（食品科学专业论文）大豆、玉米转基因成分的竞争定量PCR检测.pdf

摘要 本实验以传统的大豆、玉米和转基因大豆、玉米为材料，通过p c r 方法定性和定量检测大 豆、玉米中转基因成分。通过此研究可进一步为转基因食品的检测工作提供相关的理论依据和实 验方法。 实验以3 5 s 启动子和n o s 终止子为研究对象。首先利用p c r 和s o u t h e r n 杂交方法对大豆、 玉米的转基因成分进行定性检测。然后分别咀非同源和同源模板为竞争物对二者进行定量检测。 竞争定量p c r 方法的关键问题是竞争物的制备。非同源竞争物的制各是以异源的e c o l i 基因 组为模板，对其进行低严紧型扩增，将回收目的条带构建在t e a s y 载体上制备而成。同源模板竞 争物是以p b l l 2 1 为模板进行3 5 s 启动子和n o s 终止子扩增，回收目的条带构建在t - e a s y 载体上， 然后进行测序。在p c r 产物内部选择合适的酶切位点，在该酶切位点插入4 0 b p 的片段制备而成。 定量p c r 过程中，首先确定与含量为1 g m o 样品( 5 0 0 n g ) 浓度相当的同源内标物浓度和 含量为2 g m o 相当的非同源内标物的浓度。然后以确定的内标物浓度与不同含量的g m o 样品 ( 5 0 0 n g ) 进行竞争p c r 反应，以此进一步确定样品中g m o 含量的范围。 实验结果表明，定性p c r 检测3 5 s 启动子的晟佳退火温度为5 8 c ，n o s 终止子的最佳退火 温度为5 2 c 。经s o u t h e m 杂交进一步验证了p c r 结果的可靠性。实验中非同源模板竞争定量p c r 的检出限为2 ；同源模板竞争定量p c r 检出限为1 。对待测样品进行检测，在g m o 含量大 于2 时，两种方法检测结果一致。 关键词：大豆玉米竞争定量p c r3 5 s 启动子n o s 终止子 i i a b s t r a c t g e n e t i c a l l ym o d i f i e ds o y b e a na n dm a i z ew e r eq u a l i t a t i v e l ya n dq u a n t i t a t i v e l yd e t e c t e du s i n gp c r ， t h i s p a p e rf u r t h e rp r o v i d e dr e l e v a n tt h e o r e t i c a l b a s i sa n de x p e r i m e n t a lm e t h o df o rt r a n s g e n i cf o o d a n a l y s i s 3 5 sp r o m o t e ra n dn o st e r m i n a t e rw a ss t u d i e da st h eo b j e c t a st h ef i r s ts t e p ，t r a n s g e n i cc o n t e n t s w e r eq u a l i t a t i v e l yd e t e c t e db yp c ra n ds o u t h e mb l o t s t h e n ，t h e yw e r eq u a n t i t a t i v e l yd e t e c t e d b y h e t e r o l o g o u sa n dh o m o l o g o u sc o m p e t i t i v et e m p l a t e s ， t h ek e yp r o b l e mo fq c - p c ri st h a t c o m p e t i t o r i st h ec o n s t r u c t i o no ft h e c o m p e t i t o r t h e h e t e r o l o g o u sc o m p e t i t o r i sc o n s t r u c t e da sf o l l o w s ：t h ee c o l i g e n o m i cd n aw a sl o ws t r i n g e n t l y a m p l i f i e d ，a n d t h e nt h es e l e c t i v eb a n dw a sp u r i f i e da n d l i g a t e dt - e a s yv e c t o r t h eh o m o l o g o u s c o m p e t i t o ri s c o n s t r u c t e da sf o l l o w s ：t h ep l a s m i dp b l l 2 1w a sa m p l i f i e db y3 5 sa n dn o s s p e c i f i c p r i m e r , a n dt h e n t h es e l e c t i v ef r a g m e n tw a sp u r i f i e da n ds u b c l o n e dt o t - e a s yv e c t o r t o g e n e r a t e r e c o m b i n a n tp l a s m i d ，w h i c hi sd i g e s t e db yr e s t r i c t i o ne n z y m e ，t h e4 0 b p f r a g m e n tw i t hc l o s m i de n dw a s i n s e r t e d t h ec o m p e t i t o rc o n c e n t r a t i o n sw e i - ea d j u s t e ds ot h a tt h ei n t e n s i t yo ft h ea m p l i c a t i o np r o d u c to f d n a c o n t a i n i n gap r o p o r t i o no f1 g m o w a s e q u a lt ot h ei n t e n s i t yo f t h ea m p l i c a t i o np r o d u c to ft h e c o a m p l i f i e dh o m o l o g o u sc o m p e t i t o rd n a a n d2 g m oc o n t e n t sw a se q u a lt ot h ei n t e n s i t yo ft h e a m p l i e a t i o np r o d u c t o ft h e c o a m p l i f i e dh e t e r o l o g o u sc o m p e t i t o r d n a t h e t e m p l a t e d n a ( 5 0 0 n g ) m i x t u r e sc o n t a i n i n gd i f f e r e n tp r o p o r t i o n so fg m o w e r ea m p l i f i e dw i t hc o n s t a n ta m o u n t so f c o m p e t i t o rd n a i no r d e rt od e t e r m i n e s c o p eo ft r a n s g e n i cc o n t e n t si nf o o ds a m p l e s ， t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eo p t i o n a la n n e a l l i n g t e m p e r a t u r eo f 3 5 s p r o m o t e r a n dn o st e r m i n a t e r i s5 8 ca n d5 2 r e s p e c t i v e l y , t h er e l i a b i l i t yo fp c rm e t h o dw a sf u r t h e rp r o v e db ys o u t h e r nb l o t s ； h e t e r o l o g o u sa n dh o m o l o g o u sc o m p e t i t i v es y s t e m sp r e s e n t e da l l o w e dt h ed e t e c t i o no f2 a n d1 m o d i f i e dc o n t e n t si nt o t a ld n a ，r e s p e c t i v e l y t oa n a l y t i c a ls a m p l e s ，t h eu n i f o r mr e s u l t sw e r eo b t a i n e d b y b o t hs y s t e m s k e yw o r d s ：s o y b e a n ， m a i z e ，q c p c r , 3 5p r o m o t e r , n o s t e r m i n a t e r i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 研究生签名 时间： 2 0 0 3 年月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 差交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 射手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议1 研究生签名 导师签名： 时间： 年月目 时间： 勿多年月。乙目 声 g m o p c r q c p c r 3 5 s n o s r t p c r s e m i - q p c r e l i s a s a f e s t c 1 a b e d t a f p c r r r s m m 缩略词 a b b r e v i a t i o n g e n e t i c a l l y m o d i f i e do r g a n i s m p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n q u a n t i t a t i v ec o m p e t i t i v ep c r c a m v 3 5 s n o p a l i n es y n t h e t a s e r e a l - t i m eq u a n t i t i v ep c r s e m i q u a n t i t i v ep c r e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o rb e n t a s s a y s a f e t ya s s e s s m e n to f f o o db ye q u v a l e n c e a n d c e t y l t r i m e t h y la m m o n i u m b r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d f l u o r e s c e n c ep c r r o u n d u p r e a d y t m s o y b e a n m a x i m i z e rm a i z e 基因修饰有机体 聚合酶链式反应 竞争定量p c r 烟草花叶病毒3 5 s 胭脂碱合成酶 实时一定量p c r 半定量p c r 酶联免疫吸附法 s i m i l a r i t yt a r g e t i n g 溴代十六烷基三甲胺 乙二胺四乙酸二钠 荧光p c r 抗草甘膦大豆 抗b t 虫玉米 中国农业大学硕士学位论文 第一章义献综述 i i 第一章文献综述 1 g m o 安全。性问题的提出 转基因生物( g e n e t i c a l l ym o d i f i e do r g a n i s m ，简称g 们) 是指应用现代生物技术，在受体 生物中导入特定的外源基因，从而使生物获得具有特定性状的改良生物品种。这样的生物直接作 为食品或以其为原料加工生产的食品叫转基因食品。目前，国际上习惯于把转基因生物及其制品 统称为g m 0 ，多数g m o 为转基因农作物，此外还含有少量的转基因动物性食品和微生物。g m o 以 其抗逆性好或高产或优质或具有某些特殊功能为人类解决未来食物短缺、改善食物品质提供了 个有效手段。然而，在g m o 商业化的进程中，却遇到了诸多麻烦，其国际贸易争端，尤其是其 安全性问题，迫使各国政府制定相关规则和标准。g m o 及其相关问题，尤其是涉及到我国农产品 进出口贸易以及环境和健康的长期安全等重大问题，不能不引起我国高度重视。研究制定相关管 理措施和解决有关问题的对镶，完善相应的检测手段，具有重大的理论意义和实践价值”1 。 转基因技术自1 9 世纪7 0 年代诞生以来，其发展态势极其迅猛。由2 0 0 0 年转基因作物的种 植面积4 4 2 0 万公顷已经增长到2 0 0 2 年的5 8 7 6 万公顷。虽然转基因作物已经在世界范丽内得到 成功推广，但不时有科学家对转基因生物提出质疑。他们提醒人们注意大量应用转基因生物会 不会破坏生物多样性，甚至可能对人类健康造成伤害。最近几年。有关转基因食品安全的科学争 议一直没有停止。请看这样几个事例： 最初是1 9 9 9 年的转基因马铃薯事件，英国的一位研究人员公布的实验结果说：用含有转基 因的马铃薯饲养大鼠，引起了大鼠器官生长异常、体重减轻、免疫系统遭到破坏。这一实验结果 立即引起轰动导致了世界范围的对转基因食品安全性的怀疑。随后争议事件接踵而至：t 9 9 9 年美国斑蝶事件。加拿大转基因油菜事件，2 0 0 1 年墨西哥玉米基因污染事件，以及2 0 0 2 年转基 因食品的d n a 在人体内残留的试验等更加剧了人们对转基因食品安全性的担心。 针对以上人们的担心和忧虑，科学家们做了大量的工作。近年来的科学研究结果表明，g m o 可能存在两大潜在风险： ( 1 ) g 啪的食品安全性 即转基因食品对人体健康可能产生的影响。一些转基因生物产品含有转基因有毒物质或过敏 源，这类物质会对人类健康产生影响，严重者可能导致某些遗传类疾病。对g m o 食品安全性评估 主要是毒性分析、过敏性分析和标记基因的安全性评估。目前，从食品安全保障的观点来看，持 肯定观点的人认为：现代生物技术的品种改良g m 0 ，正如在自然界物种的进化过程中突然变异体 的出现；食品安全性评估需要在风险收益的比较分析的基础上进行：对g m o 食品安全性的评价， 也可采用现今被认可的实质等同性原则进行( 即g m o 食品是否与市售产品具有等同性) 。而持否 定观点的人认为：g m o 超出了传统育种的概念，已不能认为是杂交育种的延伸；所使用的d n a 取自 一些病毒和细菌，可能引发许多不知名的疾病，有些影响需要经过很长时间才能表现和监测出来： 以前没有的基因组合的生物。对生物和人体的影响，有必要进行长时间的观察和研究；g m o 的重 组基因有基因漂移的风险等。因而，存在基因控制系统失控的潜在风险：g m o 系突变体，有新的 耋坠些耋坚篓鍪圣。，一i 。耋坠 蛋白质被创造出来，因此，有可能引起食品的过敏反应。从持否定观点者的观点看来，本质上更 倾向于对g m o 持谨慎态度。 具体表现在以下几方面： 1 ) 该类食品携带的抗生素基因有可能使动物与人的肠道病原微生物产生耐药性，这是人们 最关心的问题。 1 9 9 9 年，英国一位科学家在著名医学杂志柳叶刀上发表论文宣称实验用的大鼠在食用 转基因马铃薯以后，肝脏受到损伤，免疫系统受到削弱，由此掀起了国际社会对转基因食品安全 性广泛争论的序幕。2 1 位著名科学家支持这位科学家的工作，但英国皇家学会对此事专门组织科 学家调查研究后认为，该科学家的实验从设计、执行到分析，多方面都有缺陷，不应过早得出结 论。认为喂食转基因马铃薯与对照所得的数据虽然看上去有一些差异，但因受到实验技术上的限 制和不正确的利用统计学，这些差异说明不了问题”。 2 ) 抗昆虫农作物体内的蛋白酶活性抑制剂和残留的抗昆虫内毒素，可能对人体健康有害。 有人认为，抗昆虫农作物体内的蛋白酶活性抑制剂和抗昆虫内毒素，既然能使咬食其叶片的昆虫 的消化系统功能受到损害，那么谁又能担保其叶片、果实、种子不会对人畜产生类似的伤害呢? 所以奥地利、卢森堡规定禁止进口转基因抗虫玉米”1 。 3 ) 随着基因改造的抗除草剂农作物的推广，可能导致除草剂的用量增加，从而导致除草剂 在食品中残留量加大。 4 ) 引入病毒外壳蛋白基因的抗病毒农作物可能对人体健康产生危害。 从目前看，尚无确凿的证据能证明转基因食品对人类健康的直接影响，但人们的担心依然存 在。 ( 2 ) g m o 的环境安全性 即g v i o 对自然生态环境的影响。由于转基因生物体是经过生物技术产生的新物种，就有可能 破坏经过自然演化形成的原有自然生态物种，造成环境污染和自然生态物种的失衡。转基因农作 物可节省杀虫剂和除草剂，能够减少农场主田间管理工作量，其种植面积迅速扩大，9 0 年代后期 风行全美。支持者认为：人类的任何一项科技发明都会产生一些风险。对待这些发明创造，需要 权衡利弊，并努力降低或避免风险，使之更好地造福于人类。比如发明了汽车，同时也产生了车 祸但是，我们并没有因为存在车祸风险而不去享受汽车给我们带来的方便。问题的关键在于如 何在权衡利弊的同时，努力回避风险。更何况当今农业在追求高产出的时候，大量使用化肥、农 药、农膜，消耗大量能源，造成环境污染和破坏，存在着显而易见的风险，但并没有因此放弃农 业生产：反而，任何高效和可持续的技术成果都是受欢迎的。然而，1 9 9 9 年美国康奈尔大学一些 研究人员研究发现：转基因玉米可能危害美洲大蝴蝶的生存，在此以后，有关g m o 环境安全性及 其破坏生态的风险问题便开始在美国乃至世界各国引起广泛争议。反对者主要是出于对潜在风险 的担心，认为：任何在自然状态下不大可能产生的性状，都可能对人类健康和环境造成威胁。而 人为地基因改造生物特性、创造新物种，是违背自然进化的行为，存在破坏环境和现存物种平衡的 风险，是非常危险的。因此，应该终止g m o 的试验和生产。”。 人们对其引起的担心主要表现在： 2 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 1 ) 如果转基因高产作物一旦通过花粉导入方式将高产基因传给周围杂革，会引发超级杂草 出现对天然森林造成基因污染和对这些地区的其它物种带来不可预见的后果”l 。 2 ) 如果转基因不育品种的不育基因在种植地大肆传播，会导致当地农业崩溃。美国d p l 公 司和美国农业部联合申请了一个“终止子技术”的专利，并于1 9 9 8 年3 月获得美国专利局的批 准。该专利技术可使作物种植后得到的种子是不育的，虽然收获了种子，但不能留作种用。“终 止子技术”获得后引起国际很大的反响。许多国家认为，由于外观上分不清终止子技术生产的种 子，通过出售或交换不能发芽的种子，播种后可能会对生产造成不可弥补的损失：通过花粉非故 意传播会造成不育基因在种植地大肆传播，会导致当地农业崩溃。为了保护世界食品的保障许 多国家和组织纷纷要求禁止终止子技术。 3 ) 转入毒蛋白基因的植物，如果毒蛋白能在花蜜中表达，则可能引起蜜蜂等传粉昆虫和植 物群落的崩溃，甚至有可能危及其它动物以及人畜的栖居环境和身体健康。最近美国康奈尔大学 l o s e y 等报道在一种称之为植物马利筋叶片上撒上转基因b t 玉米花粉后，一种称之为黑脉金斑 蝶的幼虫对叶片就吃得少，长得慢，死得快。4 天后幼虫死亡率达4 4 ，而对照( 喂食不撒b t 玉米花粉的叶片) 无一死亡。这一结果在美国新闻报道后环境保护者担心今后会有更多的灾难接 踵而至。 4 ) 如果用于食品的植物通过基因改良成为药用植物，那么通过异花授粉会使食用植物产生 药性从而污染人类的食品供应“。 现在越来越多的人认为转基因食品对生态环境的影响比对人类健康的直接影响可能更大。然 而，科学不会由于争论的存在而停滞不前。现代生物技术发展水平较高的国家和地区，从未停止 过对g m 0 的研究，而是在不断加强，g m o 新成果不断出现，即使是在明令禁止g m o 进入欧洲市场的 欧盟亦是如此。不管目前对g 安全性如何评估，贸易争端已经遍布于不同管理体制的国家，而且 当新的g m o 被引入到国际市场的时候，争论将继续存在。尤其是在2 0 世纪末出现的转基因生物技 术及其产业化为农业以及医药卫生等行业的腾飞带来了新的希望的时候，虽然存在这样或那样的 潜在的风险但人们在仔细权衡利弊后特别是考虑到这一技术在解决全球食品安全的问题上的重 大贡献，使得这一技术所得到的产品得到了普遍的接受。 1 2 转基因农作物的发展历程、分布及种类 目前多数g m o 为转基因农作物，因此，了解转基因农作物的种植情况，尤其是转基因大豆、 玉米、油菜和马铃薯和烟草这5 种主要的作物的的种植情况便可知转基因生物的发展隋况。 1 2 1 转基因农作物的发展历程 总体形式： 世界上首例g m o 是1 9 8 3 年在英国培植出来的一种含有抗生素药类抗体的烟草。 1 9 8 6 年g m o 被批准进行田间试验。 1 9 9 0 年f r o m m 报道了第一例可育转基因玉米植株“”。首例转基因g m 大豆于1 9 9 6 年在阿根 廷获得批准应用。 2 0 0 2 年转基因作物的面积达1 4 5 亿英亩约5 8 6 7 万公顷，比2 0 0 0 年增加了1 4 4 7 万公顷，增 3 长率为3 2 。全球已有1 6 个国家的6 0 0 万农民以种植转基因作物为生，其中美国仍是头号转基 因作物大国，其种植面积占全球转基因作物种植总面积的6 6 ，据估计，有6 成加工食品为转基 因食品。阿根廷和加拿大也是转基因作物生产大国。我国转基因作物种植面积超过1 0 0 万亩有 6 种转基因植物已被批准商品化进入市场的转基因食品有柿子椒和西红柿。我国最主要的转基 因作物是棉花除了偶尔用棉籽榨油，一般并不作为食品。 因为转基因作物能够带来更为方便和更具变通性的管理。更高的生产力或净回报率以及由于 传统杀虫剂用量的减少而具有更安全的环境效益而令生产者感到相当满意。同时，转基因革新与 技术在保证农业的稳产高产方面具有十分巨大的潜力。这对于一些面临食品严重短缺的发展中国 家来说意义非同一般，因此这必将促进农业生产的可持续发展。 自1 9 9 6 年美国大面积种植转基因作物以后，转基因食品以惊人的速度向全球扩散。我国发 展转基因食品最重要的原因是出于国家粮食安全考虑。转基因作物具有抗旱、抗杂草、抗虫、抗 病毒、高产等特性。国家“8 6 3 ”计划农业生物技术项目，包括了水稻、棉花、转基因植物、农 业微生物、动物生物技术等领域，转基因技术对农业生产品质改良和保证国家粮食安全都有重大 意义。 1 2 2 转基因农作物种植面积分布情况 1 2 2 1 依国家分布 自1 9 9 6 年到2 0 0 0 年，将工业化国家与发展中国家转基因作物种植面积相比可以看出，全球 面积的8 5 种植在工业化国家“。然而，发展中国家转基因粮食的种植面积已连年增加：从1 9 9 7 年的年递增1 4 ，到1 9 9 8 年的1 6 ，1 9 9 9 年的1 8 ，直至2 0 0 0 年2 4 的增长率。由此可见， 在2 0 0 0 年，全球转基因作物种植面积4 4 2 0 万公顷中的大约i 4 ，即1 0 7 0 万公顷种植在发展中国 家1 1 ”。 共有8 个工业化国家和5 个发展中国家在2 0 0 0 年种植了转基因作物，而且，该类作物的商 业化种植已经遍布六大洲一北美洲、拉丁美洲、亚洲、大洋洲和欧洲( 东、西欧) 、非洲。占全球 转基因作物种植面积9 9 的前4 个国家中，美国占6 8 ，阿根廷占2 3 ，加拿大占7 ，中国占 了1 。余下的1 种植在其它的9 个国家中，其中只有南非和澳大利亚种植超过l o 万公顷。 2 0 0 0 年种植g m 作物的国家还包括两个东欧国家：罗马尼亚种了转基因大豆和马铃薯，保 加利亚种植了抗除草剂玉米。乌克兰在1 9 9 9 年曾种过转基因土豆，但2 0 0 0 年未昕说有转基因作 物种植。三个欧盟国家一西班牙、德国和法国一1 9 9 9 年首次种植过小面积的( 转基因) b t 玉米， 2 0 0 0 年面积缩减；葡萄牙1 9 9 9 年种过b t 玉米，但在2 0 0 0 年撤销了登录，并无b c 玉米种植的报 道。另有个国家是乌拉圭，报道称2 0 0 0 年首次种植了小面积2 0 0 0 公顷的抗除草剂大豆。 1 2 2 22 0 0 0 年各种转基因作物在全球商业化情况 2 0 0 0 年主导的转基因大豆占据全球转基因作物的5 8 。所有的转基因大豆均为抗除草剂大 豆。转基因大豆在2 0 0 0 年保持了它的最大种植面积的位置“。从全球的情况来看，转基因大豆 在2 0 0 0 年占有2 5 8 0 万公顷，位列第二的玉米是1 0 3 0 万公顷，转基因棉花列第三位，是5 3 0 万 公顷，油菜为2 8 0 万公顷“”。 转基因玉米在2 0 0 0 年估计减少了8 0 万公顷，主要是美国和加拿大缩减了种植面积。一些观 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 察家在分析美国2 0 0 0 年转基因玉米面积减少的原因时注意到，是种植农户们预测到了2 0 0 0 年的 欧洲玉米螟( e c b ) 的侵害将减少，且不会低于1 9 9 9 年的程度，其它的原因还有，农民们对转 基因玉米的市场前景充满了不定性，因此在种植季节减少了播种量。在美国和加拿大转基因玉米 种植面积的减少已在阿根廷从5 增至2 0 和南非的增种中得到了补偿。 2 0 0 0 年全球的转基因双低油菜估计减少了6 0 万公顷，全部是在加拿大缩减的；美国的种植 面积适当有所增加，补偿了部分减少的面积。加拿大的观察家们将该国的转基因双低油菜种植面 积减缩归结为三个原因：首先，全国的双低油菜面积从1 9 9 9 年的5 5 0 万减少到2 0 0 0 年的4 9 0 万 公顷，减量达6 0 万公顷；其次，转基因的耐除草剂油菜正与由基因突变选育出的抗除草剂品种 竞争，这类基因突变品种面积增加，2 0 0 0 年度占到全国种植面积的2 5 ；其三，双低油菜的价格 低迷，使得农民们减缩了转基因品种的面积而转向传统的品种。 2 0 0 0 年的转基因棉花种植面积估计增加了1 6 0 万公顷，从1 9 9 9 年的3 7 0 万增至2 0 0 0 年的 5 3 0 万公顷一这相当于转基因棉全球年递增量的4 0 。最明显的增长是在美国，转基因棉的年增 长率由1 9 9 9 年的5 5 增至2 0 0 0 年的7 2 ；我国报道称，已将转基因品种增加到占全国棉花面积 的1 0 ；此外，墨西哥、澳大利亚、阿根廷与南非亦出现了不同程度的面积增加。 一种有效的描绘全球转基因作物种植状况的方法是，统计和分析四种主要的转基因作物一大 豆、棉花、油菜和玉米的种植面积。数据显示：在2 0 0 0 年，全球种植总面积7 2 0 0 万公顷的大豆 中有3 6 是转基因品种。与此类似，3 4 0 0 万公顷棉花中的1 6 ，2 5 0 0 万公顷油菜中的1 1 ，以 及1 亿1 4 0 0 0 万公顷玉米中的7 皆为转基因品种。如果把全球这四大类作物面积合计起来，总 面积达2 亿7 1 0 万公顷，其中的1 6 即4 4 2 0 万公顷种植的属于转基因作物。另外需注意的是， 这2 亿7 1 0 万公顷作物中的2 3 是在发展中国家，因而产量低，需要做出最大努力去改良这些粮 食、饲料和纤维作物的品质和生产方式等。 到目前为止，可以认为突飞猛进的现代生物技术发展所产生的转基因农业的新时代已经开 始。2 0 0 2 年世界转基因农作物的播种面积已经达到5 8 7 6 万公顷，转基因大豆和玉米等已经成为 美国的重要出口商品。据国际农业生物技术应用机构( i s a 从) 的统计，1 9 9 8 年全球转基因农作物 的销售额是12 亿至15 亿美元，1 9 9 5 年至1 9 9 8 年累计的全球销售额是2 3 8 亿美元。美国】9 9 6 年转基因农产品的收入为8 0 0 0 万美元，而1 9 9 8 年则增加到4 3 5 亿美元。1 9 9 9 年美国转基因大 豆种植比重约为5 5 、玉米为3 3 、棉花为5 5 。另外，加拿大的油菜籽，巴西、阿根廷的大豆在 转基因技术和生产应用方面也进展迅速。 预计到2 0 5 0 年全球人口达到将近9 0 亿，其中大约有9 0 人口将生活在亚洲、非洲和拉丁美 洲。目前，发展中国家有8 亿4 千万人 e l 忍受着营养不良。1 3 亿人1 3 为贫穷所困扰。在9 0 年代 早期，很多人怀疑转基因作物在发展中国家是否适用，依据过去的1 9 9 6 至2 0 0 0 年5 年的经验， 其问总接有l 亿2 5 0 0 万公顷( 3 亿多英亩) 的转基因作物在全球范围内种植，这些已经充分证明， 转基因食品的早期承诺正在日趋符合广大工业化和发展中国家大户和小户农民们的期待。大量的 事实证明，无论世界上工业化国家还是发展中国家的农民们他们都是依靠自己的独立决策在5 年间将转基因作物的种植面积增加了2 5 倍之多。所以，我们有充分的理由和十足的信心说明， 转基因作物可以为全球的粮食、饲料和纤维工业及其安全作出自己巨大的贡献。转基因食品 ( g m o s ) 代表了可对全球粮食、饲料与纤维安全作出极大贡献的充满希望的新技术。 5 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 3 转基因农作物与食品的检测方法 随着转基因植物的迅速发展，转基因植物( g m o ) 食品大量涌向市场。出于对人类健康的考虑， g m o 食品标识制度在世界范围内受到人们普遍关注。鉴于目前越来越多的国家要求对转基因产 品实行标签制度，所以对产品( 尤其是进口产品) 进行转基因成分的检测，确定是否含有、含量 多少以及什么种类的转基因产品，是摆在各国政府面前的一项急需解决的问题。 根据所检测的生物大分子的不同，这些方法可分为对外源基因的检测和对外源蛋白的检测2 大类。对g m o 食品的外源基因的检测主要是以d n a 为基础的方法”，另一种是从对外源蛋白 的检测水平出发的的检测方法1 。p c r 技术应用于转基因产品的检测，其灵敏快速简便的特点是 其它检测技术所无法比拟的”“。荧光p c r ( f l u o r e s c e n c ep c r ，f p c r ) 技术集p e r 和探针杂交 技术于一体，是目前最先进的p c r 技术将f p c r 技术用于转基因食品的检测，无疑会有很高的 研究和实用价值。但由于此技术的高成本而使其实际应用受到限制“2 “”1 。此外还有生物芯片技 术( b i o c h i p s ) 、侧流技术( l a t e m l f l o w ) ”“。因为前两种检、铡方法是目前应用较好、适用面较广的方 法，所以下面着重介绍前两种方法和重点介绍p c r 检测法及影响p c r 检铡方法的因素，目的是 为我国g m o 检测提供技术上的支持。 1 3 1 针对d n a 为基础的外源基因检测 1 3 1 1 外源基因的定性检测“ ( 1 ) 多聚酶链式反应( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ) ：简称p c r 技术，是近年来发展起来的一 种体外扩增特异d n a 片段的技术。此方法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异 的d n a 序列的拷贝。p c r 技术虽然闯世时间很短，但它已经迅速渗透到分子生物学的各个领域。 在分子克隆、遗传病的基因诊断、法医学、考古学等方法得到了广泛的应用”3 “1 。 人们为了从生物材料中获得某一特定的d n a 序列或进行其序列分析、鉴定，按传统的方法 要经过d n a 酶切、连接、转化等步骤构建含有目的基因的d n a 克隆，然后导入细胞进行扩增， 再经过同位素标记的探针的筛选等过程。虽然技术上己无难点，但操作复杂，一般需要数周到数 月的时间。而p c r 技术可在数小时内对仅有几个拷贝的基因放大百万倍，大大简化了传统的分 子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行扩增、鉴定和分析。 p c r 技术的原理如下：p c r 技术实际上是在模板d n a 、引物和4 种脱氧核昔酸存在的条件 下依赖d n a 聚合酶的酶促合成反应。p c r 技术的特异性取决于引物和模板d n a 结合的特异性。 反应分三步： 1 ) 变性( d e n a t u r a t i o n ) ：通过加热使d n a 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链d n a 。 2 ) 退火( a n n e a l l i n g ) ：当温度突然减低时由于模板分子结构比引物复杂的多，而且反应体 系中引物d n a 的量大大多于模板d n a 的量，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模 板d n a 双链之间互补的机会较少 3 ) 延伸( e x t e n s i o n ) ：在d n a 聚合酶和4 种脱氧核苷酸三磷酸底物及m g ”存在的条件下， 5 3 的聚合酶催化的引物为启始点的d n a 链延伸反应。 以上3 步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时后，介于两个引 物之间的特异d n a 片段得到了大量复制，数量可达到2 x 1 旷7 拷贝。 p c r 反应原理示意图如下： 6 中国农业_ 人学硕士学位论文第一章文献练述 i 卷裂a 5 5 退火 i i， 口 + 7 2 三兰竺一 模扳变性、退火 一 延伸 l 第二次循环 _ 亡 一 口 口 图l jp c r 反应原理示意图 f i g 卜1s k e t c hm a po f t h ep r i n g i d l eo fp c r 经高温变性，低温退火和中温延伸3 个温度的循环，模板上介于两个引物之间的片段不断的 得到扩增。每循环一次，目的d n a 的拷贝数加倍，随着循环次数的增加，目的基因以2 ”- 2 n 的形 式堆积。p c r 扩增的特异性是由人工合成的一对寡聚核苷酸引物所决定的。在反应的最初阶段， 原来的d n a 负担着起始模板的作用，随着循环数的递增，由引物介导延伸的片段急剧地增多而 成为主要的模板。因此，绝大多数扩增产物将受到所加引物的5 末端的限制，最终介于两种引 物5 之间的d n a 片段。 影响p c r 因素： 1 ) p c r 反应缓冲液：p c r 反应缓冲液是一个重要的影响因素，特别是其中的m 9 2 + 能影响反 应的特异性和扩增片段的产率。在一般的p c r 反应中，1 5 - 2 o m m o l lm 9 2 + 比较合适。( 对应的 d n t p 浓度为2 0 0pm o l l 左右) 。m 9 2 + 过量能增加非特异扩增并影响产率 现在认为限制k c l 和明胶的用量值得提倡，尤其是b s a ，虽然对酶有一定的保护作用。但 如果质量不好将起到相反的作用。建议使用乙酰化的b s a 。k c l 在5 0 m m o l l 时能促进引物退火， 大于此浓度时将抑制t a q 酶的活性。 在p c r 中使用1 0 5 0 m m o l lt r i s c i ，主要靠其调节p h 使t a q d n a 聚合酶的作用环境维持在 偏碱性。t r i s 缓冲液是一种双极化离子缓冲液，p k a w e i 8 3 ( 2 0 ) a 在反应体系中加入适量的( 1 0 ) 的d m s o ( 二甲基亚砜) ，虽然d m s o 对聚合酶活性有一 定抑制作用，但它可以减少模板的二级结构。提高p c r 反应的特异性。有报道指出，甲酰胺或 氯化四甲基胺( t m a c ) 均可提高反应特异性，面对酶活没有明显影响。 7 ，丫 ，-， 串嚣农业大学碗士学位论文 第一章文献综述 2 ) 底物( d n t p s ) 浓度： d n t p 有较强的酸性，使用时应以n a o h 将p h 值调至7 0 8 ，5 分装小管。于2 0 c 存放。过多 的冻融会使d n t p 产生降解。在p c r 反应串d n t p s 浓度应在2 0 - 2 0 0 “m o u l 。d n t p 浓度过高 会加快反应速度，同时还可以增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的d n t p 会导致 反应速度下降，但可以提高实验的精确性。4 种d n t p 在使用时必须以等量浓度配制，以减少错 配误差和提高使用效率。此外由于d n t p 可自g 与m g ”结合，因此，应注意m g ”浓度与d n t p 浓度之间的关系。 3 ) p c r 反应的酶及其浓度： 最早用于p c r 反应的酶是k l g n o w 酶。由于该酶对高温耐受性差，每次变性时绝大多数酶失 活，所以每经过数个循环后应重斩添加新酶。导致实验复杂化而且增加成本，以后有分别使用 t 。d n a 聚合酶和t ，d n a 聚合酶。均因为耐热性较差而使其使用受到限制。后来发现的t a q d n a 聚合酶有很高的耐热性，加酶次可完成整个p c r 反应。 在1 0 0u1 反应体系中，一般所需t a qd n a 聚合酶的用量为0 5 5 u 根据扩增片段的长短及其 复杂程度( g + c ) 含量不同而有所不同使用的浓度过高，可引起非特异性产物的扩增，浓度过低则台 成产物量过少。不同厂家生产的酶的定义和生产条件不一，可根据具体情况区别使用。 4 ) 引物： p c r 反应引物浓度一般为o 1 4 ) 5um o l l ，引物浓度偏高会引起错配和非特异产物的扩增， 两且会增加引物之间形成二聚体的机会。这两者还因为竞争使用酶、d n t p 和引物，这些均会引 起d n a 合成率下降。 5 ) p c r 反应条件的选择： p c r 反应过程只需几经过几个简单的温度变换即可短时间内在试管内完成。 p c r 反应酋先是以双链解离为单链，有刹于引物的结合。一般条件下选择9 4 c 3 0 秒可使可 使各种复杂的d n a 分子完全变性。过高温度或持续时间过长，会使聚合酶活性和d n t p 分子造 成损伤。 变性后的d n a 很快冷却到4 0 6 0 c ，可使引物和模板d n a 发生结合。主要是因为模板d n a 结构比引物要复杂得多，引物和模板之闻蠹皇碰撞枫会要大大高于模扳互补链之间的碰撞。复性温 度的选择可根据引物长度和g + c 含量确定。长度在1 5 2 5 b p 之间时，引物的退火温度可通过t _ 1 4 ( g + c ) + 2 ( a + t ) 计算得到。在t - 允许范围内，选择较高的退火温度可降低引物与模板之间的非 特异性结台，提高反应特异性。退火时间设置为3 0 秒，足以使引物和模板之间完全结合。 p c r 反应的延伸温度在7 0 - 7 5 c ，此时t a q 酶活性最高。当引物在i 6 个核苷酸以下对，过高 的延伸温度不利于引物与模板的结合。此时可采用温度缓慢升高的方法。因为最初较低温度下， d n a 聚合酶以催化延伸反应开始，随后的较高温度并不会对延伸产生影响。延伸的时间可根据扩 增的片段大小加以确定。一般1 k b 以内的片段延伸1 分钟已经足够。1 k b 以上的片段则需延睦延 伸时间。 其他参数确定后，p c r 循环次数主要取决于模板d n a 的浓度。理论上说2 0 2 5 次循环后，p c r 产物的积累即可达到最大值。实际操作中由于每步反应的产率不可能达到1 0 0 ，因此，不管模板 浓度为多少。2 0 一3 0 次是比较合理的循环数。次数增多会增加非特异产物的量”。 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 根据所选择的用作模板的外源基因的不同p c r 实验可分为不同的类型。 1 ) 专一性检测 所选择的扩增靶序列既包括启动子又包括特定的外源基因的检测。这类检测的难点为未知目的 基因的情况下较难检测，因此对此类基因的检测较难，所用的引物只能是g e n e b a n k 中已经公开发 表的商品化的基因作为参照。鉴于转基因实验每天都有成百上千，所以此检测专一性要求强”“。 2 ) 不具有专一性的检测 此时所选择的d n a 序列是广泛存在于转基因植物中的序列，如3 5 s 启动子和n o s 终止子， 这种扩增能检测出多种不同的转基因食品。h e m m e r r w 等报道在已批准的2 8 种转基因作物中， 有2 2 种包含3 5 s 启动子，1 6 种中包含n o s 终止子，目前3 5 s 启动子和n o s 终止子覆盖了已经批 准商品化的转基因作物的7 0 - - 8 0 ，所以最普遍采用的筛选方法是检测两者。因此对它们检测既 具有代表性又具有典型性，这种方法是目前各国普遍采用的方法之一。 通过检测3 5 s 启动子和n o s 终止子来检测转基因食品的方法已被瑞士和德国确定”，并在 1 9 9 8 年被欧盟采纳。但这种方法对于不含3