血清中葡萄糖浓度的测定ppt课件.ppt

血清葡萄糖浓度的测定（GOD-POD法）,1,实验目的,掌握酶法测定血清葡萄糖浓度的原理。掌握血糖变化的临床生理意义。,2,知识窗,酶法分析是指用酶作为工具定量测定某种物质含量的分析方法。定量分析的目标可以是酶的底物，辅酶，也可以是酶的激活剂或抑制剂。其分类如下：,单酶反应定量法：指用一种酶为工具酶定量测定某种物质的方法。偶联酶反应定量法：当单酶反应底物或产物反应底物或产物噢物理化学手段无法区分时，还可以借助另一种酶作为指示酶，通过偶联反应进行定量分析。,由于酶法检测具有快速、渐变、准确、无不良反应、灵敏等优点，现已逐步取代其他方法，在临床诊断中应用广泛。(详见实验教程P103-104),3,实验原理,酶法测定血清葡萄糖是用以过氧化物酶作指示酶的偶联酶反应定量法。葡萄糖氧化酶（GOD）利用氧将葡萄糖氧化成葡萄糖酸，同时释放出过氧化氢。过氧化物酶(POD)催化过氧化氢氧化色素原，并使色素原氧化成红色醌类化合物（色素），即Trinder反应。其生成量与葡萄糖含量成正比。,补充：葡萄糖氧化酶(GOD):是从特异青霉（Penicilliumnotatum）等霉菌和蜂蜜中发现的酶。近白色粉末,溶于水，几不溶于乙醇、氯仿和乙醚。最适pH5.2最适温度55C过氧化物酶(POD):是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶,它们能催化很多反应。过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶。主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。,4,实验器材与试剂,（一）器材5ml移液管，50或100ul微量可调式移液器721E型分光光度计，37度恒温水浴锅,（二）试剂（1）0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）：称取无水磷酸二氢钠8.67g,称取无水磷酸二氢钾5.3g，溶于蒸馏水800ml中，调节pH=7.0,定容至1L（2）酶试剂：取过氧化物酶12000U，葡萄糖氧化酶1200U,4-氨基安替比林10mg，叠氮化钠100mg，溶入磷酸盐缓冲液80ml中，用磷酸盐缓冲液定容至100ml，置于4保存。,5,（3）酚溶液：称取重蒸馏酚100mg，溶入蒸馏水100ml中，用棕色瓶储存。（4）酶酚混合试剂：将酶试剂及酚溶液等量混合，4可放一个月。（5）苯甲酸钠溶液(12mmol/L)：称取苯甲酸钠1.6g，于800ml蒸馏水中加温助溶，冷却后加蒸馏水定容至1L。（6）葡萄糖标准储存液（100mmol/L）：称取已干燥至恒重的无水葡萄糖1.082g，溶入约70ml12mmol/L苯甲酸钠溶液中定容至100ml。2h以后方可使用（7）葡萄糖标准工作液（5mmol/L）：吸取葡萄糖标准储存液5.00ml，用12mmol/L苯甲酸钠溶液稀释至100ml。,6,操作步骤,取试管3支，按表操作,混匀，置37水域中，保温25min,在波长510nm比色处，以空白管调零，读取标准管及测定管的吸光度,血清中葡萄糖浓度的测定,7,反应式葡萄糖O2H2O葡萄糖酸+2H2O22H2O2+4-氨基安替比林+苯酚红色醌类化合物计算公式血清葡萄糖浓度=A测定/A标准*5mmol/l(根据朗伯-比尔定律:Aklc)参考值：空腹血清葡萄糖浓度：3.896.11mmol/L,GOD,POD,8,血糖检测如果不及时送检和分离血清，全血中的血细胞会酵解血清中的G加以利用，使血糖的检测结果偏低葡萄糖氧化酶法检测血糖时，由于血清中还原性物质(Vitc，谷胱甘肽、尿酸、胆红素等)竞争与过氧化氢(H2O2)反应，使反应生成的红色醌类化合物减少，检测结果偏低。受饮食、取血部位及测定方法的影响,血糖检测影响因素,9,注意事项葡萄糖氧化酶对-D-葡萄糖高度特异，溶液中的葡萄糖约36%型，64%为型。葡萄糖的完全氧化需要型到型的变旋反应。新配制的葡萄糖标准液主要是型，故须放置2h以上，待变旋平衡后方可应用。（1）葡萄糖氧化酶法可直接用于测定脑脊液葡萄糖含量，但不能直接测定尿液葡萄糖含量。因为尿液中尿酸等干扰性物质浓度过高，可干扰氧化酶反应，造成结果假性偏低。（2）对于血液样品需及时分离红细胞因红细胞的酵解将导致测定结果偏低，建议测定样品以草酸钾-氟化钠为抗凝剂以抑制糖酵解。（取草酸钾6g，氟化钠4g，加水溶解至100ml，吸取0.1ml到试管内，在80以下烤干使用，可使2到3ml血液在3到4天内不凝固并抑制糖分解）（3）严重黄疸，溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液，然后在进行测定。（4）试剂避免与皮肤接触，缓冲液中含叠氨钠、酚试剂有毒,10,临床意义,生理性高血糖：可见于摄于高糖食物后，或情绪紧张导致肾上腺分泌增加时。病理学高血糖：a糖尿病:病理性高血糖常见于胰岛素绝对或相对不足的糖尿病患者。b内分泌腺功能障碍：甲状腺功能亢进，肾上腺皮质功能及髓质功能亢进，引起各种对抗胰岛素的激素分泌过多，或升高血糖的激素增多引起的高血糖，现已归入特异性糖尿病中。c颅内压增高：刺激血糖中枢，如颅外伤，颅内出血，脑膜炎等，引起血糖增高。d脱水引起的高血糖：如呕吐，腹泻和高热等也可使血糖轻度增高。,11,生理性低血糖：见于饥饿和剧烈运动时。病理性低血糖：特发性功能性低血糖最多见，依次是药源性，肝源性和胰岛素瘤等。,12,思考题（1）标准葡萄糖储存液与应用液中都含有苯甲酸钠，苯甲酸钠起什么作用？（2）查文献，列举几种血清葡萄糖测定的方法与原理。答:化学方法：邻甲苯胺法，原理：葡萄糖为含一醛基的己糖，在酸性条件下加热，可脱水生成5-羟甲基-2-呋喃醛，后者与邻甲苯胺缩合成青色的席夫(schiff)碱(max=630nm),其颜色深浅与样品中葡萄糖含量成正比。(详见实验教程P143实验十三)；酶电极法，原理：葡萄糖氧化酶(GOD)在有氧条件下催化D葡萄糖(葡萄糖水溶液状态)氧化，生成D葡萄糖酸内酯和过氧化氢。过氧化氢与过氧化氢型电极接触产生电流。该电流值与D葡萄糖的浓度呈线性比例，在酶电极葡萄糖分析