实验三 细胞吞噬及ACP染色PPT课件.ppt

实验三,细胞吞噬和酸性磷酸酶染色（Gomori氏法）,1,一、实验目的,1通过观察四膜虫吞噬碳粒和豆奶的过程，加深对“细胞吞噬”的理解。2明确酸性磷酸酶(Acidphosphatase)与溶酶体的关系，理解溶酶体的生理意义。3.掌握酶细胞化学技术中Gomori法的原理和基本操作。,2,二、实验原理,1.细胞的胞吞作用（endocytosis）2.溶酶体（lysosome）3.酶细胞化学,3,真核细胞内穿梭着各种膜性囊泡，按照运动的方向，分为两种途径：,细胞质细胞膜,endocyticpathwayexocyticpathway胞吞途径胞吐途径,1.细胞的胞吞作用,4,胞吞作用（endocytosis）通过质膜内陷形成囊泡，将外界物质裹进并输入细胞的过程。,胞饮作用（pinocytosis）：溶液、小,吞噬作用（phagocytosis）：颗粒、大,根据形成的胞吞泡的大小和胞吞物质，胞吞分为两种类型：,5,胞饮泡和吞噬泡形成的机制完全不同,胞饮泡的形成,吞噬泡的形成,6,吞噬作用是生物体最古老的，也是最基本的防卫机制之一。是很多原生动物摄取营养的方式之一，原生动物门是动物界重最低等的一类真核单细胞动物，个体由单个细胞组成。通过鞭毛、纤毛或者伪足进行吞噬营养。多细胞动物中，只有某些特化的细胞具有吞噬作用：中性粒细胞和单核细胞的吞噬作用很强，嗜酸性粒细胞虽然游走性很强，但吞噬能力较弱。它们在防御微生物的侵染和清除衰老细胞或凋亡细胞方面具重要的意义。,7,四膜虫的吞噬活动活跃且吞噬泡易于分离，是一个研究吞噬作用的良好模型。四膜虫又可以进行大规模廉价的培养，是实验用很好的材料。,8,溶酶体是普遍存在于所有动物细胞（哺乳动物的成熟红细胞除外）中的细胞器，在不同类型及不同功能的细胞内，溶酶体的数量及分布不同。,红色荧光为溶酶体显色,2.溶酶体（lysosome）,9,溶酶体由单位膜包围，直径0.251m不等。溶酶体含有核酸酶、蛋白酶、糖苷酶、酯酶、磷酸酶和硫酸酯酶六大类50多种水解酶，最适pH在5.0，故均为酸性水解酶。其中，酸性磷酸酶是溶酶体的标志性酶。,10,溶酶体的主要功能溶酶体是细胞内的消化器官，细胞自溶，吞噬防御以及对某些物质的利用均与溶酶体的消化作用有关。吞噬作用：消化外来的营养物质或病原体自噬作用：消化细胞内受损、老化的细胞器或不被利用的大分子等。自溶作用：释放出酶将自身细胞溶解。细胞外消化作用：将酶释放到细胞外，如精子的顶体反应。,11,12,3.酶细胞化学,细胞化学技术（cytochemistry）是在保持细胞结构完整的情况下，借助细胞中的化学反应在原位确定细胞中的细胞器或大分子的分布及这些成分在细胞中的动态变化等的技术。,酶细胞化学技术免疫细胞化学技术放射自显影技术原位杂交技术,13,酶是生物催化剂。酶有高度的特异性，它仅作用于一种或一类底物。因而，将酶催化其底物形成的最终产物显示出来，也就间接地显示了酶。酶细胞化学是利用酶催化反应形成的产物能在光镜或电镜下被识别的原理，来研究酶在组织细胞内的定位及其活性变化的技术。,酶细胞化学技术,14,影响酶活性的因素,1）温度高于37时酶往往失去活性，通常合适的温度是4-37。,制作酶细胞化学的标本时，要求既要使细胞的形态结构保存良好，又要保持酶的活性。影响因素有：,3）新鲜组织的制片或冰冻切片,2）pH值酶的作用液通常采用恰当pH值的一定缓冲液来配置。,4）固定剂常采用甲醛、多聚甲醛或戊二醛固定，对酶的活性影响小。,15,酸性磷酸酶的显示原理,溶酶体含多种酸性水解酶，酸性磷酸酶（acidphosphatase，ACP）是溶酶体的标志性酶。利用酸性磷酸酶与底物反应后形成的棕黑色沉淀，可以显示溶酶体的分布。在溶酶体膜稳定完整时，底物不易渗入，ACP活力微弱或无活性。经固定，膜本身变为不稳定，逐渐改变其渗透性，底物可以渗入，在合适pH条件下，酶活力被显示。,16,反应过程：酸性磷酸酶在pH4.55.5时起作用，分解-甘油磷酸释放出磷酸基团，磷酸与铅离子结合生成无色的磷酸盐沉淀，磷酸盐再与硫化铵作用，生成棕黑色的硫化铅沉淀，从而显示出酸性磷酸酶所在的位置。-甘油磷酸钠甘油+PO43-2PO43+3Pb(NO3)2Pb3(PO4)2+6NO3-Pb3(PO4)2+3(NH4)2S3PbS（棕黑色）+2(NH4)3PO4,17,如何设计对照组？,对照1：将标本放入高温，使酶失活。,对照2：工作液中不加甘油磷酸钠，以蒸馏水代替。,对照3：氟化钠是酸性磷酸酶的抑制剂，可在工作液中加入（终浓度10mmol/L）。,18,三、实验材料、仪器和试剂,l每一个学生复式显微镜（带油浸物镜）（microscope）l每一组学生擦镜纸（lenspaper）；记号笔；小片滤纸；载玻片；移液枪（配套枪头）；染色缸含四膜虫的培养液（200l）；0.1%油烟墨汁（100l）；2%豆奶液（100l）；大染色缸：10%甲醛溶液；酸性磷酸酶作用液；0.2%硫化铵水溶液（现用现配）；水。l每四个学生香柏油（cedarwoodoil）、二甲苯（xylenol）；亮绿染液l整个实验班高速离心机2台；温箱1台；水浴锅2台；烘箱1台,19,1四膜虫呼吸需要氧气，因而在培养液中聚集在液面上方。可以对着光线观察。2.注意吸取四膜虫时将溶液混匀（可以用移液器吸出100ul再吹入溶液中，反复3次，注意不要吹出气泡！）。3.吸取四膜虫培养液100l加入到含有2%豆奶液的离心管中，反复吹打3次混匀，盖好管盖，管盖上做本组标记，放置7分钟。（此步是让四膜虫胞饮或吞噬豆奶，激活溶酶体）,四、实验步骤,20,43000rpm离心1分钟，谨慎取出离心管，不要晃动液体，迅速吸取上清100l（沿离心管侧壁从上往底部吸取，小心不要搅动底部的沉淀物），将这100ul豆奶液弃入水槽。然后吸取余下100ul液体，对着底部沉淀缓慢吹打，如此反复几次，将沉淀悬浮于所剩的100ul豆奶液中。（此步是通过低速离心浓缩四膜虫，去除一半体积的豆奶后，四膜虫在余下100ul的豆奶中有较大的浓度）,21,注意：,离心管放入离心转头时必须对称，对称放置的两个（或三个）离心管本身及其中所装液体的重量要相等。（对称平衡）,22,每人做两片：实验组；对照组,5取以上悬浮液10l，滴于一张干净的载玻片的下方，涂布成直径约1cm左右的圆。两片标本置32温箱中15分钟，令其彻底干燥。,23,6将两标本于10%甲醛溶液中固定10分钟，取出。放水中1分钟。7.取一片标本做记号，于100干烤10分钟（使酶失活，对照组）。另一片（实验组）置于室温。8将标本片放入酶作用液的染色缸中，将染色缸置于37水浴，20分钟。（一组四片）9水中浸泡，1分钟。换水后重复一次操作。10将标本片放入0.2%(NH4)2S中，反应1分钟。11自来水中浸泡，1分钟。换水后重复一次操作。12滤纸吸干玻片背面的水，待彻底干燥后用显微镜观察。注意两标本间的差异。,24,反应等待时间请做如下的实验：,1、在剩余四膜虫的离心管中，加入50微升的0.1%的油烟墨汁，混匀，立即吸取10微升滴于干净的载玻片上，10倍物镜下观察四膜虫吞噬碳粒的过程。2、观察后，将虫体在玻片上涂布开来，充分干燥后在亮绿中染色20秒，然后取出载玻片，在自来水中浸洗1分钟，干燥后再用40倍物镜仔细观察。,注意：如载玻片上有液体，只能用低倍镜观察！用高倍镜观察，必须加盖玻片！,25,五、预期的实验结果（见指导书彩图19、20）,细胞吞噬：在10倍镜下可见四膜虫在不停游动，吞噬碳粒。过一段时间后整个细胞呈现黑色，经亮绿处理后观察细胞中可见大小不同的黑色碳粒。酸性磷酸酶染色中，样本片中出现大小不同的小泡或斑块，呈棕色或棕黑色，即酸性磷酸酶所在的位置。对照片中细胞呈淡黄褐色，无吞噬泡形成的迹象。,26,标本彻底干燥后，40倍镜下观察,27,六、注意事项,1、实验应采用新鲜培养的四膜虫，如果四膜虫已培养一段时间，则制作的标本片中会观察到很多细胞碎片，效果不佳。2、如果固定后标本上的固定液没有洗净，会导致酶反应不足，造成结果不明显。3、如果细胞长时间和酸性磷酸酶作用液孵育，会造成酶和产物扩散，结果看到的棕黑色颗粒呈较大团状，影响观察效果。4、实验应设立对照，本实验采用高温处理使酶失活；或者也可以蒸馏水代替-甘油磷酸钠。5、硫化铵中反应时间过久会导致整个细胞棕黑色过深，影响观察效果。,28,Introduction详述胞吞作用（endocytosis）。简述溶酶体的概念和生理作用。简述酶细胞化学实验技术的原理及其实验注意点。Materials&methods用自己的语言小结Gomori染色的方法。Results简述实验结果，并画图表示在显微镜下观察到的实验组标本片中的图像。选择典型的四膜虫，绘制2个细胞。,七、实验报告,29,Discussion1.讨论实验为何出现你得到的结果。若实验结果不理想，分析是何原因？如何改进？2.对该实验有何意见或建议？Questions1.如果标本在工作液中孵育时间过久，可能会出现什么现象？2.实验结果中观察到是深色物质就一定是酸性磷酸酶吗？3.还有什么方法可以定位酸性磷酸酶？References,30,实验中有哪些方法和仪器用来计数细胞？讨论细胞计数仪的设计原理库尔特原理（Coulterprinciple）。,NextTopic,31,Requirements：,