（内科学专业论文）氯离子通道tmem16a对急性肺损伤的影响.pdf

目录 i if ii iii i ii if 11 1lu i y 19 012 91 中文摘要1 英文摘要4 研究论文氯离子通道t m e m l 6 a 对急性肺损伤的影响 前言8刚舌。8 材料与方法8 结果1 6 附图- 1 7 附表2 3 讨论2 4 结论2 9 参考文献3 0 综述氯离子通道在急性肺损伤过程中的作用3 3 致 射4 3 个人简历4 4 生支摘要 氯离子通道t m e m l6 a 对急性肺损伤的影响 摘要 目的：急性肺损伤( a c u t el u n gi n j u r y ，a l i ) 急性呼吸窘迫综合征 ( a c u t er e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m e ，a r d s ) 是指由心源性以外的各种肺 内外因素导致的急性、进行性呼吸衰竭。其发病急、病情重，死亡率高， 临床上主要表现为难治性低氧血症、非心源性肺水肿、肺动脉高压而体循 环低血压。其主要病理生理特点之一为急性肺水肿( a c u t ep u l m o n a r y e d e m a ，a p e ) 。该现象是指由于各种病因导致超常的液体积蓄于肺间质和 或肺泡内，形成问质性和或肺泡性肺水肿。而在对抗发生肺水肿的过程 中，肺泡上皮细胞发挥着不可替代的作用。由于各种直接或间接的作用导 致肺泡上皮细胞受到损伤时，其生理活性丧失：除表面活性物质减少外， 细胞正常容积发生改变，肺泡肺泡细胞膜对于液体的转运功能出现障碍， 从而导致肺泡不能清除多余的液体导致水肿加重。而后两者的作用又与肺 泡细胞膜表面的离子通道有着密切的关系。 在众多的离子通道当中，钠通道对于肺泡液体清除的作用已经被证 实。刘琳等在其实验中也证实了肺泡上皮细胞中存在着水通道1 ( a q p l ) ， 并且其在a r d s 状态下显著下降n 1 。而做为生物体内含量丰富的氯离子通 道却一直被人们所忽视。直到近年来人们才逐渐对氯离子通道关注起来。 先后发现了钙激活氯通道( c u r r e n t sm e d i a t e db yc a l c i u m a c t i v a t e dc h l o r i d e c h a n n e l s ( c a c c s ) ) 、容积( 或称体积) 调控性氯通道( v o l u m e r e g u l a t e da n i o n c h a n n e l s ，v r a c ，i c l 骶1 1 ) 通道、电压门控性氯通道( v o t a g e 2 9 a t e dc h l o r i d e c h a n n e l sc 1 cf a m i l y ) 、c a m p 蛋白酶激活的氯通道、配体激活的氯通道等。 其功能多种多样，其中有少数关于c f t r ( c y c t i cf i b r o s i st r a n s m e m b r a n e c o n d u c t a n c er e g u l a t o r ) 钙激活氯离子通道在肺泡液体清除中的报道。也有 容积调控性氯通道对细胞正常生理功能的维持作用。但是尚未有足够的人 重视起其在急性肺损伤过程中的作用。 本课题选择了t m e m l 6 a 作为研究的对象。因为t m e m l 6 a 是2 0 0 8 年才被正式报道的一种新颖的钙激活氯离子通道，主要有以下几个特点： 1 作用众多。如对小鼠气道的形成，减少气道粘液分泌，信号传导等方面 均有作用，并且兼有容积调控功能。2 人体内含量丰富，并且在多种组织 表达。3 有可用的特异阻断剂，如尼氟灭酸( n f a ) ，这是很多实验必备 的条件。4 小鼠基因序列与人同源性高，达9 1 。5 具有其它t m e m l 6 家族蛋白不具有的分子特性。6 有其它氯离子通道研究作为基础。7 潜在 的钙激活氯通道的分子基础。 有文献证明氯离子通道在急性肺损伤时对肺泡液体清除存在着一定 作用，而且在前期预实验当中我们发现：t m e m l 6 a 在急性肺损伤过程中， 其表达量会因疾病受到影响。因此我们选择复制了两种本实验室相对成熟 的急性肺损伤大鼠模型：大肠杆菌( e c o l i ) 气道注入和脂多糖( l p s ) 尾静脉注射模型，分别模拟肺内外源性急性肺损伤过程。比较两种肺损伤 发病机制以及不同肺损伤模型中肺组织t m e m l 6 a 的组织含量表达差异。 方法：选取清洁级健康雄性s p r a g u ed a w l e y ( s d ) 大鼠1 8 只，体重2 5 0 1 0 9 ，将其随机分为三组：正常对照组，l p s 干预组，e c o l i 干预组，各 组均为6 只。l p s 组：经尾静脉注射l p s ( 8 m g k g ) ，4 小时后取材。e c o l i 组：大肠杆菌混悬液( 3 m l k g ) ( 浓度1 0 9 级) 气管内缓慢均匀滴入，2 4 小时后取材。造模成功后将动物以1 0 水合氯醛( 3 m l k g ) 腹腔注射麻醉， 固定在手术台上。股动脉放血处死后立即开胸取新鲜肺组织( 右肺下叶， 于冰上操作) ，取材后立即放于已标记好的冻存管中，转移至8 0 冰箱中 保存，留待蛋白印迹( w e s t e r nb l o t ，以下简称w b ) 用。取右肺上叶肺组 织用于湿干重比( w d ) 检测。取右肺中叶肺组织用1 0 中性福尔马林溶 液固定，留做病理及免疫组织化学检查。分离出气管，做“t 字型倒切 口，行气管插管。用无菌生理盐水4 m l 行支气管肺泡灌洗术，使灌洗液 在肺内停留2 0 秒左右，期间反复摇晃手术台，使灌洗液尽可能渗透至肺 泡腔内。如此反复3 次，回收灌洗液，过滤后离心( 1 2 0 0 r p m ，1 0 m i n ) 。 上清液8 0 保存，留待蛋白含量测定。 结果：1w b 结果正常组( 1 5 9 9 - j ：0 1 4 2 ) 及l p s 组( 1 6 5 2 0 0 3 6 ) 之间无统计学差异( p o 0 5 ) ，而大肠杆菌组( 1 1 4 9 0 1 2 5 ) 相比其它两 组有明显下降( p 0 0 1 ) 。 3 免疫组化可见肺血管平滑肌细胞及肺泡上皮细胞特异性染色。 4 肺泡灌洗液( b r o n c h o a l v e l o a rl a v a g ef l u i d ，b a l f ) 蛋白含量测定显示 l p s 组( 1 1 5 o 1 2 ) 与大肠杆菌组( o 9 l 0 2 9 ) 均高于正常组( 0 1 7 0 0 5 ) ( p o 0 1 ) ；肺湿干比显示两模型组l p s 组( 5 3 5 0 4 5 ) 与大肠杆菌组 ( 4 6 1 0 1 9 ) 均明显高于正常组( 3 7 9 0 4 2 ) ( p o 0 5 ) c o m p a r e dw i t ht h eo t h e rt w og r o u p s ，t h el e v e lo fe c o l ig r o u p ( 1 1 4 9 + _ _ 0 1 2 5 ) d e c r e a s e so b v i o u s l y ( p o 0 1 ) 2r e s u l to fp a t h o l o g yt h ep a t h o l o g i cg r a d eo ft h et w og r o u p sa r e m u c hh i g h e rt h a nc o n t r o lg r o u p ：l p sg r o u p ( 11 3 3 1 3 7 ) ，e c o l ig r o u p ( 1 1 8 3 o 7 5 ) 3r e s u l to fi m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya l v e o l a ri n t e r s t i t i a la n da l v e o l a r e p i t h e l i a lc e l la r es p e c i f i cs t a i n e d 4r e s u l to fp r o t e i nc o n c e n t r a t i o ni nb a l fa n dw dt h ep r o t e i n c o n c e n t r a t i o no f l p sg r o u p ( 1 1 5 o 1 2 ) a n de c o l ig r o u p ( o 9 1 o 2 9 ) a r e m u c hh i g h e rt h a nc o n t r o lg r o u p ( o 17 0 0 5 ) ( p o o1 ) ；t h ew dl e v e lo f l p sg r o u p ( 5 3 5 o 4 5 ) a n de c o l ig r o u p ( 4 6 1 o 1 9 ) a r ea l s om u c h h i g h e rt h a nc o n t r o lg r o u p ( 3 7 9 0 4 2 ) ( p o 0 1 ) 。 c o n c l u s i o n s ：1w ed u p l i c a t e dt h et w om o d e lg r o u p ss u c c e s s f u l l y t h e ya r es t a b l ea n de a s yt ob eo p e r a t e d t h e i rp r e d i c t i o na n da c h i e v e m e n t t a t i oa r ea l s op e r f e c t s ot t l e ya r eg o o dm o d e l sf o rr e s e a r c ho fa l i 2t h ei m m u n o h i s t o c h e m i s t r ym a n i f e s t a t i o no fl u n gs h o w sp u l m o n a r y v a s c u l a rs m o o t hm u s c l e ( p v s m ) c e l la n da l v e o l a re p i t h e l i a lc e l la r es p e c i f i c 6 芸盍j 商要 s t a i n e di nl p sg r o u pa n dc o n t r o lg r o u p b u tt h es p e c i f i cs t a i no fa l v e o l a r e p i t h e l i a lc e l lc a l lh a r d l yb e s e e ni ne c o l ig r o u p 3t h el e v e lo fp r o t e i nc o n c e n t r a t i o ni nb a l f ( b r o n c h o a l v e l o a rl a v a g e f l u i d ) a n dw da r ei n c r e a s e di nl p sg r o u pa n de c o l ig r o u p s h o w st h a tt h e a f ci sd e c r e a s e di nb o t ht w om o d e lg r o u p s i ti si na c c o r d a n c ew i t ht h e c h a n g eo ft m e m 16 al e v e lo fe c o l ig r o u p 4t h e r ei sn od i f f e r e n c eb e t w e e nc o n t r o lg r o u pa n dl p sg r o u p c o m p a r e dw i t ht h eo t h e rt w og r o u p ，t h el e v e lo fe c o l ig r o u pd e c r e a s e s o b v i o u s l y t h el e v e lo ft m e m 16 ai nd i f f e r e n tg r o u p sc a u s e db yd i f f e r e n t f a c t o r si sd i f f e r e n t i ti m p l i e st h a ta l i a r d si n d u c e db yd i f f e r e n tf a c t o r s c a nc a u s ed i f f e r e n ti n f l u e n c et ot m e m16 a ，s oi ts h o u l db et r e a t e d d i f f e r e n t l y a n dt h ec o m p a r eb e t w e e n l p sg r o u pa n de c o l ig r o u ps h o u l db e s t r e n g t h e n e d k e y w o r d s ：t m e m16 a ；a l i a r d s ；c a c c s ；a f c ；v r a c 7 瑟瘟：硷塞 氯离子通道t m e m i6 a 对急性肺损伤的影响 - - j 一 刖罱 急性肺损伤( a c u t el u n gi n j u r y ，a l i ) 急性呼吸窘迫综合征( a c u t e r e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m e ，a r d s ) 是指由心源性以外的各种肺内外因 素导致的急性、进行性呼吸衰竭。其发病急、病情重，死亡率高，i 晦床上 主要表现为难治性低氧血症、非心源性肺水肿、肺动脉高压而体循环低血 压。而在对抗发生肺水肿的过程中，肺泡上皮细胞发挥着不可替代的作用。 由于各种直接或间接的作用导致肺泡上皮细胞受到损伤时，其生理活性丧 失：除表面活性物质减少外，细胞正常容积发生改变( 肿胀或缩小) ，肺 泡细胞膜对于液体的转运功能出现障碍，从而导致肺泡不能清除多余的液 体进一步导致水肿加重。而后两者的作用又与肺泡细胞膜表面的离子通道 有着密切的关系。在众多的离子通道当中，钠通道对于肺泡液体转运的作 用已经被证实。而做为生物体内含量丰富的氯离子通道却一直被人们所忽 视。t m e m l 6 a 是2 0 0 8 年才被正式报道的一种新颖的钙激活氯离子通道， 有实验证明氯离子通道在肺水清除过程中有一定的作用，为此本实验选择 了t m e m l 6 a 作为研究的对象。 l 实验材料 1 1 实验仪器及耗材 电子天平 微量加样器 电热恒温水浴槽 - - 8 0 低温冰箱 4 c 低温冰箱 制冰机 去离子水仪 p v d f 膜( 孔径为o 2 2pm ) 材料与方法 德国s a r t o r i u s 公司 法国g i l s o n 公司 上海医用恒温设备厂 日本s a n y o 青岛海尔冰箱股份有限公司 美国a f l 0s c o t s m a n 美国p a l l p u r e l a bp l u s 美国m i l l i p o r e 3 m m 滤纸英国w h a t m a n 医用x 射线胶片美国柯达公司 通用显影粉、酸性定影粉天津亨达公司感光材料厂 高速离心机上海医用分析仪器厂 转移脱色摇床海门其林贝尔仪器制造公司 旋涡混匀器北京百晶生物技术有限公司 低温离心机德国s i g m a 公司 凝胶玻璃板、固定夹美国b i o r a d 公司 垂直电泳槽美国b i o r a d 公司 转移电泳槽美国b i o r a d 公司 t m e m l 6 a ( h 4 1 ) 美国s a n t a 公司 t m e m l 6 a ( s 2 0 )美国s a n t a 公司 山羊抗兔i g g ，h r p 北京康为世纪生物科技有限公司 e c l 发光液北京康为世纪生物科技有限公司 膜蛋白提取试剂盒上海生工生物工程有限公司 b c a 蛋白浓度测定试剂盒北京博奥森生物技术有限公司 内参( 1 3 a c t i n )北京中杉金桥生物技术有限公司 m a r k e r ( p r l6 0 0 ) 北京索莱宝科技有限公司 脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ，l p s )美国s i g m a 公司 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ，e c o l i )河北医科大学微生物实验室 麦克奥迪数码成像分析系统厦门麦克奥迪实业集团有限公司 p v - 9 0 0 3 超敏二步法免疫组化检测系统北京中杉金桥 1 2 实验动物 由河北省实验动物中心提供清洁级健康、雄性s p r a g u ed a w l e y ( s d ) 大鼠共1 8 只，体重为2 5 0 1 0 9 。( 合格证号：1 0 1 1 0 3 7 ) 1 3 实验液体的配制 2 mt r i s h c l ( p h 8 8 ) ，lo o m l ：称取2 4 2 9 t r i s 碱；加5 0 m l 蒸馏水； 缓慢的加浓盐酸至p h 8 8 ( 约加4 m 1 ) ；让溶液冷却至室温，p h 值将会升高； 加蒸馏水至1 0 0 m l 。 1 m 嘶s h c l ( p h 6 8 ) ，1 0 0 m l ：称取1 2 1 9 t r i s 碱；加5 0 m l 蒸馏水； 缓慢的加浓盐酸至p h 6 8 ( 约加8 m 1 ) ；让溶液冷却至室温，p h 值将会升高； 加蒸馏水至1 0 0 m l 。 1 0 ( w v ) s d s ，1 0 0 m l ：室温保存。称取1 0 9 的s d s ；加蒸馏水至 总量为1 0 0 m l 。 5 0 ( v v ) 甘油，1 0 0 m l ：取5 0 m l1 0 0 的甘油；加入5 0 m l 蒸馏水。 1 ( w v ) 溴酚蓝，1 0 m h 称取1 0 0 m g 溴酚蓝；加蒸馏水至1 0 m l ， 搅拌直到完全溶解；过滤除去聚合的染料。 丙烯酰胺储存液：2 9 9 丙烯酰胺；l g 甲叉双丙烯酰胺。加蒸馏水至 1 0 0 m l 。4 。c 保存。 4 分离胶缓冲液，1 0 0 m l ： 7 5 m l2 m o l l t f i s h c l ( p h 8 8 )1 5 m o l l ( 终浓度) 4 m l1 0 s d s 0 4 ( 终浓度) 2 1 m l 蒸馏水可在4 度保存数月 4 x 堆积胶缓冲液，1 0 0 m l ： 5 0 m llm o l lt f i s h c l ( p h 6 8 ) 0 s m o l l ( 终浓度) 4 m l1 0 s d s 0 4 ( 终浓度) 4 6 m i 蒸馏水可在4 度保存数月 5 m l1 0 过硫酸铵， o 5 9 过硫酸铵： 5 m l 蒸馏水。4 度保存，新鲜配制。 电泳缓冲液，1 l ： 3 9 t f i s 碱2 5 m m 1 4 4 9 甘氨酸 1 9 2 m m 1 9 s d s o 1 加蒸馏水至1 l ，p h 值应该保持在8 3 左右。也可制成1 0 储存液， 在室温下长期保存。 5 上样缓冲液，1 0 m h 0 6m llm o 儿的t f i s h c l ( p h 6 8 )6 0 m m o l l 5 m l5 0 的甘油2 5 2 m l1 0 的s d s2 0 5 m l2 巯基乙醇 14 4 m m o l l l m l1 溴酚蓝0 1 l o o 9m l 的蒸馏水。4 。c 保存。 0 0 1 m 磷酸盐缓冲液( p b s ) 配制方法： 称取8 9n a c l 、0 2 9 k c l 、1 4 4 9n a 2 h p 0 4 和0 2 4 9k h 2 p 0 4 ，溶于8 0 0 m l 蒸馏水中，用h c l 调节溶液的p h 值至7 4 ，最后加蒸馏水定容至1 l 即可。 t b s 缓冲液 t r i s 碱6 0 5 7 9 ，n a c l 8 7 7 5 9 ，h c i 调p h 到7 4 ，定容到1 0 0 0 m l 。 电转液配方：t r i s - b a s e3 9 ，g l y c i n e1 4 4 9 ，2 0 0 m l 甲醇1 l 。 2 实验方法 2 1 大鼠急性肺损伤模型的建立、分组及标本制备 选取清洁级健康雄性s p r a g u ed a w l e y ( s d ) 大鼠1 8 只，体重2 5 0 - - + 1 0 9 ， 将其随机分为三组：正常对照组，l p s 干预组，e c o l i 干预组，各组均为 6 只。l p s 组：经尾静脉注射l p s ( 8 m g k g ) ，4 小时后取材。e c o l i 组： 大肠杆菌混悬液( 3 m l k g ) ( 浓度1 0 9 级) 气管内缓慢均匀滴入，2 4 小时 后取材。造模成功后将动物以1 0 水合氯醛( 3 m l k g ) 腹腔注射麻醉，固 定在手术台上。股动脉放血处死后立即开胸取新鲜肺组织( 右肺下叶，于 冰上操作) ，取材后立即放于已标记好的冻存管中，转移至8 0 冰箱中保 存，留待蛋白印迹( w e s t e r nb l o t ，以下简称w b ) 用。取右肺上叶肺组织 用于湿干重比检测。取右肺中叶肺组织用1 0 中性福尔马林溶液固定， 留做病理及免疫组织化学检查。分离出气管，做“t 字型倒切口，行气 管托管。用无菌生理盐水4 m l 行支气管肺泡灌洗术，使灌洗液在肺内停 留2 0 秒左右，期间反复摇晃手术台，使灌洗液尽可能渗透至肺泡腔内。 如此反复3 次，回收灌洗液，过滤后离心( 1 2 0 0 r p m ，1 0 m i n ) 。上清液8 0 保存，留待蛋白含量测定。 2 2 蛋白印迹( w e s t e r nb l o t ，w b ) 取2 0 0 r a g 一8 0 c 冰冻保存肺组织，室温融解，按说明书( 上海生工) 做肺组织匀浆及蛋白定量测定( 北京博奥森) 。并分装保存。 制备s d s p a g e 凝胶 ( 1 ) 将灌胶玻璃板洗净，晾干固定，确定灌制分离胶液面标志线( 距 样品梳子底部约0 5 1 0 c m 处) 。 ( 2 ) 配制1 0 分离胶8 m l ( 见下表) ，快速灌入凝胶玻璃槽中，使其液 面至标志线位置( 避免产生气泡) 。 ( 3 ) 立即用去离子水覆盖胶面( 隔绝空气，有助于凝胶聚合) ，室温放 置约4 0 m i n 至分离胶凝固。 ( 4 ) 配制5 浓缩胶4 m l ( 见下表) 。 1 0 分离胶5 浓缩胶 体积8 m l 4 m l4 m l2 m l d d h 2 03 。2 m l1 6 m l2 7 2 m l1 3 6 m l 3 0 丙烯酰胺 2 6 7 m l1 3 3 m l0 6 6 m l0 3 3 m l 1 5 m t r i s - c l ( p h 2 0 m l1 0 m l 8 8 ) 1 0 m t r i s - c l ( p h 0 5 m l0 2 5 m l 6 8 ) l o s d s0 0 8 m l0 0 4 m l0 0 4 m l0 0 2 m l 1 0 a p0 0 8 m l0 0 4 m l0 0 4 m l0 0 2 m l t e m e d3 2l j ll1 6ul4ul2ul ( 5 ) 倒掉去离子水覆盖液，并用吸水纸吸掉残留的液体。将凝胶板重 新垂直放置，轻轻加入5 浓缩胶液( 注意避免产生气泡) ，插入样品梳， 室温凝胶约4 0 分钟。 ( 6 ) 轻轻拔去梳子，将玻璃夹板“凹 面贴紧电泳槽，两侧用夹子很 好的固定在电泳槽上。 样品变性及电泳 ( 1 ) 由8 0 。c 冰箱取出提取的组织总蛋白样品，立即插入冰中( 减少蛋 白降解) 待其融化。 ( 2 ) 根据蛋白定量结果，加入相应体积的总蛋白样品与5 蛋白质凝 胶电泳上样缓冲液，轻轻混合，9 5 变性l o 分钟，立即插入冰中待用。 ( 3 ) 将样品轻轻加至凝胶孔中，电泳仪设置成稳压状态，接通电源， 将电压调至8 0 v 使样品通过浓缩胶与分离胶。电泳使条带跑至分离胶位 置或者m a r k e r 显示分带时，换1 2 0 v ，直至跑完。 凝胶转膜及其检测 凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转 印至固相支持物上，然后分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗 对其进行孵育、检测。用于w e s t e r n 印迹法的固相支持物有多种，本实验 采用p v d f 膜作为固相支持物。本实验采用湿转的转膜方式。 ( 1 ) p v d f 膜的预处理：先置于1 0 0 甲醇中浸泡2 3 分钟，水、电转 液依次漂洗2 分钟2 次，置于电转液中备用； ( 2 ) 剪裁与胶同样大小的6 层滤纸，用转移缓冲液浸泡后待用。 ( 3 ) 取下电泳板，将其平置( 使“凹 面玻璃板在下) ，小心取出夹板 中的垫片及去掉上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用电转液漂洗一 次。 ( 4 ) 将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始， 依次为海绵垫片一3 层滤纸一样品胶一p v d f 膜一三层滤纸( 注意：排除 气泡) 一海绵垫片，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中。 ( 5 ) 正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源， 恒压状态下，6 5 v 转膜2 小时( 此步操作在4 冰箱中进行) 。 ( 6 ) 封闭：小心取出转移膜置于封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动状 态下封闭1 小时。 ( 7 ) 一抗反应：将一抗用封闭液稀释2 0 0 倍；将封闭后的膜直接放入 一抗工作液中，4 反应过夜。 ( 8 ) 洗膜：将反应膜放入平皿中，用1 t b s t 洗涤三次，( 室温下 缓慢摇动洗涤) 每次l o 分钟，洗净未结合的一抗。 ( 9 ) 二抗反应：将二抗用1x t b s t 稀释3 0 0 0 倍；将洗涤后的一抗反 应膜放入二抗工作液中( 室温、避光缓慢摇动) 作用6 0 分钟。 ( 1 0 ) 洗膜：用lxt b s t 洗膜，方法同( 8 ) ，洗去游离二抗。 ( 1 1 ) 曝光及洗片： 按1 ：1 ( v v ) 混合e c l 试剂盒中两种液体。 将上述混合液均匀铺在p v d f 膜表面，室温作用4 分钟。抖掉膜上 液体，将其放入铺有保鲜膜的曝光盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住p v d f 膜。 2 3 石蜡切片的制作方法 取固定于福尔马林溶液中的组织，沿肺门至胸膜最大切面取材，放 8 0 ，9 0 酒精各2 小时，9 5 酒精i4 小时，9 5 酒精i i 过夜。第二天 1 0 0 酒精i3 0 分钟，1 0 0 酒精i i1 小时，松节油i2 0 分钟，松节油i i4 0 分钟，石蜡i2 0 分钟，石蜡i i1 小时，包埋，凝固后修整石蜡块。用石蜡 切片机进行连续切片，厚4 1 m a ，取两张邻片于4 5 温水中展片。载玻片捞 片后干燥。行h e 染色及免疫组化。 2 4h e 染色 切好后的组织切片置入二甲苯i ，二甲苯i i ，1 0 0 酒精i ，1 0 0 酒精 i i 各1 0 分钟，9 5 酒精5 分钟，8 0 酒精5 分钟，取出后自来水冲洗后 再过蒸馏水；苏木素2 4 分钟，取出自来水冲洗；0 5 盐酸酒精溶液分化 l o 3 0 秒，自来水冲洗；氨水返蓝1 0 3 0 秒，充分水洗；o 5 伊红溶液5 0 秒，过水两遍；梯度酒精脱水：7 0 酒精1 分钟，8 0 酒精2 分钟，1 0 0 酒精i5 分钟，1 0 0 酒精i i5 分钟；晾干，中性树胶封片；显微镜下观察。 2 5 免疫组化 将切片附于1 0 0 9 l 多聚赖氨酸的载玻片上，于3 7 温箱内干燥2 小 时。二甲苯i 脱蜡5 分钟，二甲苯i i 脱蜡5 分钟。无水乙醇i3 分钟，无 水乙醇i i3 分钟，9 5 乙醇3 分钟，8 0 乙醇3 分钟。自来水缓慢冲洗3 次，蒸馏水冲洗一次。抗原修复( 导入塑料筒加入抗原修复液高压锅蒸， 有蒸气后2 分钟) ，晾至室温。蒸馏水洗1 次，5 h 2 0 2 室温浸泡5 分钟， 蒸馏水1 次，p b s 浸泡5 分钟。一抗封闭2 小时，p b s 洗5 分钟3 遍， 加酶促结合液3 0 分钟。p b s5 分钟3 遍，d a b 显色，镜下观察显色情 况，决定是否终止。自来水浸泡5 分钟，苏木素5 分钟，水洗5 次。盐酸 酒精快速过1 次，水洗5 次。氨水2 分钟，水洗5 次。8 0 乙醇2 次，9 5 乙醇过一次，无水乙醇i 浸泡5 分钟，无水乙醇i i 浸泡5 分钟。二甲苯i ，i i 浸泡各5 分钟，封片。 2 6 肺湿干重比( w d ) 的测定 将右肺上叶用滤纸吸干表面水分称湿重并记录。之后将肺叶置于烤箱 中( 9 0 ，2 4 h ) ，取出称干重并记录。计算两者比值。 1 4 2 7 肺泡灌洗液蛋白含量测定 以考马斯亮兰法测定，按说明书要求设置空白、标准、测定管。于 波长5 9 5 n m 处，测定吸光度( o d ) 值。按以下公式计算结果： 蛋白含量( g l ) = n 定管吸光度值标准管吸光度值x 标准管浓度( g l ) 2 8 结果判读 2 8 1 病理切片 按照上述h e 染色结果后所得切片进行评分。评分内容见下表： 病理改变0 分1 分2 分3 分4 分 毛细血管无红细胞仅有少数较多几乎充满 淤血管腔 肺泡腔纤 千 少许较多几乎充满 l j 维蛋白渗管腔 出 中性粒细 千 可疑散在小灶状渗大面积渗l 胞渗出出出 气道粘膜 千 可疑局部大面积l j 上皮细胞 脱落 肺泡间隔相对正常稍增宽显著增宽失去正常 增厚结构 2 8 2 蛋白印迹 在内参齐整的情况下，以所得条带灰度值做半定量分析，并以内参校 正后进行统计学处理。 2 8 3 免疫组化 由于背景与染色目标颜色相近，无法进行半定量分析，故仅对所得 切片进行光镜下观察，主要用于分析目的蛋白表达位置及存在性证明。 3 统计学处理 采用s p s s l 3 0 统计软件进行统计学处理，本实验结果均为计量资料 采用均数标准差表示，采用方差分析法，两两比较用s n k 法。以p o 0 1 ) 。说明本次实验造模成功，达到病理学 评分的急性肺损伤程度。并且两组之间病理损伤程度一致，具有横向可比 性。详细统计描述可见t a b l e1 。 3 肺泡灌洗液蛋白含量测定湿干比测定结果 蛋白含量：l p s 组( 1 1 5 4 - 0 1 2 ) 与大肠杆菌组( o 9 14 - 0 2 9 ) 均高于正 常组( o 1 7 o 0 5 ) ( p o 0 1 ) 。 湿干比测定：l p s 组( 5 3 5 0 4 5 ) 与大肠杆菌组( 4 6 1 0 1 9 ) 均明 显高于正常组( 3 7 9 0 4 2 ) ( p o 0 5 ) ，而大肠杆菌组( 1 1 4 9 0 1 2 5 ) 相比其它两 组有明显下降( p 0 0 1v sl p sg r o u p ；p 0 01v sc o n t r o lg r o u p ；p 0 01v sc o n t r o l g r o u p ；p 0 0 5v sc o n t r o lg r o u p ； 讨论 急性肺损伤( a c u t el u n gi n j u r y ，a l i y 急性呼吸窘迫综合征( a c u t e r e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m e ，a r d s ) 是指由心源性以外的各种肺内外因 素导致的急性、进行性呼吸衰竭。其共同病理生理特点之一为急性肺水肿 ( a c u t ep u l m o n a r ye d e m a ，a p e ) 。是由于各种病因导致肺内炎症反应，液 体渗出积蓄于肺间质、肺泡内，形成间质性和或肺泡性肺水肿。当然某 些诱因的肺损伤会伴随严重的远端呼吸道与肺血管、肺泡结构的损伤，使 其恢复更加困难，并易于遗留纤维化等。但肺水肿的程度仍然是预后的早 期决定因素。而在对抗发生肺水肿的过程中，肺泡上皮细胞发挥着不可替 代的作用。由于各种直接或间接的作用导致肺泡上皮细胞受到损伤时，其 生理活性丧失：除表面活性物质减少外，细胞正常容积发生改变( 肿胀或 缩小) ，肺泡细胞膜对于液体的转运功能出现障碍，从而导致肺泡不能清 除多余的液体进一步导致水肿加重。而后两者的作用又与肺泡细胞膜表面 的离子通道有着密切的关系。在众多的离子通道当中，钠通道与水通道已 有文献报道两者均与急性肺损伤有关。而做为生物体内含量丰富的氯离子 通道却一直被人们所忽视。本次实验所做t m e m l 6 a 为2 0 0 8 年新发现的 一种氯离子通道，属于钙激活氯离子通道家族中的一员。 目前急性肺损伤造模的方法多种多样，如油酸模型，骨髓型，脂肪型， 整肺灌洗型等。本次实验采用方法成熟的急性肺损伤造模方法。气管内滴 入l p s 的内毒素模型、及气管内滴入绿脓杆菌混悬液模型是本实验室经 过长期摸索证明能更好的模仿急性肺损伤病因的两种方法，可以很好的复 制肺内外因素导致的急性肺损伤过程，此方法与现今国际认知的急性肺损 伤发病因素分类一致。