（生物医学工程专业论文）应用型基因芯片的表面修饰.pdf

东南人学硕i ：学位论文 a b s t r a c t g e n e c h i p sa r ed n aa r r a y sc o m p o s e do fn u c l e i ca c i dp r o b e sa n da r r a n g e do nt h es o l i ds u p p o r tm e d i a a c c o r d i n gt ot h ed e f i n i t eo r d e lt h ek e ys t a g eo ff a b r i c a t i n gg c n e c h i pi sp r e t r e a t m e n to fs u b s t r a t e s s u r f a c e 1 ep r e t r e a t m e n tc a ng r o wa c t i v eg r o u pt h a tc a nb i n dt h ep r o b e se f f e c t i v e l yo nt h es u r f a c eo fs l i d e s a sar e s u l t ，t h ea c t i v e l yt r e a t e ds l i d e sc a us u i tf o rf a b r i e a t i n gh i 曲d e n s i t yg e n e c h i l t h i sd i s s e n a t i o n e m p h a s i z e st h e s u r f a c ec h e m i s t r y s t r a t e g i e s t h a ta t e r e q u i r e d t oe n s u r e i m m o b i l i z a t i o no fp r e s y n t h e s i z e da m i n o m o d i f i e do l i g o n u c l e o t i d ep 【_ o b eo n t ot h es u r f a c eo fg l a s sa n d p o l y c a r b n n a t ei nm i c r o a r r a yf o r m a t 1 1 l em a i nc o n t r i b u t i o n so ft h i sd i s s e r t a t i o na r ed e s c r i b e da sf e l l o w s ： 1 w eh e r er e p o r tv a r i o u sd e t i v a t i s a t i o n sf o rh i g h l ye f t i c i e n ta c l i v a t i o no fg l a s ss l i d e s o n rw o r ki s b a s e do f ft h ei n i t i a lm o d i f i c a t i o no f 蚰a s sw i t hp r i m a r ya m i n og r o u p su s i n ga m i n o p r o p y l t r i e t h o x y s i l a n ea n d i naf o l l o w i n g s t e p ，t h ea p p l i c a t l o n o fh o m o b i f u n c t i o n a j i i n k e r s ，s u c hem u t a r a l d e h y d eo f1 ， 4 - p h e n y l e n e d i i s o t h i o c y a n a t e ( p d i t c ) a n dp r e f a b r i c a t e dd e n d r i t i cm a c r o m o l e c u l e sw i t h4 8p r i m a r ya m i n o g r o u p si nj t so u t e rs p h e r ew h i c hc o u l ds u b s e q u e n t l yb ca c t i v a t e da n dc r o s s l i n k e dw i t hah o m o b i f u n c l i o n a l i i n k c l1 er e s u l t i n gd n am i c r o a r r a y sd e r i v a t i s e ds i m u l t a n e o u s l yw i t hd i f f e r e n t 啡t h o d sw e r es t u d i e db y t h ec o m p a r i s o no fr e l a t i v ea r e a ld e n s i t i e so fi m m o b i l i z e dp r o b e su s i n gt h en u o r e s e e n c es c a n n e r d n aw i t h r o o d i n c a t i o n sa t5 - e n dw a su s e di ns p o t t i n g ( 5 a m i n o 3 c y 3 ) t h er e s u l t si n d i c a t et h a ta l lc o u l db e o o e s s f u l l ya t t a c h e dt ot h ea c t i v a t e ds u p p o r t sm o d i f i e db ya l if o u rm e t h o d sa n dt h ed e n d r i m e r - a e t i v a t e d s u r f a c e sd i s p l a yas u r f a c ec o v e r a g cw i t hb e t t e rs p o th o m o g e n e i t ya n dh i 卫h e ri m m o b i l i z a t i o ne f f i c i e n c yt h a n t h a l l t h a tw i t hc o n v e n t i n n a lm i c m a r r a y sc o n t a i n i n gl i n e a rl i n k e r s 。h o w e v e r , t h e r ew e r es i g n i f i c a n t d i 虢f e n c e si nt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t i e sa c c o r d i n gt od m r e n tb a s i cb u f f e r s r e s p e c t i v e l y 2 a 1 ia c r i y l i c a c i d c o a c r y l a m i d ec o p o l y m e rf i l mw a sf a b r i e a t e do nm a s ss l i d e i tt h e ne m p l o y e d a c r y l i ca c i d 一一a c r y l a m i d ec o p o l y m e r a n d1 r 3 d i m c t h y l a m i n op r o p y l ) 3 e t h y l c a r b o d i i m i d e h y d r o c h l o r i d e n h y d r o x y s u e c i n i m i d ea st h ec o a t i n ga g e n t sa n da c t i v a t o r t h em o d i f i e ds l i d e sw e r eu s e df o r p r e p a r i n gd n am i c r o a r r a y s ，w h o s ep r o p e r t i e sw e r ea n a l y z e db yh y b r i d i z a t i o n t h es i g n a js p o t si nu n i f o i t s ， s t e a d ya n dr e g u l a rs h a p ei nc o m p a r i s o nw i t ht h ep d i t cm i d i f i e ds l i d e s ，w h i c hi n d i c a l e ds u c c e s s f u i m a n n f a c t u r eo ft h em i c r o a r r a y s f l u o r e s c e n ti n t e n s i t i e sa n db a c k g r o u n di n t e n s i t i e so ft h e s ek i n d so f s u b s t r a t e sw e r ea n a l y z e db ys o f t w a r et oe v a l u a t ct h ea p p r o p r i a t e n e s so ft h es u b s t r a t e s i n f l u e n c e so ft h e s u b s t m t e so nh y b r i d i z a t i o ue f f i c i a n c yw e r ee v a l u a t e da f t e rc y 3 一l a b e l e dd n a s a m p l e so fo l i g o n u c l e o t i d e1 0 t h ec o r r e s p o n d i n g3 6m e ro l i g o n u c l e o t i d ep r o b e s g n o dh o m o g e n e i t i e sw e r eo b s e r v e do na l lt h es u b s t r a t e s ， 3 d e r i v a t i s a t i o no fi n h e rp o l y e a b o n a t es u r f a c eo ft h ee p p e n d o r fc a pw h i c hi su s e di nt h e m i c r o a r r a y i n - a - t u b es y s t e mf o rp r e s y n t h e s i z e do l i g o n u c l c o t i d cm i c r o a r r a y si si n v e s t i g a t e d t h e m i c r o a r r a y - i n a - t u b es y s t e mw h i c hi n t e g r a t e sm u l t i p i ep c rp r o c e s s e sa n dd n am i c r o a r r a y sf o rm u l t i p l e v i r u sd e t e c t i o ni sar a p i d 1 a b o r - s a v i n gt o o lf o rm u l t i p l ev i r u sd e t e c t i o nw i t hs e v e r a ia d v a n t a g e s s u c ha s c o n v e n i e n c e ，p r e v e n t i o no fc r o s s - c o n t a m i n a t i o no ft h ep c rp r o d u c t s 。a n dp o t e u t i a lf o rm u l t i p l e g e n e d e i e c t i o n o p t i m i z a t i o no fp l a s m at r e a t m e n tc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e dt h r o u d lo r t h o g r a p h i c a l e x p e r i m e n t a t i o na n dac o n t a c ta n g l em e a s u r e m e n to fw a t e rd r o p l e t s ，x r a yp h o t o c l e c t r o ns p e c t r o s c o p y ( x p s la n a l y s i sc o n f i r m e dt h ep r e s e n c eo fp o l a ra m i n o - g r o u p so nt h es u r f a c e t h er e s u l t si m p l i e dt l l e p l a s m am o d i f i e dp cs u r f a c eh a de x t r e m e l yb i o l o 面c a la c t i v i t i e sa n db i o l c l 西c a la 甑n i t i e s k e yw o r d s ：d n a m i c r o a r r a y ；a m i n e - m o d i f i c a t i o n ；s u r f a c ec h e m i s t r y ；p o l y c a r b o n a t ep l a s m a 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导f 进行的研究：作及取得的研究成果。尽我所 知除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他人已经发表域撰写过的研究成桑， 也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同_ 1 ：作的同志对本 研究所做的任似贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：壶立童日期：! 星：兰 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图1 5 馆有权保留本人所送交学位论文的复印件和电 子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相 一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅可以公布( 包括刊登) 论文的全部或 部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：丝土墨导师签名：日期：丝! ：丝 第一章绪论 第一章绪论 早在8 0 年代初，有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基闪芯片，以对人类基冈大量的遗传信 息进行分析和检查，但直到1 9 9 4 年，由于人类基因组计划( h g p ) 的要求及光电化学的进展、光刻技术的 诞生，p e a s e 等人仓q 造的光导原位台成( l j g h t - d i r e c t e ds y u t h e s i s ) 高密、微化的寡核茁酸阵列f o d t a ) 的制 作技术“悯世之后，才使该殴想逐步成为现实，其基本技术原理与核酸杂交分子识别的原理一样，是基 于d n a 的碱基配对和序列互补原理。总之，基冈芯片技术是生物学家受剑计算机芯片制遗和广为应 用的启迪，融微电子学、生命科学、计算机科学和光电化学为一体，在原来核酸杂交的基础上发展 起米的一项新技术，它是第二次技术革命( 基冈组革命) 中的主要技术之一。 r 1 。基因芯片的研究现状 基冈芯片( g e n e c h i p ) ，又称d n a 芯片、d n a 微阵列( d n am i e r o a r r a y ) ，包括寡核苷酸微阵列f o l i 留o m i c r o a r r a y ) 及c d n a m i e r o a r r a y , 是将大昔的d n a 片段按预先设计的排列方式州化在载体表面，并以此 作为探针，在一定的条件下，与样品中待检测的靶基因片段杂交，通过检测杂交信号，实现对靶基因的存 在、含草及变异等信息的快速检测。基闻芯片是生物芯片( b i o - c h i p ) t # 庸埘最广泛、技术展成熟的分 支a 其概念来源于计算机芯片。一块基冈芯片相当于一个集成处理器 其中的每个探针相当下一个探 头，能对相关及大蹙信息实现同时、自动和快速青勺采集、传输、分析和处理，给出相席的检测、诊断结 果- 美国旧金山a f f y m e t r i x 公司的f o d o r 锋人充分结合并灵活运用了照相平扳印刷技术和计算机、 半导体、激光共聚焦扫描、寡核茁酸合成、荧光标记探针等技术制备了世界卜第一块高密度基闪芯 片“，与传统核酸印迹杂交方法相比，基冈芯片技术绝不仅仅是改变了载体和检测步骤，而最本质的 改变在于基因芯片是将大量按靶基冈的特征及检测要求预先设计的探针l 判化在支持物表面，一次杂 交可检测样品中多种靶基冈的相关信息，使基因芯片技术具有了高通鼙、多参数同步分析快速全白 动分析，高精确度分析，高精密度分析，高灵敏度分析的特点4 - 1 a l 。d n a 芯片技术一出现就在短短的 几年时问里得到不断的发展和完善。己有的资料表明该项技术在基因诊断、基冈表达研究、基闪组 研究、发现新基因及各种病原体的诊断等生物科学领域中【5 ；1 1 - 1 9 1 。具有重人应用价值。 1 1 1 基因芯片的制备技术 基因芯片制作主要包括芯片的制各、样品的准备、分子杂交和检测分析。 大体可以分为两类：一是点样法【“，即将c d n a 或合成的寡核苷酸片段通过机械手点加同定在 同体支撑物( 尼龙膜、硅片、玻璃片) 上；二是原位合成法( 在片合成法) 【2 3 ；2 4 即在【制体支撑物上通过可 控的微细加丁技术和组合化学原理直接合成预设计的d n a 微阵列，下面分别加以介绍。 1 ) 点样法 首先按常规分子生物学方法制备c d n a ( 或寡核苷酸1 探针库，然后通过特殊的探头和微探头，分 别把不同的探针溶液，逐点分配在玻璃、尼龙或者其它向相基片表面的不同位点上，通过物理和化 学的结合使之【司定于相应位点r 图1 1 1 。 2 ) 原位合成法p 辩一一攀 东南人学硕= 学位论文 基田芯片的原竹合成法是基于组合化学的合成原理，按精确殴计的分布和顺序，通过一组定位 模扳来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点平次序，运州现代高精度仪器和d n a 合成化学技术 在基片上直接并行定点合成所需的d n a 探针，这些合成的d n a 微探针即构成了高集成度的d n a 微阵列，即通称的“高密度基网芯片”。其特点是：不仅由于集成了成千上万的密集排列的基冈探针， 能够在同一时间内分析大鼙的基因，使人们迅速地读取遗传密码，而且就同样探针数鼙的基冈芯片 来说，由于可实现大批最、低成本的集约化生产，制作成本将远低于点样法制作的寡核茴酸基冈芯 片，并且重复性好。未来十多年分子医学将进入麻用，个人基闻档案的建立、发病过样_ 羊i 】新曲开发 研究将会对高密度基冈芯片产生很大的需求，冈此d n a 微阵列原何合成以及相关技术( 芯片微阵列 设计及探针优化、基片修饰改性、靶墓冈标记方法、结果检测及分析仪器等) 一直是研究的热点，代 表着基因芯片的技术水平和发展趋势。 光脱保护法 该技术为美国a f f y r n e t r i x 公司首创平拥有【3 ；2 5 删。图l ，2 为光脱保护合成技术原理。根据人为合 成寡核苷酸是由3 端开始而终止丁5 嗡的特点，该技术的核心是刨造性地在核苷酸单体的一端5 端 修饰了一个光敏基团及将微电子行业的光刻技术与d n a 合成技术有机地结合在进行d n a 微阵列原 位合成前，先设计好再阵列点对应的探针碱基序列，整个d n a 微阵列各探针的第一个碱基构成帮个 芯片上的第一层，第二个碱基构成第二层，然后按照各层碱基的分布情况每层设计四块掩模。 每张掩模的透光区域分别对席于该层碱基中四种碱基中的一种。在进行d n a 微阵列合成前，还需对 芯片基体材料进行一定的修饰处理。所谓修饰处理，就是通过一系列物理和化学处理过稃，使基体 材料表面带有可与核酸单体3 端共价偶联的功能基团r 如一o h 、c h o 币1 n h 2 等) 。表面功能基团的 密度对合成效果影响很大，过密的功能基团会冈空间倥阻作用而酶低核酸弁句偶联效率并妨硝随后探 针与靶基闪的杂交，过稀则冈灵敏度的限制而检测不到靶基冈。有效解决此种空间何阻的办法是在 基片与微探针之间增加一层手臂分子( a r m ，义称为连接分子l i n k e 0 。手臂分子一端共价偶联于基片， 另一端带有可与核酸单体3 端偶联的功能基团。一定长度的手臂分子由于具有较大的伸展与运动空 间，减小了界面反廊的空问何阻，可保证较高的偶联效率和探针密度，有利于在杂交过样中得到较 强的信号。在实施d n a 微阵列原位合成时，先在基片上偶联一层或若干层同种单体( 如d r ) ，然后 以第一层所对应的凹张掩模中的任一张，盖其上进行光刻使被照射区域上的光敏基团脱落，经洗涤 后，在被照射区域偶联与所使埘掩模对麻的单体。依此完成第一层其余三张掩模的操作，同层四张 掩模的揲作完成后即完成整个一层碱基的偶联。依此类推，直至整个d n a 微探针阵列原 i _ 合成完毕。 光脱保护的优点主要体现在下述方面：首先，由于采用了微电子行业的掩模加工技术，分辨率可达到 亚微米级，因此探针可达到非常高的密度。其次，该技术适台自动化合成生产，a f f y m e t r i x 己建有 一条基冈芯片自动化生产流水线。从目前各国的情况来看，该公司已成为国际上唯一已实现了生产 和销售商品化原位合成高密度基冈芯片的公；司。最后，由于偶联反应在溶液中进行，冈此偶联效率 高。主要缺点是：由于每张掩模都要完成一系列操作因此耗时较长，并需要运用高精度的重复定位 技术，而且由丁需要专有的光敏试剂及大量的掩模加工，导致成本仍然较高， h u ? l 业 u 琏兰裂未h 知h kk h j m h 燃吻撇 围1 。2 光脱保护台成技术原理 喷印合成法 压电印刷法主要是美国加州i c y e p h a r - m a c e u t i c a i s 公司和p r o t o g e n 公司所采用其原理类似于目前 所用的喷墨打印机：打印机头在方阵上移动，方阵每点上电流使喷头放大，并将装有某种碱基的试剂 2 嬲 ；| i 骥 一 业驻。强垛h殇掣糍 第一章绪论 滴出i “l 到晶片表面，然后同定。在洗脱和去保护后，另一轮寡核苷酸的延伸就可继续进行。这种 合成方式的各步收率超过常规的多7 l 玻璃( c o n t r o l l e dp o r e g l a s s ，c p g ) 合成法，一次可以台成4 0 5 0 个碱基k = 度的寡核苷酸，大量的寡核苷酸就可构成方阵j r 电印刷法由于不需要与载体表面直接接触， 故有很高的效率，但制造：艺还不太成熟。喷印技术使液体雾化为直行为1 2 5 u m 的小球，把这些 小珠喷射在基片表面通过移动喷头的位置，把微量的液体分配在基片表面的不同位置。通常的喷 墨打印机由墨盒、微喷嘴以及压力发生器等组成，其中微喷嘴决定喷出的液滴的人小。根据不同物 理方法平i i 结构，微喷头可分为压电毛细管喷头，压电微h 孛喷头、热压喷头、超卢喷头以及压振流体 喷头等类型。比较适合丁制备基冈芯片的喷头为压电毛细管喷头。该方法利_ 【 ；j 微喷头把d n a 合成试 剂按一定的顺序依次逐层地喷印在基片表面的不同位置上在玻璃基片上合成d n a 阵列。首先在玻 璃片上修饰一层一端为羟基的手臂分子，通过微喷头把d n a 合成试剂( 磷酸二脂法) 喷印在玻璃表面 的特定位置，形成二维点阵分布。可以同时用不同喷头分划喷印四种不同碱基的d n a 试荆。完成一 层的乐印后，玻璃进行冲洗、封刚、氧化平脱保护等常规的化学处理。接着，削喷头进行下一个循 环的合成，直至合成完所需氏度的探针。另种原位合成模式为j j 喷头喷射三氯乙酸脱保护试剂， 激活玻璃片上特定点阵核苷酸5 。端的氨基。整个台成系统安装在一个充满氮气的系统中，用计算机 对喷印、化学处理等各个过程进行控制。 。 光致酸合成法 h o u s t o n 大学的g a o 等提出了运用光致酸溶液进行寡核苷酸合成的方法。其核心是以含有 t r i a r y l s u l f o n i u mh e x a f l u o r o a n l i m o n a t e 等在光照时可以产生质子的物质溶解在c h z c 】2 等溶剂中作为光 致酸试剂。当将吲定有核苷酸的基体材料浸泡在该种溶液中时，如果旋以光照，在光照区域就会产 生质子而脱去相应区域核苷酸上5 端的保护基团而暴露出反应活性的5 端o h 基团，为f 一个核酸 单体提供了偶联传点。此技术若能发展成熟，同样是一条经济实用的途径。目前光致酸合成方法在 技术上尚不成熟，报道的往控孔玻璃珠( c o n t r o l l e dp o r o u sg l a s s ) 上的偶联效率只有9 2 ，继续提高偶 联效率是个需要解决的问题此外，可以想象，在光j ! ( 后的洗涤中，所产生的酸将会污染未光照区。 导致本不戍脱保护医域也会脱傈护使随后的偶联反应，f = 不只发生在指定区域，必然导致d n a 徽阵 列合成火败。冈此，如何控制光致酸对相邻犀域的污染是将该技术应用于d n a 微阵列原位合成时一 个有待解决的难题。 电喷雾合成法 纽约大学化学系和俄罗斯科学院理论与实验生物物理研究所的m o t o z o v a 等在1 9 9 9 年报道了一 种电喷雾脱保护生物探针微阵列原何台成技术口”。该技术的特点是，制作系列带有微通孔的母板 替代基于光刻技术制作的掩模，母扳上微通孔的排布方式与前述掩模透光区域一致，是按微阵列台 成要求而设计和制备的。在进行生物分子微阵列合成时，将微通孔母扳密台覆盖在己岗定带有保护 基团的基片上，脱保护试剂在电场的作用卜- 通过微通孔母板与基片接触脱保护。该技术发展成熟后， 也不必为一条经济实t j 的途径。电嵝雾合成摹冈芯片的过程中由于加f 。微孔阵列的困难，微阵列 点阵密度受到限制。此外，从报道的结果来看，可能由丁受到母板和液体带电性质及孔加l 的影响， 所得结果点阵人小著异较人，这将影响结果的分析处理。另外还须特别重视的是如何实现微通孔母 板与基片之间的密合，旦密合不好，电喷雾脱保护时相邻区域之间会串流而导致微阵列原位合成 失败。 虚拟掩模法 掩模制作是基于微l 毡子光轰4 技术进行d n a 微探针阵列原位合成的主要成本之一。为了降低成 本，w i s c o n s i n 大学s u s s m a n 小组提出了虚拟掩模法口j ，即采朋计算机生成的明暗掩模图案替代铬板 掩模直接作用于基片，可简化制造过程而降低成本。他们采h j 虚拟掩模技术研制出可_ j 丁高密度基 因芯片在片光定位平行仑成的装置，成功地在1 6 r a m 2 表面上制备7 6 , 0 0 0 种d n a 探针，使整个基因 苍片的制备时间降至8 小时。虚拟掩模法的主要缺点在于绕射作坩导致i _ ! f 界不清晰。冈而影响曝光 效果自然就影响到合成效果。如何消除这一负面作用，是发展该技术一个迫切需要解决的问题。 如果能成功地解决，将在两方面产生重大影响：首先，可省去实体掩模的制作，因而降低了基因芯片 的制备成本。另外可省去重复定位的要求从而简化了1 艺过程，降低了成本，提高了d n a 微探针 合成的可靠性， 分子印章压印法 东南大学硕一卜学位论文 寡梭茁酸的同相台成方法主要有磷酸酸胺法、氢磷酸酯法和磷酸三酯法三种三种方法的主 要区别在于偶联反应中所使用的单体及催化荆不同。弧磷酸酸胺法使片j 砸磷酸酯胺单体及四唑催化 荆：氢磷酸酯法使心氢磷酸酯单体及酰氯催化荆；磷酸三酯法使用磷酸二酯单体及苯磷酸催化剂。因而 三种方法中偶联反麻的机理及条件也不相同，但其余步骤的反应则入致一样。对于寡核苷酸的嗣相 合成偶联反应是决定其偶联效率的最主要因素。就三种合成方法而言亚磷酸酰胺法最适合分子 印章法d n a 芯片制备中寡核苷酸的同相合成。第一，亚磷酸酰胺法的偶联效率很高，通常在9 9 以上；第二，皿磷酸酰胺法中偶联反麻的时间很短，通常3 0 秒内反应就能完成。这两点对压印偶联 反应尤其重要，冈为压印反廊中涂抹在印章上的反应液鼍很少。反应时间疑的诱，则印章上反应物 中溶剂会挥发掉，导致反麻处于向体状态而使偶联效率降低。因此，选择砸磷酸酰胺法来合成d n a 芯片制备所需的寡核茁酸。 分子印章法起源丁软光刻法，软光刻法是由w h i t e s i d e sgm 小组发明并摄先在微米及弧微米结 构制备中应片j 的一种幽形转移方法。这一方法目前除j 。泛被材料学家使明外，近年来己受到化学及 生物学家的广泛关注。他们将要研究的对象通过高分子聚合物弹性印章次性转移到刷体表面来研 究蛋白质、神经网络等生物分子的性质以及自组装等方面的问题。分子印章法制备d n a 芯片是将不 同图案的印章作为基片上不同位置寡核苷酸合成的模板，将磷酸酰胺法寡核苷酸合成路径构成一 个循环完成一个核苷延伸的偶联、封闭、氧化和脱d m t 四个反应，其中每一步反应由印章压印 完成并实现圈形转移印章的制备及压印化学反应原理见图1 3 。用预聚体在有图案的模板上制备出表 面具有幽窠的高分子弹性聚台物( 简称印章) ，在印章上涂布欲反应的反应渡，当印章压印于阃相载片 时，印章凸出阵点便与削相载片接触从而使处于与印章凸出阵点接触位置的同相载片发生化学反 应【2 9 ；刈。 a 巴黧 b 亡= = 刍 亡每酗 l 一j ( a ) ap h o t o r e s i s tc o a t e do nt h eg l a s sp l a t e ，c o ) ap a t t e r nf o r m e db yl i t h o g r a p h y , ( c ) p r e c c u r s o rs o l u t i o n o fp d m s ，( d ) p o l y d i m e t h y l s i l o x a n em i c r o s t a m p ，( c ) s p r e a d i n gc h e m i c a lr e a g e n t so nt h es u r f a c eo ft h e s t a m p ，( dd e l i v e r i n gr e a c t a n t so n t ot h em o d i f i c a t i o ng l a s ss l i d eb ys t a m p i n ga n dt h e nc o n d u c t e dc o u p l i n g , ( 、an e wm o b o l l b e fw a sb o n do n 也es n b s t r a t e 蚓1 3g e n e - c h i p 制作漉脞示恿 根据压印化学反应原理，分子印章法寡核苷酸微阵列制备的原理如f ：由于寡核苷酸是由a ，g c ， t 四种核苷组成，冈此无论d n a 芯片上不同位置的寡核苷酸序列怎样，这些不同位置、不同序列的 寡核苷酸以基片为起点将最靠近基片的碱基称为第一个碱基并依次往f 推，所有的不同序列的寡核 苷酸的第一个碱基构成d n a 芯片上第一层的碱基并依次下推。然后将同一层上相同的碱基通过一个 印章模板来台成，这样组合后完成一层核昔延伸的印章数为4 ，欲制备n m e r 寡核苷酸的阵列则需 要4 + n 个不同印章。因此分子印章法寡核苷酸微阵列制备包括印章幽案的设计、印章的制备和寡核 苷酸的合成。采用分子印章压印法制备高密度d n a 芯片，不仅可以节省大量的试剂开发费用，缩短 研发周期，而且磷酸酯胺法合成寡核苷酸的单步合成效率高，可提高制备d n a 探针的正确率。同 时，硅橡胶分于印章分辨率离，可达到弧微米精级，有望提高基因芯片制各的集成度。但是，有时 4 餮一 e f f ： 第一章绪论 会冈为压印不均匀而影响结果的正确性。若采用有机高分子聚合物作为基冈芯片基片材料，由于其 具有柔韧性，将可以更好地与印章表面接触，有望取得好的压印反应效果；但有机高分f 聚合物表面 常常旱现化学惰性，即使不为惰性，也不一定具有可与核哲酸单体化学偶联的活性功能基团，因而 需要对这些材料进行表面修饰改性，使其员有能够化学【苟定核营酸的活性基团。但是许多有机高 分子化合物因含有杂质、填料或不饱和基团而具有强的荧光背景，使 j 这样的材料作为基因芯片基 片材料时，所制备的基因芯片将无法使川现在基网芯片普遍使h j 的基丁| 荧光分析技术的芯片扫描仪 来分析杂交结果。为了使基于改性的有机高分子聚合物制备的墓因芯片能够h j 丁荧光分析，麻该设 法消除这种荧光背景，若无法消除荧光背景，则可麻州时阃分辨荧光分析技术或其它1 f 荧光分析方 法来分析杂交结果，例如基丁纳米金标记的“金标- 银染放人”纳米分析技术就是1 f 常实川而灵敏的非 荧光分析方法。 1 1 2 载体的活化 在芯片的制备中首要面对和需要解决的问题，是把d n a 片段和寡核苷酸探针沉积并结合在同相 载体表面，即核酸的嘲定化。这种固定或结合不仅要求精确、再现性好同时要保证核酸或再己体在 连接反应和随后的分析中稳定存在。因此能否在载体表面特异、快速和稳定地同定符种核酸探针， 这将直接决定微阵列的效率，在芯片的制备中起着关键性的影响。近年米，在同体支撵载体上同定 核酸( 寡核苷酸，c d n a , p c r 产物等) 分子来制备d n a 微阵列已成为制作基闻芯片或微型化杂交阵列 的领先技术之一。这种同定d n a 的表面也逐渐地成为了一项重要的生物学和医学的研究工具。 载体 d n a 微阵列的制作过程中，载体的选择与处理是关键步骤之一。一个理想的载体廊符合以一f ) l 个要求：允许探针有效地同定在其表面，并有利丁靶基冈与探针结合f 杂交) ；能耐受表面化学处理和各 种酸碱性物质的清洗；具有良好的光学性质，适台透射光或反射光的检测，且荧光背景低。目前，可 片j 于制作基冈芯片的载体材料1 3 1 - 4 2 1 麻包括4 类：无机材料、天然有机聚台物、人i ：合成的有机高分子 聚合物和各种高分子聚合物制成的膜基片。但目前适h j 的材料只有玻璃片、金属片年各种有机高分 子制作的薄膜等少数儿种，较早_ j 于制定d n a 的表面是孔结构的尼龙膜、硝酸纤维亲膜。这类材料 的主要优点在丁具有一定的孔性网络结构且带有强正电荷、吸附性强、样品容量大，可以容纳较丈 量的d n a 探针分子，可以反复使_ l j 多次。但冈d n a 在其表面易渗透，向周围扩散，无法制各高密 度的基冈点阵，且随着检测次数的增多，背景干扰增强，膜性材料逐渐被玻片、硅片等不渗透的实 性材料替代。 目前，在基冈芯片制作中，核酸同定最常用的载体是玻片。与其他材料相比平面玻璃载体有 如下优点1 ) 价廉；2 ) 所需d n a 样品能以共价结合的方式同定在预处理的玻片表面：3 1 耐高温，能经 受高离子强度溶液的清洗；4 ) 玻片是1 f 7 l 性材料，杂交体积可以减至强小，从而加快了探针与靶基因 之间杂交和退火的动力学过程；5 ) 玻片荧光信号本底低，背景干扰小；6 ) 可使用般荧光甚至多荧光检测 系统在个反应中同时对两个以上的样晶进行并行处理。由丁玻片是平面结构，上样量小使得检 测的灵敏度低，。为了克服这一缺点，国内外研究人员致力于对玻片表面进行改性，通过各种化学反 应在表面上引入各种官能团。( 如氨基、醛基、羧基、环氧基、巯基等p 戋形成胶垫( g e lp a d ) 、孔状 的立体网架结构等使d n a 与表面官能团能共价结合，稳定地瑚化于支持物表面，提高上样量，增强 点阵的打印密度。 随着生物技术与微电子技术的结合，非氧化品体砷也作为载体被引入生物芯片制作中。非氧化 晶体硅作为支撑载体有如f 优点：高纯、高度组纵密度和限制性品格结构、稳定性好，在微电子n t 业 中有着独特地应用。n a n o g e n 公司将杂交技术与微电子技术结合于一体，有目的地通过电子装置检 测或控制d n a 等生物大分子作用过程制作了集成电路型的基闻芯片。在以非氧化品体砖为载体的 生物传感器研究中，把所需忙d 定的d n a 整合到电路，要求所州定d n a 分子的表面与整合的微电子 格式相匹配。因此，利用化学方法，对无氧化层的硅片表面进行功能修饰，为合成高度集成、可控 性妻f 的d n a 吲定提出了新的解决途径。 载体活化 通常指对载体( 介质) 材料表面的修饰过程，即通过化学反应用不同的活化试剂在载体表面键合上 5 东南人学硕l 。学位论文 各种的活性基团，以便与不同的活性生物分子( 如核酸、多肤、蛋白质等) 上的相戍基团通过共价键形 式连接，形成具有不同生物特异性的柒和载体。表面化学处理后载体表面应平鞋均一，表面性质可 控性好。同对热稳定性和化学稳定性好，与d n a 州定后重复性好。如果表面预处理不好，就不能有 效地在载体表面嗣定探针而载体表面预处理的理想化学方珐必须满足1 4 州：连接稳定，间隔臂有足 够宽度不对杂交产生立体能阻，有足够的亲水性且不与载体发生1 # 特异性吸附等，通常选州结合较 为牢同的共价交联方法m 1 为能选到原位合成高密度基田芯片的要求，必须对载体表面进行严格表面 预处理，即在载体表面生长活性基团，使载体表面的活性基团通过共价交联方法有效地i 古j 定探针。 因此，人 j 对表面进行各绅化学政性的研究，在介质表面衍生出氨基、醛基、异硫氰酸基及环 氧基等活性基团。目前，最常她的改性载体表面是氨基砖烷和多聚左旋赖氢酸( p o l y - l - l y s i n e ) 包被的 玻片。有研究者采用3 一氨丙基三甲氧基砗烷对玻璃表面进行氨基硅烷化氨基与1 ，4 弧苯基二异硫 氰酸酯产生氨基敏感表面。5 氧基修饰寡核苷酸与之反麻，探针结合浓度可达1 3 0 f m o l c m 2 。还可以 利j j 分别与氨基及巯基反应的异础般官能团，还可将末端巯基修饰的寡核苻酸交联剑这种氨基修饰 的玻璃表面。m i k b a i l 等人剧氮基脲f s e 疵一c a r b a z i d e ) 包被玻片，与苯甲醛修饰的寡核苷酸发生共价 连接，反应快速、高效。d n a 结合的稳定性好。另外一种较为常用的方法是利用环氧砖烷化试剂修 饰玻璃表面进而交联伯胺基连接的寡核茁酸。将玻璃或硅片与伽玛环氧丙基三甲基硅烷反应得到 环氧化单层，3 氧基修饰的寡核计酸形成仲氨交联到l 州体表面，探针结合浓度达1 6 f m o l c m 2 。c h r i s t y l i n d a a 等研究了多种氨基硅烷化试剂、异型砹官能团化合物交联巯基修饰寡核苜酸，并用紫外( u v ) 光谱、接触角、放射性标记和杂交等方法对结合表面进行丁表征。 固定机理 基冈芯片的制各有两种方法，第一种是原位合成法，印采用显微光刻技术或压电打印、分子印 章等技术，直接在修饰改性的表面上原位合成寡核苷酸。另一种方法是i l i l 定法，即将预先合成的d n a 基冈探针点样到i 矧体支撑载体上，并与之结合。在理论t - ，核酸分子0 ) i r a ，c d n a 片段、p c r 产物、 以及寡核茁酸等) 的i 捌定主要包括物理吸附和化学偶联r 共价连接) 两人类。此外，紫外辐射交联、生 物秦和亲幂嗦系缆( 间接交联法) 、微粒的共轨连接等均可削于d n a 微阵州中核酸分子的闻定。 ( 1 ) 物理吸附 物理吸附是通过非共价键作h j 。直接将核酸吸附在预处理的载体表面，是一种简单易行的核酸 同定方法。常片j 于长片段的d n a 、p c r 产物和c d n a 片段的同定。目前核酸分子物理吸附在同相 载体上的确切作i j 机制还不明确，推测这种结合涉及核酸与表面的相互作用，如疏水作_ 【 j 、静电吸 引和离子结合。在物理吸附中，结合的表面不同，核酸与表面的作用水平也不同，其主要步骤为：1 1 核酸分子转移至表面；2 ) 吸附在表面上；3 ) 被吸附的分子重排；4 ) 有些被吸附分子发生解吸；5 ) 解吸的分 子从表面移走。研究表明如果被吸附核酸分子的分子量人，载体表面结合竹点多，一股不会发生解 吸。即使最稳定的共价键结合方式中，展开始的分离和吸引步骤也是以物理吸附为基础的。在此过 稃中，使核酸与载体上包被的活性基团靠近。目前改进的物理吸附方法有两种：改变载体表面的电荷 性能和改变所连接核酸探针的疏水性。在第一种方法中通过修饰，在载体表面包被p o l y ，d l y s i n e 或 表面活性剂等止电荷的物质，通过静电引力和离子结合，与核酸骨架中带负电的磷酸基团作川吸附 d n a 。另一种常h j 的改进方法是在核酸探针上加多聚胸腺嘧啶( p o l y d 或多聚腺嘌呤( p o l y - a ) 尾，这 种带疏水性尾的分子更容易直接被吸附在载体上，结合力也更强，在杂交过程中探针也更容易被定 位。加p 0 i y t 尾的数量一般在2 0 - 5 0 个碱基之间，过长时( 超过1 0 0 b p ) 对提高琉水作用无影响。研究 表明p o l y - t 尾不仅能提高核酸与载体表面的结合效率，而且可以作为连接臂引入，以减少探针与载