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y 6 5 4 4 6 4 四川大学硕十学位论文 固定化硝化细菌处理含氨臭气的研究 化学工艺专业 研究生 曾伟指导教师钟本和教授 由硝化细菌催化氨氮氧化的硝化作用是氮循环的关键步骤， 也是现代生物 法处理含氨臭气的重要环节。以往的生物脱臭研究大多数采用活性污泥进行脱 臭处理，其总体代谢选择性和有效微生物的比例较低。为了提高恶臭气体的生 物处理效率，本论文提出了在填料塔中直接固定化包裹硝化细菌进行氨气脱臭 研究的新方法。 自 然状况下的化能自 养细菌具有生长速率低、生物量小和对环境因子敏感 等生理特点，为了提高硝化细菌的分离效率，需要对自 然界中的硝化细菌进行 富集培养。现有的硝化细菌的富集培养效果的评价方法一般采用mp n 计数法， 即通过直接测定硝化细菌的数量来判断富集培养的效果，这种方法过于复杂。 本文通过化学反应来检测硝化反应，进而根据硝化反应反推硝化菌数量，从府 南河污水和望江公园的鱼塘水中 最终筛选出三株具有较高氨氮去除能力的菌 种，从菌落、菌株形态、革兰氏染色和生理生化反应等方面对这三株菌种进行 了初步的鉴定，鉴定结果表明这三株菌种均属硝化杆菌科。 本文用海藻酸钠和聚乙烯醇等材料固定化包裹硝化细菌，比较其机械强 度、传质性能等因素，最终选定采用9 %的聚乙烯醇和0 .3 %海藻酸钠固定化包 裹硝化细菌。 在填料塔的生物脱臭部分， 重点研究了生物脱臭系统的操作温度、 循环液的p h值、 循环水喷淋密度、进气中n h 3 浓度以 及进气流量等因素对脱 臭效率的影响 ，还对生物脱臭系统的代谢产物进行了 分析。 实验结果表明: 1通过人工筛选硝化细菌，然后在填料塔中固定化包裹硝化细菌处理含氨 若 、 _ ， “劲 抓 、 义公布 固定化硝化细菌处理含氨臭气的研究 臭气在技术上是可行的。 2 在相同的进气流量条件下， n h 3 一去除速度随进气n h 3 一负荷的增大而 增大 ，但存在一个极限值;随着进气流量的增大，生物脱臭系统的脱臭 效 率显 着降 低; 填料塔脱 臭系统 在0 .2 m 3 / h的流量下， 可达到最佳脱 臭效果， 系统的最佳进气n h 3 - n负荷为3 .2 6 m g - n / g 固 定 化颗粒， d。 3生物脱臭系统最适宜的 操作温度范围是2 0 0c - 3 0 0c， 循环液的最佳p h 值为7 .0. 8 . 0 ， 适宜的 循环水流量为3 0 l / m 2 塔面 积.h。 5 通过对代谢产物的分析，表明生物脱臭代谢过程中，代谢中间产物 n 0 2 一基本上没有积累， 氨气最终被氧化成n 0 30 键词:恶臭生物脱臭硝化菌固定化 四川大学硕士学位论文 s t u d y o n b i o t r e a t m e n t o f a m m o n i a - c o n t a i n i n g o d o r o u s g a s e s b y i m m o b i l i z e d n i t r i f y i n g b a c t e r i a m a j o r c h e mi c a l t e c h n o l o g y g r a d u a t e s t u d e n t z e n g we i s u p e r v i s o r p r o f z h o n g b e n h e n i t ri f i c a t i o n , p e r f o r m e d o x id a t i o n i n o f a m m o n i a t o n i t r a t e b y n it r i f y i n g b a c t e r i a i s a k e y p r o c e s s i n t h e c y c l i n g o f n i t r o g e n a n d a n i m p o r ta n t c o m p o n e n t o f m o d e r n b i o t r e n a t m e n t o f a m m o n i a - c o n t a i n i n g w ast e g as. p r e v i o u s b i o d e o d o r i z a t i o n s t u d i e s m o s t ly u s e d a c t i v e s l u d g e , w h o s e m e t a b o l i c s e l e c t i o n a n d t h e p o r t i o n s o f e ff e c t i v e m i c r o o r g a n i s m， l o w , t o t r e a t w a s t e g as e s . s o n i t ri f y i n g b a c t e ri a a r e i m m o b l i l i z e d a n d p a c k e d i n t o a p a c k t o w e r t o d e c o m p o s e n h 3 i n t h i s p a p e r i n o r d e r t o i n c r e as e n h 3 r e m o v a l e f f i c i e n c y . c h e m o l i t h o a u t o t r o p h ic n i t ri f y i n g b a c t e ri a h a v e m a n y u n f a v o r a b l e p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s , n a m e l y , s l o w g r o w t h , s m a l l b i o m ass a n d s u s c e p t i b l e e n v i r o n m e n t f a c t o r s . we e n r i c h n i t r i f y i n g b a c t e r i a i n e n r i c h m e n t c u l t u r e m e d i a u s i n g a m m o n l u m s u lp h a t e as t h e o n ly n i t r o g e n s o u r c e i n o r d e r t o i n c r e as e s c r e e n i n g e ffic i e n c y . mo s t s t u d i e s u s e d mp n ( m o s t p r o b a b ly n u m b e r ) f o r as s e s s i n g m e t h o d s o f e n r i c h m e n t ， w h i c h i s c o m p l e x . n e w as s e s s i n g m e t h o d s o f e n r i c h m e n t h a v e b e e n p o s e d i n t h i s p a p e r . n i t r i f i c a t i o n i s a n a l y z e d v i a c h e m i c a l c h a n g e , w h i c h s u g g e s t t h e n u m b l e o f n i t r i f y i n g b a c t e ri a .t h r e e s t r a i n s w e r e i s o l a t e d fr o m f u n a n h e s e w a g e a n d p o o l w a t e r i n w a n g j ia n g l o u p a r k，w h i c h h a v e h i g h e r n h 3 - n r e m o v a l capacity-the s h a p e s i n d i v i d u a l a n d p o p u l a t i o n a n d t h e p h y s i o l o g i c a l， g r a m s t a i n a n d b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r o f t h e m i c r o o r g a n i s m s w e r e s t u d i e d . t h r e e s t r a i n s w e r e i d e n t i f i e d as n i t r o b a c t e r i a c e a e p re l i m i n a ry l y . s o d i u m a l g i n a t e a n d p o l y ( v i n y l a l c o h o l ) w e r e u s e d t o e n t r a p n i t r i f y i n g b a c t e r i a . t h o u g h c o m p a r i n g m e c h a n i c a l s tr e n g th ,m as s t r a n s f e r c h a r a t e r i s t i c s a s as 固定化硝化细菌处理含氨臭气的研究 w e l l a s o t h e r p r o p e rt i e s o f i m m o b i l iz e d b e a d , w e f o u n d t h a t 9 % p o l y ( v i n y l a l c o h o l ) a n d 0 .3 %s o d i u m a l g i n a t e a r e m o r e s u i t a b l e f o r e n t r a p p i n g n i t r i f y i n g b a c t e r i a . t h e e ff e c t o f t e m p e r a t u r e o f b i o r e a c t o r , t h e v a l u e o f p h y s i o l o g y i n r e c y c l i n g s o l u t i o n , re c y c l i n g s o l u t i o n s p r a y d e n s i ty , n h 3 i n l e t c o n c e n t r a t i o n a n d n h 3 fl o w r a t e o n n h 3 r e m o v a l e f f i c i e n c y w e r e s t u d i e d i n b io re a c t o r , a n d m e t a b o l i c p r o d u c t s o f n h 3 w e r e a n a l y z e d . t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s h o w e d: i t i s p r a c t i c a b l e t h a t n i t r i f y i n g b a c t e r i a w a s i m m o b i l iz e d a n d p a c k e d i n t o a p a c k t o w e r t o d e c o m p o s e n h 3 i n t h e c o n d i t i o n o f c o n s t a n t g a s fl o w r a t e , n h 3 r e m o v a l c a p a c i t y i n c r e a s e d w i t h t h e d e c r e asin g i n l e t c o n c e n t r a t i o n . n h 3 r e m o v a l e f f i c i e n c y w il l d e c r e a s e d w i t h t h e i n c r e as i n g g as fl o w r a t e s i g n i f i c a n t l y , b u t i t h as a m a x i m u m.t h e o p t i m u m i n l e t l o a d w as 3 .2 6 m g - n / g .d i n t e r m s o f t h e q u a l i t y o f im m o b i l i z e d b e a d a t 0 .2 m 3 / h . t h e o p t i m u m t e m p e r a t u r e o f t h e s y s t e m r a n g e d fr o m 2 9 3 t o 3 0 3 k ,a n d t h e o p t i m u m p h v a l u e o f t h e b i o t r e a t m e n t s y s t e m i s fr o m 7 . 0 t o 8 . 0 . t h e o p t i m u m s p r a y d e n s it y o f r e c y c l in g s o lu t io n is 3 0 l / m 2-h in t e r m s o f t h e a r e a o f t h e b i o r e a c t o r . r e s u l t fr o m r e c y c l i n g s o l u t i o n a n a l y s i s s u g g e s t s t h a t n i t r if y i n g b a c t e r i a o x i d i z e a mmo n i a t o n i t r a t e i n t h e b i o r e a c t o r . k e y w o r d s :m al o d o r o u s i m m o bi l i z e d b i o d e o d o r i z a ti .o n n i t r i f y i n g b a c t e r i a 固定化硝化细菌处理含氨臭气的研究 第一章 综述 1 . 1恶臭气体的概述及处理方法 随着经济全球化和市场一体化进程的加快，生态环境在城市经济社会发展 中的地位和作用日益凸现，良 好的、开放的环境己成为一个城市参与国际竞争 的重要力量，成为一个城市的国际形象的主导因素之一。以 往注重粉尘、二氧 化硫和氮氧化物的大气污染防治及其研究己不能满足人们对空气质量的要求， 一个新的污染问题 一 恶臭污染逐渐引起国内外的广泛重视，恶臭污染防治的 研究日益活跃。 恶臭污染是指大气、水体、废气物等物质中含有的、具有能够引起人体厌 恶或不愉快气味的挥发性物质通过空气介质，作用于人的嗅觉器官而被感知的 一 种感 知 ( 嗅 觉 ) 污 染。 恶臭 污 染的 危 害 体 现 在两 个 方 面 11:一 方 面 它 会使 人 们 精 神 不愉快，烦躁不安，而且造成人们食欲不振、呕吐、头晕、头疼、视觉模糊， 更有甚者，高浓度的恶臭还可使接触者发生肺水肿，甚至窒息死亡。另一方面， 由于恶臭物质的影响干扰了人们正常的生产、生活，使工作效率降低，从而导 致社会经济状态恶化。在商业区由于恶臭的影响使购买力降低;在旅游区由于 旅游环境被恶臭污染，地域评价受到损害，经济利益受到影响:恶臭污染还会 造成该地区投资减少，使地域性经济发展受到抑制，并损害地区的整体形象。 在我国， 人们对恶臭污染的投诉占整个环境污染投诉的2 s %以上， 仅次于噪声， 位于第二位。目前，恶臭己成为世界公认的七大公害之一 ( 大气污染、水质污 染、土壤污染、噪声、振动、土地下沉、恶臭)。 恶臭气体按组成可分为s 类:含硫化合物， 如硫化氢、 二氧化硫、 硫醇、 硫醚:含氮化合物，如胺、酞胺、1 i 睬等;卤素及衍生物，如氯气、卤代 烃: 烃类， 如烷烃、烯烃、炔烃、芳香烃; 含氧有机化合物，如醇、酚、 醛酮、 有机酸等。 经气相色谱检测显示， 绝大多数臭气包含1 , 2和5类， 其余 种 类 的 物 质 较 少4 ,5 恶臭的脱除有别于一般大气污染的治理， 这是由 恶臭的 特性决定的 2 . 3 : c 6 h ,2 0 6 + 6 0 2 1 . 4 恶臭气体生物处理技术的国内外现状 虽然生化净化法在废水处理领域己有一百多年的应用历史，但利用微生物 处理废气的历史则很短，部分工作还停留在实验阶段，但由于其具有传统方法 不可比拟的优越性和安全性.发展潜力和应用前景相当广阔。最早利用微生物 处理恶臭的报道是1 9 5 7 年r . d . p o m e r o y 的 “ 利用土壤微生 物处 理姚s 废气” 的 美国 专 利i o n， 比 较 广 泛的 研究 是 从8 0 年 代 初 荷 兰 和 德国 的 科 研 人 员 获 得良 好 效果后才开始的， 随即引起了 美国、 日 本和许多欧美国 家的重视， 气态污染方面， 日 本、德国一直走在前列。在日 本，很多污水厂都有自己的废气处理系统，他 们大量应用堆肥法、土壤法，并利用土壤法占 地面积大的特点铺设草坪，进一 步美化了环境。 德国早在1 9 5 9 年就在一个污水处理厂建立了填充土壤的生物过 固定化硝化细菌处理含氨臭气的研究 滤床，用于控制污水输送管散发的臭味， 并在生物处理废气的反应动力学、填料 优选、设备工艺、负荷研究等方面都取得了很多成果。 自8 0 年代末起，生物法处理废气逐渐成为世界工业废气净化研究的前沿热 点课题之一， 然而我国 在这方面至今只有少数研究报道， 从目 前的情况看， 国内的 研究主要集中在工艺的选择、运行参数及处理效果的探讨，在这方面作了一定 的工作;但对脱臭微生物的研究尚未展开，所采用的微生物都是直接以活性污 泥挂膜驯化。如郭静等利用污水处理厂活性污泥挂膜的复合式生物膜反应器进 行 脱 臭 ， 当 h 2 s 浓 度 为 一 3 4 0 g / m 3 ， 容 积 负 荷 n - 1 6 5 g h , s / ( m 3 .d ) 时 ， h 2 s 去 除率高于 90% 2 9 1 0g o y袁志文等利用固 定化细胞技术进行了 处理含甲 硫醇恶臭气体 的研究。他们采用液相曝气方式，向城市污水处理厂曝气池的活性污泥中通入 甲硫醇气体进行驯化培养，获得具有降解甲硫醇能力的优势菌群，并用海藻酸 钙包埋法制备固定化细胞，且将固定化细胞填充在颗粒填充床中处理含甲 硫醇 恶臭气体。颗粒填充床的运行实验表明， 在空塔停留时间不大于1 3 s 时，对低浓 度甲 硫醇气体( 2 1 . 4 m g / m ) 的去除率在9 0 . 。 %以 上;当空塔停留时间 减少到6 . 5 s 时，对低 浓度甲 硫醇气体的去除率仍可维持在8 0 %以 上 1 8 1 。 任爱玲等采用p v c 弹性填料 进行生物膜脱除h 2 s 的研究，并与陶粒、 泥炭、 木炭填料进行了比较， 其接种污 泥取自 回 流污 泥 3 0 1 。 在国 外， 随 着对脱 臭微生 物 在臭 气处 理中 作 用的 认识 加深， 为了提高恶臭生物处理效率，己开始了高效脱臭微生物的筛选、培养和研究工 作 3 1 1 。 从8 0 年代中 期开始， 针对特定恶臭污染物的高效脱臭菌先后被发现， 应 用 于实际 脱 臭系统的 背景菌 群落中， 可以 形 成脱 臭效 更高的 优势菌 群落3 2 ,3 3 ,3 4 1 国外的许多研究都是从不同生境中分离到能代谢硫系恶臭物质的菌种接种于生 物脱臭器中用来处理硫系恶臭气体。分离自 泥炭脱臭器的菌株t h i o b a c i l l u s th i o p a r u s d w 4 4 10 1和 t h i o b a c i ll u s s p . h a 4 3 9 1， 分 离自 污 水 污 泥的 菌 株 t h io b a c ill u s th io p a r u s t k -m 19 1分 离 自 淡 水 湖 底 的 菌 株 t in o b a c illu s th io p a r u s e 6 19 1， 分 离 自 海 洋 生 物 絮 体 的 菌 株 t h io b a c i ll u s t h i o p a r u s t 5 19 1 ， 它 们 应 用 于 生 物 脱 臭 器 中 ， 都 取 得 了很好的处理效果。 1 . 5 论文背景及主要研究内 容 近年来 ，随着我国经济的持续高速增长和城镇化建设的不断加快， 人民的 四川大学硕士学位论文 生活水平迅速提高，与此同时，城市生活垃圾产生量也与日 俱增。垃圾污染已 经成为阻碍城市发展和影响我国可持续发展战略的一个不可忽视的问题.在生 活垃圾的三大处理技术填埋、 堆肥、 焚烧中， 堆肥技术是实现城市垃圾资源化、 无害化的一条重要途径。目 前，垃圾堆肥技术遇到的主要困难是垃圾堆肥过程 中产生的臭气难以控制，生活垃圾堆肥过程中的恶臭气体已成为严重的公害， 恶 臭问 题 必 须 加以 解 决 3 5 本论文以 生活垃圾堆肥过程中产生的实际 恶臭气体( 主要成分是氨气、 硫化 氢 等 3 6 为 研 究 对 象， 针 对 氨 气 这 种典 型的 恶 臭 气 体 进 行了 生 物 脱 臭的 研 究。 本文的主要研究内容包括: 生物脱臭工艺的选择; 快速、准确的富集培养方法的确立; 硝化细菌的分离纯化及筛选方法; 对筛选得到的菌种进行初步鉴定; 固定化包埋材料的选择; 脱臭工艺条件的研究。 固定化硝化细菌处理含氨臭气的研究 第二章 硝化细菌的筛选和初步鉴定 2 . 1 实验仪器及材料 2 . 1 . 1 实验仪器 1 s w - c j - i u b 型洁 净工作台 ( 苏 州安 泰空 气技 术有限 公司 ) 2 k w- b 型旋转式摇瓶机( 四川抗菌素研究所) 3 化学天平( 上海医 疗器械八厂) 4 电子分析天平 ( 上海天平仪器厂) 5 p h s - 2 5 c型酸度仪 ( 上海康仪仪器有限公司) 6 p y x - d h s - 4 0 x 5 0 9 隔 水式电 热 恒温培养箱 ( 上 海跃 进医 疗器械厂 ) 7 电烘箱( 成都电 烘箱厂) 8 t d g c 2 型调压变压器( 上海正宏电 器机械厂) 9 y x o , s g 4 6 ,2 8 0 , b 型 手提式压 力蒸 汽消毒 器( 成 都 胜利医 用设备 厂 ) 1 0电冰箱 2 . 1 . 2 实验试剂 ( i )纳氏 试剂配制: 称取2 0 g 碘化钾溶于约2 5 m l 水中， 边搅拌边分次少量加入二氧化汞 ( h g c 1 2 ) 结晶粉末 ( 约i o g ) ， 至出 现朱红色沉淀不易 溶解时， 改为滴加饱和二 氯化汞溶液，并充分搅拌，当出现微量朱红色沉淀不再溶解时，停止滴加氯化汞 溶液。 另称取6 0 g 氢氧化钾溶于水，并稀释至2 5 0 m l ， 冷却至室温后， 将上述溶液 徐徐注入氢氧化钾溶液中，用水稀释至4 0 0 m l ,混匀。静置过夜，将上清液移入 聚乙烯瓶中，密塞保存。 ( 2 )二苯胺试剂的配制: 取1 克二苯胺溶于1 0 0 毫升浓硫酸中即得。 四川大学硕士学位论文 2 . 1 . 3培养基 硝化细菌富集培养基3 7 ,3 8 ,3 9 1 . ( n h 4 ) 2 s o 4 1 g f e s 0 4 - 7 h 2 0 0 . 4 g c a c 1 2 o . l g mg s 0 4 -7 h 2 0 0 .5 g k 2 h p 0 4 0 . 5 g h 2 o 1 0 0 0 ml na cl na hc o 3 0 . 5 g l . 5 g na cl c a c o 3 0 . 5 g 4g 999 行、.j11 0.已2 硝化菌分离纯化培养基3 7 ,3 8 ,3 9 1 . ( n h 4 ) 2 s o 4 1 g mg s 0 4 . 7 h 2 0 f e s 0 4 - 7 h 2 0 0 . 1 9从h p 0 4 h 2 o l 0 0 0 m l琼 脂 o勺 勺 . g0 卜勺 . n 硝化菌筛选培养基3 7 ,3 8 ,3 9 1 (n 比) 2 5 0 4 0 .4 g f e s 0 4 - 7 h 2 0 0 .2 g c a c l 2 o . l g mg s 0 4 . 7 h 2 0 k 2 h p 0 4 0 - l g h 2 o l 0 0 0 ml n a c l 0 . 5 g n a h c 0 3 1 9 琼脂 2 0 g 硝化细菌固体培养基3 7 ,3 8 ,3 9 1 , 困比) 2 s 氏i g f e s 0 4 - 7 h 2 0 0 .4 g c a c 1 2 o . l g mg s 0 4 - 7 h 2 0 k 2 h p o 4 0 . 5 9 h 2 o i o o o ml na c l 0 . 5 g n a h c 0 3 l . 5 g 琼脂 2 0 g 固定化硝化细菌处理含氨臭气的研究 2 .2 实验方法 2 . 2 . 1 实验筛选流程 确定采样地点 确定特定的富集条件 确定定性的快速检测方法 纳氏比色法筛选 2 . 2 . 2 硝化菌的筛选 2 . 2 . 2 . 1 采样: 取府南河污水、污水处理厂污泥和望江公园的鱼塘水，用无菌操作分装于 灭菌的不同器皿内，编号 瑞 ，2 # , 3 # ，放于4 的冰箱中备用。 2 .2 .2 .2 富集培养 在采集的 样品中 ， 硝化菌数量较少， 为了 提高分离的效率， 本文在培养基中以 硫酸氨为唯一氮源， 并添加硫酸亚铁等硝化菌所需的营养元素， 使硝化菌的数量 从天然环境中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌。如何判断硝化细菌的生长 情况是富集培养的关键问 题，传统的富集培养多采用 mp n 计数法 ，该方法过 于复杂，本文通过化学反应来检测硝化反应，进而根据硝化反应反推硝化菌数 量。实验方法是利用钠氏试剂和氨离子反应生成黄棕色络合物，其色度与氨氮 四川大学硕士学位论文 含量成正比， 根据颜色的深浅， 可以 半定量的判断 n h , + 浓度的 数量， 从而快速、 准确地掌握氨离子的 去除情况，另外 n 0 3 一 在强酸性条件下与二苯胺反应生 成蓝 色染料，根据颜色的深浅，可以半定量的判断 n 0 3 一 浓度的数量，了 解代谢产物 的生成情况。 实验步骤如下: ( 1 )在无菌条件下用无菌吸管取样品1 #、3 #各1 0 毫升加入硝化菌富集 培养基 ( 见2 . 1 3 ) 中， 2 # 样用无菌水稀释至 1 0 毫升后加入2 5 0 毫升硝化菌富集 培养基中， 每个样品做2 个平行样， 府南 河污水样品 编号为f 1 , f 2 , 污水处理厂 污泥样品编号为 w1 , w2 ，望江公园的鱼塘水样品编号为 y l , y 2 ，另取两瓶 不加菌种的2 5 0 毫升硝化菌富集培养液作空白比较，编号k 1 , k 2 . ( 2 )将所有样品置于3 0 摇床3 0 温度下培养3 0 d ( 在第 1 0 天和第2 0 天补充培养基)， 用钠氏 试剂和二苯胺试剂定时检测n 0 3 一 的 产生及 n h , + 的消 耗及p h值的 变化情况 ， 掌握硝化细菌的生长情况。 2 .2 . 2 . 3菌种的分离纯化 富集培养的结果并不能获得微生物的纯种， 即使在富集培养过程中设置了 许多限制因素， 但其它微生物并没有死去， 只是相对数量减少， 故富集后得到的微 生物培养物仍是一个各类微生物的混合体， 为了获得硝化菌的纯种， 必须进行微 生物的纯化。 本实验设计了 透明圈法来快速简便的分离纯化硝化菌。 其原理是: 在硝化 菌分离纯化培养基 ( 见2 . 1 .3 )中加入适量的c a c o 3 ，硝化菌降解氨氮过程中产 生的酸使c a c o 3 沉淀分解而产生透明圈( 有c a c o 3 的地方浑浊， 没有c a c o : 的 地方透明) ，因此，在有硝化菌的地方必然会出现透明圈，根据透明圈的直径大 小就可以筛选出具有氨氮降解能力的硝化菌。 实验步骤如下: ( 1 )倒平板: 按硝化菌分离纯化培养基配方( 见2 . 1 .3 ) 制备平板。 ( 2 )制备硝化菌稀释液:在无菌条件下用无菌吸管吸取 1 0 毫升硝化菌富集培 养液，加入盛有9 0 毫升无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中， 振摇约2 0 分钟，用一 只l m l 无菌吸管从中吸取1 m l 悬浮液加入盛有9 m 】 无菌水的试管中充分棍合均 匀， 然后用无菌吸管 从此试管中吸 取 l m l 加入另一只盛有 9 m l 无菌水的试管中 ， 固定化硝化细菌处理含氮臭气的研究 混 合均 匀 ， 以 此 类推 制 成1 0 - 1 , 1 0 - 2 , 1 0 - 3 , 1 0 - 4 , 1 0 - 5 , 1 0 - 6 不同 稀 释 度的 硝 化 菌 溶 液。 ( 3 ) 涂 布: 将 硝 化 菌 平板 培 养 皿 底 面 分 别 用 笔写 上1 0 4 , 1 0 - 5 和1 0 - 6 三中 稀 释 度， 然后 用无 菌吸 管 分 别由1 0 - 4 , 1 0 - 5 , 1 0 6 三 管 硝 化 菌 稀 释 液中 各 吸 取。 l m l 对号 放 入己 写好稀释度的平板中， 用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。室温 下静置5 - 1 0 m i n。 c 4 )培养:将硝化菌培养基平板倒置于3 5 的恒温培养箱中恒温培养3 天。 c 5 ) 挑菌落: 在出现透明圈的地方将培养后长出的单个菌落挑取少许细胞接种到 硝化细菌固体培养基的斜面上，置于 3 5 的恒温培养箱中培养，待菌苔长出 后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一微 生物。 若发现有杂菌， 重复上述步骤再一次进行分离、 纯化， 直到获得纯培养。 2 .2 .2 .4 菌种筛选 在含氮化合物的固体培养基 ( 平板) 上接种平板分离得到的菌株， 如果某个 菌株对氨氮有降解作用， 那么在加钠氏试剂显色时， 在氨氮被降解的地方就不会 产生黄棕色络合物， 表现在菌落周围即可出现半透明圈， 并且半半透明圈的直径 与氨氮的残留量成反比， 也就是说， 半透明圈越大， 该菌株去除氨氮的能力就越 大，故可以用比 较半透明圈直径的大小分离出菌株降解氨氮的能力。 筛选步骤如下: ( 1 ) 在无菌条件下， 将初筛分离得到的菌株接种于液体硝化菌富集培养基中摇 瓶发酵。 ( 2 )把硝化菌筛选培养基 ( 见 2 . 1 . 3 )在无菌的培养皿中制成平板，在无菌条 件下用无菌吸管吸取 l m l 步骤 1 得到的液体硝化菌富集培养，按编号放入 有同样编号的平板中 ， 用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温 下静置5 - 1 0 m i n。 并做没有接种菌种的空白 对照样， 每个菌株做两个平行 样。 ( 3 ) 把平板倒置于3 5 恒温培养三天， 取出后在平板上缓缓倒入一层钠氏 试剂， 静置片刻， 在菌落周围即可出现半透明圈， 最后用卡尺测量半透明圈的直径。 2 .2 .2 .5菌落初步 鉴定 1菌落、株形态观察和革兰氏染色鉴定 四川大学硕士学位论文 将筛选得到的纯菌种n 4 , n 1 1 , n 1 5 接种到平板分离初筛培养基， 每天观察 菌落的生长情况， 取样做革兰染色鉴定， 并在 1 0 0 0 倍光学显微镜下观察菌株形 态。 2 氨氮降解速率测定 氨氮降解速率是一株细菌硝化能力的反映。将n 4 , nl l , n 1 5 分别接种在 2 5 0 m 1 液体富集培养基中， 3 0 0c , 黑暗摇瓶培养3 0 天， 为了 扣除氨氮的挥发等因 素造成的氮损失，本研究以零对照与各个实验组之差作为该实验组中细菌实际 硝化氨氮的量，以此来计算氨氮降解率。实验中采用蒸馏一 滴定法测量培养基中 氨氮含量( 见附录) ， 按下列公式计算其氨氮降解速率: 氨氮降解速率 m g / ( l .h ) = ( 零对照氨氮浓度一实验组氨氮浓度)/ 体积. 时间。 2 . 3实验结果与讨论 2 . 3 . 1富集培养结果与讨论 本文通过硝化菌的生化反应特性 ( 硝化细菌将n w 最终氧化为 n 仇一) 出 发来间接判断硝化细菌的数量情况，实验结果如下: 2 . 3 . 1 . 1 稍化菌富集培养液中 n h 4 十浓度的变化 在3 0 天的富集培养过程中， 硝化菌富集培养液中n h 4 浓度变化情况见表 2 . 1 。从表2 . 1 可以看出，样品f l , f 2 , y l , y 2 中 n h 4 + 浓度逐渐下降，并且下降 速度逐渐加快， 而空白 样品n h 4 + 浓度几乎没有变化， 说明样品f 1 , f 2 , y 1 , y 2 中 存在降解n 比十 的菌种，由 于在富 集培养培养过程中降 解 n h 4 + 的菌种数量在不 断增加，因此，n h 4 十 的下降速度在加快。 固定化硝化细菌处理含氨臭气的研究 表2 . 1 硝化菌富集培养液中 n h , 浓度变化情况 t a b l e 2 . 1 c h a n g e o f n h , c o n c e n t r a t i o n i n e n r i c h m e n t c u l t u r e m e d i a 时间/ d f 1 f 2yl k1k2 + + +十 十 十+ + +十 十 + + + + + +十 + + + + + + +十 十 十+ + + + + +斗 斗 + + + +十 十 + + + 十 十 + 斗 + + + + + + + + + + 十 + +十 十 + + +十 + 十+ + + 十 十 + + +十 斗+ + + 十 十 + + + + 十 十 十+ + +斗 + + + + +十 + + + + + 十 + + + + 斗 + + 十+ 十 十 十+ + + + + + + 十 + + +斗 + + + 十