随着臭氧水浓度的增加， 其杀菌能力增强，但与臭氧单独作用于单一菌体溶液的杀菌效果存在较大的差异 【5 刀。对于浓度的研究，由于水产品材料的不同，所用的浓度差别较大，低的可 用0 1 m g l ，高的可用3 0 m g l p 副。 ( 二) 臭氧水温度、处理时间和酸碱度对臭氧杀菌效果的影响 用臭氧处理水产品，温度低则杀菌效果好。当处理温度低于1 0 ，杀菌能 福建农林大学硕士学位论文臭氧杀菌结合液氮深冷冻结技术在鲍鱼加工中的应用研究 力较强；而高于1 0 c 时，杀菌能力明显降低。因为在相对较高的温度条件下，臭 氧易分解成氧气，有效臭氧水浓度降低，灭菌效果明显下降，处理时间则要相应 地延长。有研究表明【5 9 1 ，臭氧水浓度较低( o 3m g l ) 时温度对其杀菌效果有影 响。随温度的升高，杀灭率略有降低( p o 0 1 ) ，而对较高浓度的臭氧水( o 6 r a g l ) ，温度的影响不明显。浓度和p h 值对臭氧杀菌效果也有影响。王芳等【删 的研究表明，臭氧水在低浓度时( o 4 m g l ) ，p h 值对其杀菌效果有影响，随p h 值升高，杀灭率略有下降( p f 0 0 1 ( 4 ，l o ) = 5 9 9 ) ， 即不同料水比对臭氧杀菌的效果影响极其极显著。 表2 3 不同料水比细菌对数值多重检验 t a b 2 - 3m u l t i - c o m p a r i s o no fl o g ( c f u g ) i nd i f f e r e n tg r o u p s 注：不同小写字母表示在p = 0 0 5 水平上差异显著，不f 司大写字母表不在p = o o l 水平上差异显著 在方差分析的基础上，把处理后的细菌菌落总数对数减少值取平均数，用多 重检验方法来确定最佳的处理料水比。由表2 3 可知，在料水比1 ：2 到l ：6 范 围内，菌落菌落总数随水量的增加而减少，臭氧水量的变化会对杀菌效果产生显 著性影响；而当料水比在l ：8 到1 ：1 0 时，有足够的臭氧与细菌进行作用，几乎 可将鲍肉表面的细菌杀灭。因此，料水比为l ：8 ，1 ：1 0 时对鲍肉杀菌效果不会 产生显著性区别，这与鲍肉周边皱褶结构有关系，这种皱褶结构使臭氧不能与细 菌充分接触，对细菌起了保护作用，故臭氧无法完全杀灭所有细菌。所以当臭氧 水量与鲍肉投放量的比例升高时，菌落总数降低的趋势较为缓慢。因此可确定鲍 肉投放量与臭氧水量之间的比例1 ：6 为最合理。 2 412 臭氧水浓度对鲍肉细菌菌落总数的影响 本实验在料水比为l ：6 ，处理时间l o m i n ，处理温度为1 0 的条件下，分别 用浓度分别为0 5 m g l ，l m g l ，1 s m g l ，2 m g l ，2 5 m g l 的臭氧水处理鲍肉， 其经臭氧处理后鲍肉中的细菌总数变化与臭氧水浓度之间的关系如下图2 2 所 示：鲍肉中的细菌菌落总数随着臭氧水浓度的升高而不断减少，也就是说臭氧水 浓度越高杀菌的效果越好，当臭氧水浓度达到2 5 m g l 时，细菌菌落总数对数值 2 0 福建农林大学硕士学位论文臭氧杀菌结合液氮深冷冻结技术在鲍鱼加工中的应用研究 下降了1 3 。其中当臭氧水浓度在o 2m g l 之间时，细菌菌落总数下降趋势较为 明显，2 2 5m g l 之间，细菌菌落总数减少值随着浓度变化不大。从此可知，可 选择2m g l 臭氧水浓度处理鲍肉，不但经济且杀菌效果好。 裔 芸 3 要 氟 蘧 榱 粗 o o 51 1 5 2 2 5 3 臭氧浓度( r a g l ) 图2 2 不同臭氧水浓度对细菌菌落总数的影响 f i g 2 - 2 e f f e c t so fo z o n a t e dw a t e rd e n s i t yo nt m g ( c u f g ) 2 4 1 3 臭氧水处理时间对鲍肉细菌菌落总数的影响 q ， - 3 呻 h 籁 ：碹 键 翘 处理时间m i n 图2 - 3 不同处理时间对细菌菌落总数的影响 f i g 2 - 3e f f e c t so fd i f f e r e n tt h n e so nl o g ( c u f g ) 本实验在料水比为1 ：6 ，臭氧水浓度为2 m g l ，温度为1 0 的条件下，用臭 氧水处理鲍肉时间分别达2 、4 、6 、8 和1 0r a i n 后，比较时间对杀菌效果的影响。 经臭氧水处理后鲍肉中的细菌菌落总数减少值与臭氧水处理时间之间的关系如 下图2 3 所示：从图2 3 可以看出，在臭氧杀菌过程中，随着臭氧水处理时间的 不断增加，鲍肉中的细菌菌落数相应不断减少，即致死率不断提高，表明随着臭 2 l 5 5 4 5 3 5 2 4 3 2 福建农林大学硕士学位论文臭氧杀菌结合液氮深冷冻结技术在鲍鱼加工中的应用研究 氧水处理时间的增加，对微生物的杀灭效果明显增强。当处理1 0 r a i n 时，细菌菌 落总数对数值减少了1 2 6 。其中，当在臭氧水浓处理时间在0 8 m i n 之间时，细菌 菌落数下降趋势较为明显，当臭氧水处理时间在8 1 0 m i n 之间时，细菌菌落数下 降趋势变得较缓慢。从此可知，可选择臭氧水处理鲍肉时间为8 r a i n 。 2 4 1 4 臭氧杀菌工艺优化 臭氧水浓度a 、处理时间b 、处理水温度c 做三个因素二水平的正交试验， l 8 ( 2 7 ) ，各因素和水平如表2 - 4 所示，处理后测定细菌菌落总数，结果如表2 5 所 示。对表2 5 进行方差分析，由于初次计算得到b c 交互不显著，故将其列为 误差列，然后再次进行方差分析，分析所得结果如表2 - 6 所示。 表2 - 4 试验因素和水平 t a b 2 - 4e x p e r i m e n t a lf a c t o r sa n dl e v e l s 表2 - 5 试验方案及试验结果计算表 t a b 2 - 5e x p e r i m e n t a ls c h e m ea n dr e s u l t s 注：a 一臭氧水浓度b - 一处理时间c - 一处理温度。 福建农林大学硕士学位论文臭氧杀菌结合液氮深冷冻结技术在鲍鱼加工中的应用研究 注：表不误差总和，”表不影响极显著( p 2 0 0 1 ) ，表不影响显著( p = o 0 5 ) 由表2 - 6 可知，因素a 达到极显著( p 0 0 j ) ，因素b 达到显著水平 ( o o l p 0 0 5 ) ，即臭氧水浓度与臭氧水处理时间对细菌菌落总数变化有显著影 响。a b 也有显著影响( o 0 1 p 0 0 5 ) ，即处理时间与处理浓度之间的交互作用 对细菌菌落总数变化也达到显著水平。试验结果表明：影响杀菌效果的主次顺序 是：a - b a b 。 最优条件确定：因为b c 不显著，所以确定因素的优水平时可以不考虑其 的影响。因素a 极显著，因素b 和a b 达到显著，因为在主次顺序中，a x b 排在a 和b 之后，优先考虑a 和b 的优水平。a 和b 的优水平确定了，其搭配也随 之确定了，不必再通过a 、b 的二元表确定a 和b 的搭配了。通过比较k l a 和k e n ， 可确定优水平为a 2 。同理，可确定b 的优水平为b 2 。由于臭氧的浓度较高，因此 处理水温度的影响并不显著，时间的影响也只有达到显著水平。因此采用比较低 的温度，即1 0 的臭氧水进行处理，低温还可降低臭氧自身的降解速度。由此得 到，最优组合确定为a 2 8 2 c 1 ，即臭氧水浓度为2 0 m g l ，处理时间8 m i n ，处理温 度1 0 。 正交试验结果说明：( 1 ) 臭氧水浓度对杀菌效果有极显著( p 0 0 1 ) 影响，而处 理浓度c 和时间的交互( a b ) 仅达到显著( o 0 1 p 0 0 5 ) ，是因为鲍肉肉为块状 结构，表面的大部分较为光滑，只在周边存在褶皱结构，臭氧可以在较短的时间 2 3 福建农林大学硕士学位论文臭氧杀菌结合液氮深冷冻结技术在鲍鱼加工中的应用研究 内与微生物作用，处理时间的影响相对较小。( 2 ) 在低于1 5 c 的条件下，处理温 度对菌落总数的影响是不显著的，温度与浓度的交互列也不显著。 2 4 2 臭氧水处理对鲍肉t v b - n 值的影响 总挥发性盐基氮( t v b - n ) 是指动物食品由于肌肉中的内源酶或细菌的作用， 蛋白质分解而产生的氨以及胺类等碱性含氮挥发性物质。水产品中t v b - n 值和鲜 度感官评定之间有很高的相关性7 5 1 。因此t v b - n 值被广泛作为判断水产品腐败 程度的重要指标。按照我国水产品鲜度的国家标准g b2 7 3 3 2 0 0 5 1 7 6 d 尸对淡水鱼鲜 度的限定：t v b - n ( m g l o o g ) 1 3 为一级标准，t v b - n ( m g l o o g ) 弋 2 0 为二级 标准。 本实验将待测的鲍肉分为两组，第一组鲍肉，运用经过正交水平优选的臭氧 处理方法，即把新鲜鲍肉肉在臭氧水浓度为2 0 m g l ，温度1 0 下处理8 m i n ；第 二个空白组为未经过任何处理的鲍肉。把这两组鲍肉分别在1 8 。c 的冰柜中贮藏2 个月，2 个月后在室温下解冻l h 后测定鲍肉中的t v b - n 值，考察臭氧处理对鲍肉 肉品质的影响。结果如表2 7 所示，可看出臭氧处理过鲍肉解冻后的t v b - n 值比 未经任何处理的组低。 表2 7 解冻后鲍肉中t v b - n 的测定值 t a b 2 7r e s u i t so ft v b nv a l u e si na b a l o n e 变异来源平方和自由度均方f 值显著水平 对表2 7 中的t v b - n 值进行单因素f 检验，结果如表2 8 。由表2 8 可以看出臭 氧处理组和空白组t v b - n 值的差异达到极显著水平( p 0 0 1 ) ，臭氧处理组t v b - n 值明显低于空白组。t v b - n 值的变化主要是微生物作用肌肉中蛋白质，使其分解 2 4 福建农林大学硕士学位论文臭氧杀菌结合液氮深冷冻结技术在鲍鱼加工中的应用研究 而产生的氨以及胺类等碱性含氮挥发性物质的结果。说明在冻藏前臭氧水处理 后，能显著地减少鲍肉肉表面的细菌菌落总数，以及有效抑制在冻藏过程中微生 物分解蛋白质作用。因此，用臭氧水处理的鲍肉组在贮藏解冻后蛋白质被分解率 低于空白组，说明臭氧处理后细菌菌落数量增长较少，能更好得降低鲍肉品质劣 变，更好得保持鲍肉原有色泽和新鲜风味。 2 5 本章小结 2 5 1 鲍肉投放量与臭氧水量的比例关系 本章研究确定，要达到最好的杀菌效果，鲍鱼投放量与臭氧水量的最佳比例 为1 ：6 。 2 5 2 臭氧水浓度、处理时间、处理温度对鲍肉杀菌效果的影响 臭氧具有较好的杀菌作用，但是臭氧水浓度必须达到一定值，而且要有足够 的作用时间，否则难以保证杀菌效果【7 7 1 。试验结果说明臭氧水浓度和处理时间 对臭氧杀菌效果有影响，臭氧杀菌的最优条件为：臭氧水浓度2 0 m g l 、作用时 间8 m i n ，处理温度为1 0 。 2 5 3 冻藏鲍肉解冻后t v b - n 值的变化 实验结果说明：冷藏前用臭氧处理鲍肉能显著地减少菌落总数，达到控制解 冻后鲍肉品质劣变的目的。臭氧的氧化性很强，可以起到杀灭微生物的作用，但 是如果长时间的处理会对机体造成伤害，如何控制好处理时间是每个臭氧杀菌试 验的重要环节，因此，臭氧水用于鲍肉处理时对鲍肉组织影响的浓度域值有待于 进一步研究。 福建农林大学硕士学位论文 臭氧杀菌结合液氮深冷冻结技术在鲍鱼加工中的应用研究 第3 章臭氧对微生物致死动力学研究 3 1 前言 臭氧对空气中和水溶液中的微生物都有较为明显的杀菌效果。关于臭氧灭菌或抑 菌机理研究尚无统一定论。关于臭氧杀菌机理的共同点在于臭氧都是作为一个强 氧化剂的前提条件而存在的；不同点在于臭氧是直接作用于微生物的细胞壁或细 胞膜上使其发生溶菌死亡或是穿过细胞壁或细胞膜而作用于微生物内部的蛋白 质、酶等，破坏正常的生理代谢，最终使微生物死亡。 本研究以水产品中常见腐败菌大肠杆菌以及沙门氏菌、副溶血弧菌、金黄色 葡萄球菌等致病菌为对象，在一级动力学方程的基础上，研究臭氧浓度和处理时 间对这四种微生物的致死作用，并推导获得微生物存活率分别和臭氧浓度c 以及 处理时间t 关系的数学模型，并对数据进行函数拟合，以此来分别分析试验中臭 氧浓度c 和处理时间t 与微生物的存活率s 的关系。 3 2 实验材料、试剂与设备 3 2 1 实验原料 与第二章的2 2 1 相同 3 212 微生物 大肠杆菌：福建农林大学食品科学学院微生物实验室提供 副溶血性弧菌：福建农林大学食品科学学院微生物实验室提供 金黄色葡萄球菌：福建农林大学食品科学学院微生物实验室提供 沙门氏菌：福建农林大学食品科学学院微生物实验室提供 3 2 2 试剂 牛肉膏、蛋白胨、n a c i 、琼脂 3 2 3 试验设备 与第二章的2 2 3 相同 2 6 福建农林大学硕士学位论文臭氧杀菌结合液氮深冷冻结技术在鲍鱼加工中的应用研究 3 3 实验方法 3 3 1 测定方法 3 3 1 1 臭氧水制备与浓度测定 与第二章的2 3 1 相同 3 3 1 2 微生物的培养与测定 1 ) 营养琼脂培养基制各： 称取4 5 9 营养琼脂，加入蒸馏水1 0 0 0 m l ，加热煮沸，使营养琼脂溶化，分 装到试管( 灭菌后排成斜面) 或三角瓶中，1 2 1 高压灭菌3 0 m i n 。 2 ) 微生物培养 将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血性弧菌分别先进行试管菌 种的活化培养，做成斜面保存。四种微生物均可在牛肉膏蛋白胨培养基( l b ) 中生长，其中副溶血弧菌为嗜盐菌，培养基的食盐浓度调整为3 5 。 细菌悬液的制各：将菌种接种到无菌水中混匀，2 7 恒温培养1 2 h ，使菌落 数达到1 0 4 , - - , 1 0 6 e f u m l 。其中副溶血弧菌悬液的食盐浓度调整为3 5 。 鲍肉接种：将经过前处理的新鲜鲍肉在细菌悬液中浸泡2 h 。 3 ) 微生物的数量测定 与第二章的2 3 2 相同 3 3 2 试验设计 3 3 2 1 臭氧浓度对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血弧菌的致死 动力学研究 采用料水比为1 ：6 ，处理时间l o m i n ，处理温度为1 0 的条件下，臭氧水 处理鲍肉中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血弧菌，浓度分别为 0 5 m g l ，l m g l ，1 5 m g l ，2 m g l 以及2 5 m g l ，研究臭氧浓度对微生物存活 率的影响。 3 3 2 2 处理时间对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血弧菌的致死 动力学研究 现将臭氧水浓度设置为2 m g l ，温度为i o c ，臭氧处理鲍肉中大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血弧菌时间分别为2 、4 、6 、8 和1 0 m i n ，研 究臭氧处理时间对微生物存活率的影响。 2 7 福建农林大学硕士学位论文臭氧杀菌结合液氮深冷冻结技术在鲍鱼加工中的应用研究 3 3 3 微生物失活动力学模型的建立以及数据处理方法 3 3 3 1 臭氧水浓度c 与微生物失活动力学关系模型的建立 微生物的存活率与处理的臭氧浓度c 直接相关。假设臭氧水浓度低于某个 值时，对微生物没有杀灭作用，臭氧水浓度达到这个值时才开始对微生物有致死 作用，则称该值为临界臭氧水浓度，用c c 表示。 当c ，c c 时时，微生物失活数量随臭氧浓度的变化而变化。假设 微生物失活数量随臭氧浓度变化程度与微生物的数量成正比，即呈一级反应关 系，比例系数为k 。即可表示为d n i d c = 一k n ，负号表示随着臭氧浓度c 的上 升，微生物的数量减少。将以上二式合并在一起在经过一系列的数学方法处理， 就得到了一个分段函数来表示臭氧浓度对微生物的致死动力学方程： 旦：1 n o 瓦n = 州一七( c c c ) ) c g c c c ( 3 - 1 ) n n 一微生物的存活率，n o 和n 分别表示臭氧水处理前后的微生物数量； k 一回归系数，表示微生物对臭氧敏感性的参数，值越大表示微生物对臭氧越 敏感，其与微生物的种类和介质有关； c 臭氧浓度； c 为临界臭氧浓度，表示臭氧对微生物致死的最低浓度。 用臭氧水处理一定是时间，将不同臭氧浓度下微生物的存活率n n o 与对应 的臭氧浓度c 按进行拟合，得到回归系数k ，臭氧水浓度界c 0 ，也是分段函数 的交点。 3 3 3 2 处理时间t 与微生物失活动力学关系模型的建立 假设微生物存活率s 的自然对数与时间成一级动力学关系： d i n s ， 一= 一石衍 ( 3 2 ) 式( 3 - 4 ) 为微生物存活率和处理时间t 关系的数学模型。 福建农林大学硕士学位论文 臭氧杀菌结合液氮深冷冻结技术在鲍鱼加工中的应用研究 s2 t p 2 ( 3 3 ) s 微生物的存活率，s = n o n ，n o 和n 分别表示臭氧水处理前后的微生物数 量； 毛表示回归系数； 七2 表示微生物对臭氧敏感性的参数，其值越大表示微生物对臭氧越敏感； t 是处理时间 3 3 3 3 数据处理 测定和分析结果采用s p s s l 2 0f o rw i n d o w s 和e x c e l 进行处理，致死动力学 曲线用m a t a l a b 软件进行拟合。 3 4 结果与分析 3 4 1 臭氧水浓度c 与微生物存活率关系的模型 3 4 1 1 大肠杆菌与臭氧水浓度c 的关系的模型 吴氧：限度( m g ，l ) 图3 - 1 臭氧水浓度对大肠杆菌致死作用的拟合曲线 f i 9 3 - lm o d e lc u r v eo fi n a c t i v a t i o ne f f e c to fo z o n ec o n c e n t r a t i o no fo ne c o l i 已知大肠杆菌n o = 2 0 0 0 0 0 ，可求得不同臭氧水浓度下n n o ，再按方程( 3 1 ) 通过m a t l a b 软件拟合得该方程的2 个参数，k = 5 3 6 8 5 ，临界臭氧浓度c = o 1 9 0 8 m g l ，因此臭氧浓度对大肠杆菌致死动力学方程可以表示如下： 福建农林大学硕士学位论文臭氧杀菌结合液氮深冷冻结技术在鲍鱼加工中的应用研究 旦：1c 沙门氏菌c c = o 1 8 3 4m g l 副溶血弧菌c c = o 1 6 4 3 r a g l ；四种微生物回归系数七的比较如下：金黄色葡萄球菌k = - 3 8 9 9 3 大肠杆菌 k = - 5 3 6 8 5 沙门氏菌 副溶血弧菌。 2 本章通过建立微生物存活率臭氧水处理时间与大肠杆菌、金黄色葡萄球 菌、沙门氏菌、副溶血弧菌存活率关系的数学模型，得到臭氧水处理时间对微生 物的致死作用的数学模型s = 毛p 。2 。四种微生物回归系数七的比较如下：金黄 色葡萄球菌k 2 = o 0 1 3 1 大肠杆菌乞= o 0 1 7 大肠 杆菌 副溶血弧菌。 金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌和副溶血弧菌这四种微生物的菌体大 小无显著差异，只有金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性菌，其他三种属于革兰氏阴 福建农林大学硕士学位论文臭氧杀菌结合液氮深冷冻结技术在鲍鱼加工中的应用研究 性菌。革兰氏阳性菌细胞壁较厚，具有( 2 0 8 0 h m ) 致密的肽聚糖层，多达2 0 层， 这些厚实、坚韧的外被，起到了固定细胞外提高机械浓度保护细胞的作用，阳性 菌含有磷壁酸，防止胞壁过度降解和壁溶，并且它也是细胞壁刚性的主要成分； 而革兰氏阴性菌的细胞壁薄且结构复杂，肽聚糖层较少或仅有单层，且不含胞壁 酸。四种微生物结构图