（发酵工程专业论文）猪源益生乳酸菌的筛选及发酵工艺研究.pdf

华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 摘要 从健康猪粪便筛选分离到有较强抑菌特性的3 株乳酸菌，主要生理生化实验和 1 6 sr d n a 保守序列分析初步鉴定为干酪乳杆菌旺a c t o b a c i l l u sc a s e i ) 、屎肠球菌 ( e n t e r o c o c c u sf a e c i u m ) 和粪肠球菌( e n t e r o c o c c u s f a e c a l i s ) 。体外益生特性研究表明，3 株乳酸菌能耐受胃肠道环境，黏附猪小肠表面粘液，对猪源产肠毒素型大肠杆菌 e s c h e r i c h i ac o l i0 1 3 9 、e c o l ic 8 3 9 0 5 、e c o l i c 8 3 5 2 4 、e c o l ic 8 3 5 2 9 ，伤寒沙门氏菌 s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m0 4 h i 、金黄色葡萄球菌s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 均有较强的抑 制特性。小鼠试验证明3 株乳酸菌安全可靠。对添加乳酸菌后小白鼠大肠杆菌数量 的变化进行了研究，结果表明对照较添加乳酸菌组大肠杆菌数量明显降低( p ( 0 0 5 ) 。 用e c o c 8 3 9 0 5 腹腔攻毒小自鼠，乳酸茵组的死亡率明显低于对照组。 通过单因素试验确定3 株乳酸菌最适合的碳氮源、营养因子、缓冲盐以及最佳 接种量、温度、起始p h 、装液量；应用均匀设计法结合二次多项式回归分析，筛选 了e f a e c a l i s 的增菌培养基组分：蔗糖1 5 ，酵母膏3 0 ，磷酸盐缓冲液5 0 ， m g s 0 4 7 i - 1 2 00 0 0 5 8 ，m n s 0 4 4 h 2 00 0 2 5 ，番茄汁1 5 ，p h 6 8 。该菌株在此增 菌培养基3 7 下培养1 8h ，菌数可达到8 0 x 1 0 9 e f u m 1 , ，增殖效果是经m r s 培养后 的3 倍。进一步流加碱液控制培养基p h ，1 8 h 后e f a e c a l i s 菌数可达到9 0 x 1 0 9 c f i l m l 。 研究了蔗糖、乳糖、l 谷氨酸、半胱氨酸、脱脂奶粉、甘油、维生素c 、壳聚 糖、海藻糖等对e f a e c a 蕊的冷冻干燥保护效果，结果发现：单一保护剂使用时，海 藻糖保护效果最好，菌株冻干存活率为7 4 ；脱脂乳、蔗糖和山梨醇协同作用时， 冻干保护效果略优于海藻糖( p ( 0 0 5 ) ，冻干存活率为7 8 。常温常压状态下五个月， 3 株乳酸菌e f a e c i u m 、e f a e c a l i s 和l c a s e i 的冻干菌粉，活菌数存活率分别为6 8 5 、 7 0 2 和6 5 8 ，表明乳酸菌冻干菌粉的保存性较好。 将这3 株乳酸菌分别发酵，按菌数为1 ：1 ：1 混合，真空冷冻干燥后，用于仔 猪饲养实验。选取6 4 头( 杜长大) 仔猪，分为5 组：基础日粮对照组、抗生素对照 组、乳酸菌高、中、低剂量试验组。通过平均增重、料肉比、发病情况( 仔猪腹泻发 病率及程度、死亡率等) 探讨乳酸菌益生素的作用效果。结果表明，乳酸菌高低剂量 组采食量、平均增重高于无抗组和抗生素组；乳酸菌组料肉比大于抗生素组；乳酸 菌益生素能够预防仔猪腹泻、提高仔猪成活率和改善饲养环境。 关键词：猪源乳酸菌；筛选；鉴定：高密度培养；冷冻干燥保护剂；生产性能 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 a b s t r a ( 了r l a c t i ca c i db a c t e r i a ( l a b ) i nt h i sp a p e rw e r ei s o l a t e df r o mt h ef a e c e so fh e a l t h y l o c a lp i g s t h r e eo ft h e mw e r em o s te f f e c t i v ei nv i t r oa n t a g o n i s mo fe n t e r i cp a t h o g e n i c m i c r o o r g a n i s m s p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lt e s t sb e s i d e st h ea n a l y s i so f1 6 sr d n a r o u g h l yi d e n t i f i e dt h et h r e es t r a i n sa se n t e r o c o c c u s a e c i u m ，e n t e r o c o c c u sf a e c a l 括a n d l a c t o b a c i l l u sc u s e i t h e ya l l 锄s u r v i v a li nt h eg a s t r o i n t e s t i n a lt r a c t a n db i n dt o i m m o b i l i z e dm u c u sm a t e r i a li nv i t r o t h e ya uh a da n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e sa g a i n s te n t e r i c p a t h o g e n i cb a c t e r i as u c ha se s c h e r i c h i ac o h0 1 3 9 ，e c o l ic 8 3 9 0 5 ，e c o l ic 8 3 5 2 4 ，e c o l i c 8 3 5 2 9 ，s a m o n e at y p h i m u r i u m0 4 h ia n ds t a p h y l o c o c c u sa u r e u s t h ei s o l a t e s ss a f e t y t e s t sw e r ep r o f o r m e db ym i c ee x p e r i m e n t t h ef a e c a le c o l ic o u n t so fm i c eo fl a b f e e d i n gg r o u p sw e r es i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p 妒 9 0 为阳性；“一”表示 9 0 为阴性；“n ”表示一未测定 3 3 益生特性分析 3 3 1 耐模拟胃液能力 益生菌口服经过胃肠环境，面临的首要障碍是低p h 冒渡。3 株乳酸菌均能耐受 p h 2 5 模拟胃液达1 8 0m i n 。但在p h1 5 模拟胃液中，l c a s e i 和e f a e c i u m 培养3 0m i l l 后 分别降低2 8 个和5 个数量级，培养1 8 0m i n 后无乎无存活，e f a e c a l i s 培养3 0r a i n 后则 无存活( 见表3 2 ) 。由此可知，乳酸菌在极低p h 胃液中，活菌数迅速下降。 通常胃酸p h 在3 0 左右，流体食物在胃内停留时间为1 2h ，在进食后很短的时 间内，胃内p h 值可以升到6 0 左右( h a nm j ，1 9 9 5 ) 。目前研究( c h a r t e r i sw p e ta 1 ，1 9 9 8 ； 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 g a r d i n e r ge ta 1 ，1 9 9 9 ：k o s be t a l ，2 0 0 0 ) 表明，益生菌通过胃肠的过程，食糜作 为一种保护剂使得益生菌受到伤害程度减小，一旦这些菌在穿越胃和十二指肠的过 程中能存活下来，随同食糜进入回肠和盲肠的细菌会急剧增加。因此，3 株乳酸菌通 过胃存活的可能性较大。 表3 23 株乳酸菌在p h l 5 和p h 2 5 模拟胃液的存活 t a b l e3 2s u r v i v a lo f t h r e ei s o l a t e si ns y n t h e t i cs t o m a c h j u i c ea tp h l 5a n dp h2 5 3 3 2 耐猪胆盐能力 表”3 株乳酸菌在高猪胆盐浓度的存活情况1 1 1 a b l e3 3s u r v i v a lo ft h et h r e ei s o l a t es t r a i n sa th l g hp o r c i n eb i l es a l tc o n c e n t r a t i o n s 1 ) “+ ”生长良好；“( + ) 竹生长较差；“一”不生长 乳酸菌进入肠道后，小肠胆盐的高渗透压环境对其来说是另一考验。仔猪小肠 内胆盐浓度在0 0 3 0 3 范围内波动。由表3 3 可知，l c a s e i 和e f a e c i u m 的最高 耐胆盐浓度为3 0 ，ef a e c a l i s 最高能2 0 浓度胆盐。结果远远超过了0 0 3 0 3 的范围。 3 3 3 黏附小肠表面的能力 乳酸菌顺利通过胃肠不利环境，在肠壁上的粘附是其定植并大量繁殖变成优势 种群的前提，所以乳酸菌与宿主细胞粘附力的强弱是筛选益生菌株的重要标准之一。 由图3 3 知，3 株乳酸菌都能黏附固定于9 6 孔板的猪小肠表面粘液蛋白。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 3 3 4 平板抑菌实验 ：1 7i 3 l s d e 缸h e 缸e l i s 图3 3 黏附试验结果 f i g 3 3a d h e s i o no ft h ei s o l a t e s 表3 43 株巍酸菌的抑菌试验结果 t a b l e3 ar e s u l t so f a n f i m l e r o b i a l a , z e | v i t yo f t h el a b i s o l a t e s 3 株乳酸菌发酵液最终p h 值均在4 0 左右，以等p h 值m r s 液为对照的孔均不 表现抑菌特性。由表3 4 可知，3 株乳酸菌发酵液对不同的指示菌株都有抑制特性， 抑制s a 能力强于e c o l i 和s t0 4 h i ，其中e f a e c i u m 对e c o l i0 1 3 9 、e c o l ic 8 3 5 2 4 、 e c o l ic 8 3 5 2 9 有较强的抑制作用，e f a e c a l i s 对s t0 4 i - i i 有较强的抑制作用，l c a s e i 对e c o l ic 8 3 9 0 5 有较强的抑制作用。 3 3 。5 对抗生素的耐药性分析 由表3 5 可知，le a s e l 对羧苄青霉素、美满霉片、青霉素、先锋必素、四环素、 红霉素、强力霉素、氧哌嗪青霉素等都非常敏感，抑菌圈直径 3 0 衄。e f a e c i u m 和e f a e c a l i s 对抗生素的敏感程度明显低于l c a s e i ，二者对所有抗生素的抑菌圈直径 0 0 5 ) ，乳酸菌组大肠杆菌数量从第6 天到第2 1 天逐渐下降( p o 0 5 ) 。ef a e c i u m 组数量最低值为3 8 9 ，lc a s e i 组数量最低值为4 2 3 ，e f a e c a l i s 组数量最低值为4 2 5 ， 远低于对照组7 0 5 。饲喂乳酸菌后肠道大肠杆菌数量下降的原因可能是乳酸菌在小 白鼠肠道内迅速定植，竞争性排斥大肠杆菌；或者是其分泌的酸性物质或抑菌物质， 不利于大肠杆菌存活。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 d a y so ft r e a t m e n t l d 日6 d口1 l d四1 6 d田2 1 d lc a s e ie ? f a e c i u me t a e c a l i $对照 图3 4 湿粪样大肠杆菌活菌计数 l r 峪3 ay h t b l ec o n n t so f 嚣x o 缸t h ew e t f a e c e so f = n i c e 3 4 2 攻毒试验 表3 6 小鼠的死亡情况 t a m e3 6d 翰馈o f m i c e 乳酸菌组与对照组小鼠饲喂2 1 天，以2 l d 5 0 剂量攻毒e c o l ic 8 3 9 0 5 。通过逐 日观察发现，小鼠的发病症状主要表现在：精神不振，不活跃；呆滞，颤抖；缩在 一堆，背毛凌乱，不光滑；无食欲，背部弓起犹为明显。攻毒后，第1 天对照组开 始有发病症状出现，死亡1 只，并且第2 、3 、4 天各死亡3 、2 、1 只，其它存活的 3 只也不同程度的出现发病症状，精神不佳，四处逃串。l c a s e i 组第2 、3 天各死亡 1 只，e , f a e c i u m 组第2 天死亡1 只，e f a e c a 晒组第2 天死亡2 只，其它小鼠攻毒后 2 4h 精神沉郁，不食，扎堆，之后逐步恢复正常。 攻毒后各组死亡时间，死亡数及保护率见表3 6 。小鼠攻毒前无一只死亡，这不 但说明乳酸菌安全性，而且保证了攻毒实验的一致性和结果的可靠性。表3 6 反映 了3 株乳酸菌对e c o i lc 8 3 9 0 5 感染都有良好的免疫预防效果，乳酸菌能有效降低小 白鼠受大肠杆菌攻毒时的发病率，延缓攻毒后的腹泻发病时间，并有效提高保护率。 其机制可能是小白鼠摄入的乳酸菌成为肠道优势菌，其分泌的抑菌物质和酸性物质 8 7 6 5 4 3 2 1 0 (8苫o)_【 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 使得肠道p h 值偏低，不利于大肠杆菌的存活；其分泌的活性物质提高了小鼠的免 疫机能。 3 5 乳酸菌液体静态培养条件初步研究 3 5 1 生长曲线的测定 m r s 液接种1 的乳酸菌种子液后，每隔2h 取样测定发酵液o d 6 0 0 值。由其 生长曲线图3 5 知：3 株乳酸菌的对数生长期是2 - 1 2h 。 1 4 1 2 l 80 8 善o 6 0 4 o 2 o 024 681 0 1 2 1 41 61 82 02 22 42 6 时间( h ) + 厶c a s e i + ef a e c i u - k - ef a e c a j i s 图3 - 5 生长曲线图 j 5g r o w t hc l l l r v e so fl a b $ t a i l b s 3 5 2 单因素发酵培养基及条件的研究 3 5 2 1 最佳碳源的筛选 0 8 ，口葡萄糖 日乳糖- 麦芽糖因蔗糖 l c a s e ie f a e c j u me 五a e c a l i s 图3 6 不同碳源对乳酸菌生长的影响 f i g 3 6e f f e c to fc a r b o n8 0 n r 髓蚰c u l t u r eo fl a b 由于乳酸菌缺乏分解淀粉等大分子碳水化合物的酶系，试验选用葡萄糖、蔗糖 等小分子糖为碳源。e h m 3 6 知，对于工c a s e i 并g e f a e c a l 括，蔗糖的增殖效果略高于其 它；对于e f a e c i u m ，乳糖的增殖效果略高于其它。而一般菌体更容易吸收和利用的 5 7 5 6 5 5 5 4 5 3n仉仉叭m仉 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 单糖葡萄糖增殖效果却没有超过二糖， 快速碳源，若含量过多易加速乳酸产生， 葡萄糖来促进乳酸菌增殖。 3 5 2 2 最佳氮源的筛选 这可能因为葡萄糖属于乳酸菌优先利用的 最终不利菌体增殖，所以只考虑适量添加 氮源构成微生物细胞和含氮的代谢产物。不同的微生物氮源有不同的要求，由 图3 7 知，3 株乳酸菌最佳利用氮源均为酵母提取物。 1 2 1 。0 8 藿o e 0 4 o 2 0 lc a s e ie z a e c i u m e z a e c a l l s 口a c 国a b 日a 口b 臼c a 蛋白胨b 酵母提取物c # 肉青a & 一蛋白胨+ 酵母提取物a c 蛋白胨+ 牛肉膏 图3 7 不同氮源对乳酸菌生长的影响 _ 毡3 7e f f e c to fn i t r o g e ns o u l t 地o nc u l t u r eo fi a b 3 5 2 3 缓冲盐的选择 由图3 8 知，k h 2 p 0 4 - n a 2 h p 0 4 作缓冲液，乳酸菌的细胞积累量最大。 l c 8 s e ie f a e c i u me e a e c a i s 口a 口b 目c 四d e a 空白；b - l 羽妒0 4 - n a 2 1 - 1 p 0 4 ；g - l 睹酸盐：嘶檬酸盐一磷酸盐；e - - - c a c 0 3 图3 8 不同缓冲盐对细胞积累的影响 f i g 3 gt h e e f f e c to f d i f f e r e n tb u f f e rs a l to nc e l la c c u m u l a t i o n 3 5 2 4 生长因子的选择 大多数乳酸菌是生长因子异养型微生物，它们需要从外界提供维生素等多种生 长因子，它对乳酸菌的正常代谢必不可少，在促进其生长方面起着重要的作用。由 图3 9 知，番茄汁的增殖效果最好。 0 8 6 4 2 9 8 6& ，p暑婿蔓量 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 8 0 莶： 錾2 0 o 眍墨凰凰 l c a s e ie f a e c i u =e f a e c a l i s 口番茄汁 囝吐温8 0 囵v c 图3 9 生长因子对乳酸菌生长的影响 f i g 3 9e f f e c to fv a r i o u sg r o w t hf a c t o r so rl a b g r o w t h 3 5 2 5 温度的选择 微生物的生长与产物的形成都是在各种酶的催化下完成的，温度是保证酶活的 重要条件。因此，温度是影响生物机体代谢活动的重要因素之一。由图3 1 0 知，乳 酸菌的最适培养温度为3 7 ，这样能使发酵液中的活菌数达到最高。 4 0 3 0 是2 0 1 0 o l c a s e ie f a e c i u me f a e c a l i s 图3 1 0 温度对乳酸菌培养的影响 即1 0e f f e c to f i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r eo rg r o w t ho f l a b 3 5 2 6 起始p h 的选择 1 o 8 躲： o 2 of 囱i 阂i 豳i l c a s e ie f a e c i u me f a e c a l i s 囝2 5 囵3 0 口3 5 圈3 7 e a4 0 团6 4 口6 6 团6 8 口7 7 2 图3 n 初始p h 值对乳酸茵生长的影响 3 1 1e f f e c to fi n i t i a lp h v a l u eo hl a b g r o w t h 微生物细胞对p h 值的改变很敏感，环境中的氢离子浓度如果超过了微生物的适 应范围，就会降低或抑制这些微生物的生命活动。在乳酸菌生长的最适p h 值范围内， 细胞生长繁殖快、活力强。由图3 1 1 知，初始p h 值对乳酸菌的增殖影响不大，l c a s e i 羹塑盘匪盟 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 和e 扣缸m 的初始最适p h 值为6 8 ，e 丘伽妊的初始最适p h 值为7 0 。 3 5 2 7 接种量的选择 由图3 1 2 0 - 7 知，接种量对乳酸菌生长影响不大，l c a s e i 和e f a e c a l i s 接种量1 时 菌浓度略高，ef a e c i u m 在接种量2 时菌浓度略高。 o 7 8 。6 。5 0 4 e - f a e c i u m & f a e c a l i s 口1 四2 血3 曰4 5 图3 1 2 不同接种量对乳酸菌生长的影响 f i g 3 1 2i n f l u e n c e so fi n o c u l a t i o nm o u n t o nl a bg r o w t h 3 5 2 8 装液量的选择 。8 4 。8 罾 0 7 6 上c a s e ief a e c i u mez a e c a l i s 四1 0 0 r a l 瞄2 0 0 r a l 口3 0 0 l l 口4 0 0 r a l 日5 0 0 r a l , 图3 1 3 装液量对乳酸菌生长的影响 f i g 3 1 3i n f l u e n c e so ff i l l i n gv o l u m eo nl a bg r o w t h 由图3 1 3 知，厶c a s e i 和ef a e c i u m 的装液量为1 5 时，发酵液菌浓度最高；e f a e c a l i s 的装液量为3 5 时，发酵液菌浓度最高。 3 5 3 缓冲盐法培养乳酸菌的初步研究 表3 7 五水平四因素均匀设计表 t a b l e3 7u n i f o r md e s i g nf o rf i v el e v e l sw i t hf o u rf a c t o r s 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 准备5 0 0m l - - - 角瓶，每瓶装液3 0 0m l ，按表3 7 设计各因素水平，初始p h 6 8 ， 接种量1 ，3 7 c j 鞯e f a e c a l i s ，以发酵2 0 h 后最终菌浓y ( 1 0 8 c f i i m l ) 为考察指 标，优化蔗糖1 ) 、酵母膏2 ) 、磷酸盐缓冲液o 好) 和番茄汁o 科) 的最佳配比。应用 u l o ( 5 4 ) 的均匀设计表( 方开泰，1 9 9 3 ) ，均匀设计试验方案及结果如表3 8 所示。 表3 8 培养基配方及实测菌数 u1 0 ( 5 4 ) t a b l e 3 8m e d i ai n g r e d i e n t sa n do b s e r v e dn u m b e r so fl a bo nt h em e d i a 应用s a s 9 0 软件中的逐步回归和线型回归分析，建立如下回归模型： y = 4 6 7 7 1 1 5 6 2 x 1 + o 1 6 1 x 3 + o 0 2 4 x 2 x 4p x 3 。在所选择的各因素中蔗糖的iti 值最大，但t 值为 负，因此蔗糖对乳酸菌增殖呈最大的负面影响。酵母膏与缓冲盐交互作用的t 值最 大，因此酵母膏与缓冲盐对乳酸菌增殖有较大影响。番茄汁对乳酸茵增殖有正面作 用，其影响仅次于酵母膏与缓冲盐。由此可以推测：乳酸菌发酵代谢糖产生大量乳 酸抑制了乳酸菌的增殖，而缓冲液在一定程度上缓解了乳酸抑制作用。缓冲盐对乳 酸菌增殖的影响最大，因此在发酵中必须严格控制其用量。 3 5 4 流加碱调节p h 值的发酵过程 6 5 6 宅5 5 4 5 4 0481 21 62 02 4 时间h 图3 1 4 3 株乳酸菌发酵p h 变化图( _ 未调p h ；，调p n ；，l c a s e i ； ，e f a e c i u m ；：，e f a e c a l i s ) h g 3 1 4q l a l l g e si np hd u r i n gf e r m e n t a t i o no f t h r e es t r a i n sha d j n s t e d p h ；，u n a d j u s t e dp h ；，l c a s e i ；，e f a e c l u m ；：，e f a e c a l i s ) 乳酸菌的生长与p h 值有密切联系，适宜的口h 值为6 5 7 0 ，当p h 值过高或 过低时则生长缓慢甚至不能生长。因此发酵过程中采用流加碱中和菌体代谢所产生 的酸，调节p h 值在一个适当的范围内，将会有利于菌体增殖，提高产菌量。以下 对比实验，研究了流加碱液调节p h 对发酵过程的影响。发酵培养基的组成为：蔗 糖1 5g ，酵母膏3 0g ，番茄汁1 5 0 m l ，磷酸氢二钠2 9 ，1 0 0 0 m l 蒸馏水。本研究 为了消除低p h 值对乳酸菌生长的抑制作用，在其生长过程中流加n a o h 溶液以中 和产生的酸，每隔6 h 测定1 次发酵液p h 值，并调节p h 值为6 8 左右。 从图3 1 4 可看出，乳酸菌在培养过程中，不调节p h 组培养液酸度在2 1 2h 明 显下降，但培养1 2h 后酸度变化逐渐趋缓和，与乳酸菌生长曲线的变化情况( 见图 3 5 1 正好相反，这可能是乳酸菌在发酵生长过程中不断分泌乳酸，而后过量的乳酸反 过来抑制乳酸茵的生长，致使减少酸性物质的产生；调节p h 组，流加碱液中和了 培养液中的酸根离子h + ，使得培养液趋于中性，诱使乳酸菌在一定时间内增殖，然 而随着乳酸菌发酵过程产生的乙酸盐和抑菌活性物质等的积累，同样抑制了乳酸菌 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 的增殖，因此在1 8 2 0h ，p h 值的变化逐渐趋于平稳，乳酸菌的增殖受到阻遏。 表3 1 0 第1 8h 后活菌数( x 1 0 8c f u m l ) t a b l e3 1 0 a b l ec a ) n n t so f l a ba f t e r1 8hf e m e n t i o n 由表3 1 0 可知，在发酵过程中调节p h 值有利于乳酸菌的生长，可以延长菌体 增殖时间，从而提高生物量。发酵1 8 h 后，2 组调p h 值菌数是1 组不调p h 值菌数 的3 倍以上。不调节p h 值时，发酵终态的p h 值处于蛋白质的等电点附近，蛋白质 大量沉淀下来；而p h 值较高时，发酵液中的菌体等沉淀物很少，发酵液颜色较深。 对于液体乳酸菌制剂的生产来说，适当的调节p h 值对感官也有所改善。 3 6 乳酸菌冻干保护剂的初步研究 3 6 1 冻干保护剂( 单因素多水平) 筛选试验 表3 1 1 冻干保护剂筛选试验结果 t a b l e3 1 1r e s u l t so f s c r e e n i n gt e s to f c r y o p r o t e c t a n t 选取e f a e c a l i s 做真空冷冻干燥试验，由表3 1 1 可知，在加入保护剂之后，菌 株存活率均有不同程度的提高。在众多单一保护剂中，1 0 海藻糖保护作用最好， 活菌存活率7 4 ；1 5 脱脂乳粉和1 5 蔗糖作用效果其次。 醇类保护剂单独使用时保护效果均不理想( 2 3 ) ，但与脱脂乳粉联合使用时具 有明显的增效作用，如：1 0 脱脂奶+ 1 0 甘油冻干保护，活菌存活率为7 3 ；1 0 脱脂奶+ 5 山梨醇+ 1 0 蔗糖冻于保护，活菌存活率为7 8 。谷氨酸、胱胺酸和谷氨 酸钠等氨基酸及其盐类与1 0 脱脂奶联合使用时保护效果普遍较好，冻干存活率均 高于6 6 。1 0 脱脂奶+ 1 0 甘油冻干存活率最高，但实际操作过程中经常发现菌剂 干燥后出现气泡，颜色加深，溶解困难等现象，这样产品感官较差，冻干存活率低。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 3 6 2 保存期试验 3 株乳酸菌贮藏结果见表3 1 2 ，5 个月后ef e c h m 、ey a e c a l i s 、h c a s e i 冻干粉 的存活率分别为6 8 5 ，7 0 2 ，6 5 8 。说明发酵冻干菌粉的保存性较好。 表3 1 2 发酵剂保存过程菌数变化 t a b l e3 1 2c h a n g e so f l a bc o u n td u r i n gc o n s e r v a t i o n 3 7 乳酸菌复合菌剂的应用试验 3 7 1 饲养试验 3 7 1 1 生长速度与饲料转化率 五组仔猪体重变化、全期饲料用量、平均增重及料肉比的差异见表3 1 3 。 表3 1 3 全期增重及饲料转化率 t a b l e3 1 3t o t a lw e i g h tg a i na n df e e dc o n v e r s i o n ( 1 ) 从每头平均增重看： 乳酸菌组平均增重均高于无抗无菌组，反映了乳酸菌能促进仔猪生长；抗生素 组与乳酸菌组平均增重差异不大。 c 2 ) 由表3 1 3 可知，料肉比排列次序：i i ) ) i ) v ) 。 抗生素组表现最好的料肉比，乳酸菌中剂量组次之，其结果均好于无抗组；乳 酸菌高剂量组和低剂量组表观料肉比差于无抗组，然而无抗组仔猪平均体重小于乳 酸菌高低剂量组，平均体重越小的猪其饲料利用率越高，料肉比就越好，因此不能 说乳酸菌高低剂量组料肉比差于无抗组。 仔猪日粮中添加了乳酸菌复合制剂，明显地提高了动物的采食量。采食量的提 高，必然导致动物生长速度的加快。乳酸菌高剂量组饲料用量最大，平均增重也最 大，但料肉比较差，原因可能是益生菌的数量种类多了，在动物肠道内对有限的定 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 植位点和营养物质的竞争会很强烈，必然会引起有益菌之间的争夺，会有一些有益 菌成为牺牲品，因此根本无法在肠道内定植而被排出体外，起不了应有的作用。而 且大量的益生菌在动物肠道内繁殖同样需要消耗大量的营养物质和能量，这样导致 营养浪费，造成料肉比较低。 通过以上分析可以总结：乳酸菌对仔猪有催生长效果，且催生长效果与抗生素 差异不大；乳酸菌中剂量在料肉比方面好于无抗无菌，但不及抗生素，其降低料肉 比方面的应用有待进一步研究。 3 7 1 2 预防疾病及环境改善 全程实验中各组仔猪腹泻率与腹泻程度见表3 1 4 。乳酸菌试验组和抗生素对照 组仔猪在全期饲养中全部成活，成活率1 0 0 ；而无抗对照组则死亡2 头，成活率为 8 9 。据统计，试验中对照组仔猪腹泻率在1 2 2 ，抗生素组仔猪腹泻率在3 6 ， 乳酸菌中剂量组腹泻率在3 5 ，说明乳酸菌有防治仔猪腹泻的作用。 表3 1 4 腹泻率与腹泻程度 t a b l e3 1 4d i s r r h o 戗li n d d e n e ea n d s e v e r i t yo fp i g l e b 注：腹泻率= 试验期内腹泻头数( 试验天数试验头数) 1 0 0 据观察记录，整个试验期间，乳酸菌组仔猪健康活泼好动，食欲旺盛，采食量 明显增加，排便正常，很少拉稀或腹泻。抗生素组仔猪明显表现嗜睡，这可能是抗 生素组料肉比略高于乳酸菌组的原因。无抗对照组仔猪则多有消化不良症状，少数 腹泻较为严重，其中有2 头还因轻度水肿、呼吸困难，经治疗无效分别于试验中期 死亡。 试验全期，乳酸菌组仔猪粪便黑色、油光顺滑，猪粪的臭味明显低于两对照组。 乳酸菌组猪圈内苍蝇量很少，猪皮肤表面光滑，而对照无抗无菌组较多猪皮肤表面 有圆环状或红色小点，估计是蚊虫叮咬或虱子寄生虫感染所致，由此可以推测乳酸 菌在改善环境卫生，消除寄生虫等方面有积极作用。 3 7 1 3 减少抗生素的用量 实验期间正值无名高热爆发期，该猪场非实验猪群爆发了疑似无名高热，病猪 皮肤发紫。为治疗疾病使用了大量抗生素，治疗效果不明显，有一半的猪因病死亡， 给猪场造成大量损失。 据猪场兽医反映：饲喂益生菌的猪出现疾病，一针见效，两针便可治愈。仔猪 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 饲养从开食料到育肥料过多使用抗生素，不利于其正常微生物群系的建立。一旦产 生了抗药性有害菌株，并在肠道中定植下来，导致的结果是要使用更大剂量的抗生 素，而由此又会产生更强抗药性菌株，如此形成恶性循环。因此，在仔猪阶段添加 有益的活菌制剂，有助于尽早建立正常微生物群系，在防止腹泻的同时，帮助消化， 促进营养吸收。当致病菌侵袭时，由于不存在耐药菌株，抗生素治疗用量会大大减 少，同时辅助微生态制剂病猪康复较快。 3 7 2 散养饲喂结果 这些散养户有十五家，他们的养殖规模小，大都是养1 4 头母猪以及存栏猪 5 0 头左右。他们的养殖密度大。条件比较差。3 家养殖户采用该乳酸菌制剂饲喂腹 泻仔猪，3 天后止住了仔猪黄白痢。4 5 家养殖户用益生菌制剂饲喂妊娠母猪，以 及其所产的哺乳仔猪，能保证仔猪从出生到出栏都不腹泻，成活率大大提高。3 4 家养殖户用乳酸菌饲喂生产肥育猪，猪只皮红毛亮，生长迅猛。大部分养殖户均反 映用乳酸菌饲喂猪后，猪粪便形状较好，不干不稀，猪圈内臭气减少。另外，有2 家养殖户将乳酸菌、芽孢杆菌与含抗预混料一同饲喂地方土猪，从平均1 5k g 育肥 到7 5k g ，猪的生长速度达1k 天。速度惊人之快引来许多养殖户的兴趣。如此多 养殖户的良好反映，更加说明乳酸菌制剂在促生长，防止腹泻，改善环境方面有极 好的效果。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 4 讨论 4 1 乳酸菌的筛选分离与鉴定 大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌作为正常菌群存在时，常与动物肠道内 其它菌群保持相互制约和相互协同的关系，但当其栖居部位或数量发生改变时即预 示着疾病发生或导致疾病。断奶后肠道大肠杆菌、沙门氏菌浓度上升被认为是导致 仔猪腹泻的主要原因之一r 王红宁，2 0 0 6 ) 。乳酸菌对多种肠道致病菌有较强的拮抗 作用，当肠道乳酸菌大量增殖成为优势菌群，就会抑制肠道病原菌的增殖，从而达 到整肠的作用。 f u l l e r r 等( 1 9 8 9 ) 认为，寄主和肠道菌之间存在着特异性相互选择关系。母猪体 内的菌株更易在仔猪体内定植，所以理想的益生素菌种最好来自同源动物的肠道， 只有这样才能增强益生菌特异性功效。本研究正是基于这样的理念直接以当前猪场 流行的致病菌株e c o l ik 8 8 、k 9 9 、0 1 3 9 ，s t0 4 h i ，s a 为指示菌，从猪肠道筛选 分离出能抑制这些有害菌的乳酸菌株。 通常筛选益生菌步骤是分离一鉴定一筛选，c a s e yp g 等( 2 0 0 4 ) 分离了6 0 0 0 株乳酸 菌，这种筛选方法工作量大。本试验采用筛选一分离一鉴定的方法，将采集的粪样 置于c m r s 液，3 7 培养选择性地增殖了乳酸菌，并且消除了酵母菌等真菌的干扰； 乳酸茵在体内需耐受胃液低p h 和高胆盐浓度生存障碍，我们将增殖的乳酸菌发酵液 经p h 3 的m r s 液，0 3 胆盐m r s 液培养，初步淘汰了那些抗性弱的菌种，最后稀释 涂c a c 0 3m r s 琼脂平板，分离3 8 株产酸能力强的乳酸菌。将分离菌株发酵液做抑制 致病菌实验，获得3 株抑菌特性强( 抑菌圈较大) 的乳酸菌株，主要生理生化与1 6 s r d n a 保守序列分析，初步鉴定为e f a e c i u m ，e f a e c a l i s 和l c a s e i 。这比传统方法大大 减少了筛菌工作量。 4 2 体外益生特性分析 为了更加深入分析这3 株乳酸菌的益生作用，我们进一步模拟猪体内环境，探 讨3 株乳酸菌在猪体内的存活、定植与抑菌特性。本试验根据动物生理学及文献 ( p e d e r s e nc e ta 1 ，2 0 0 4 ；w a g n e rr d ，2 0 0 3 ) ，得到模拟胃液成分，并将其作为乳酸 菌耐胃液能力分析材料。c o n w a yp l 等( 1 9 8 7 ) 报道，嗜酸乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u s ) 在p h l 的p b s 缓冲液中培养6 0m i n 后活菌数量下降到1 0 1 ( d 训乩) 以下， p i - l 3 活茵数量下降速度明显减缓，由此可知，乳酸菌在极低p n 胃液中，活菌数迅 速下降。本研究3 株乳酸菌均能耐受p h 2 5 合成胃液达3h ，但对于p r n 5 合成胃液 3 0m i n 内存活率即大幅度下降，得到了类似的结论。 哺乳仔猪胆囊内胆汁量是很少的。胆汁量在出生后3 周内缓慢增加，小肠内胆 盐浓度在0 0 3 0 3 范围内波动( e w i n g w n e ta 1 ，1 9 9 4 ) 。3 株乳酸菌耐胆盐浓度( 见 表3 3 、远远超过0 0 3 0 3 ，因此，3 株乳酸菌能耐受肠道胆盐环境。比较发现， 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 l c a a e i 和e f a e c i u m 耐模拟胃液的能力和耐胆盐能力都强于e f a e c a l i s ，即猪源乳酸 菌耐胃液能力强的菌株对高胆盐浓度也能有较好的抗性，这与c h a n gy i - i 等( 2 0 0 1 ) ， h a i l e rd 等( 2 0 0 1 ) ，s m e ti 等( 1 9 9 5 ) 的研究吻合。 肠道有害细菌粘附是动物感染致病的前提。c a s e yp g 等( 2 0 0 4 ) 报道了乳酸菌能 抑制沙门氏菌黏附小肠上皮细胞。w a l k e rm 等( 1 9 9 0 ) 贝1 认为动物肠道内表面粘液封 闭了上皮细胞表面的受体，肠道内的大多数微生物直接与此物质发生联系，而不是 上皮细胞。病原菌通过其粘附素与肠粘液糖蛋白受体结合，然后在局部产生毒素或 侵入深部组织致病。有黏附能力的乳酸菌如果能抢先占据小肠粘膜位点且成为优势 菌群，才能阻断病原菌粘附从而有效防治肠道细菌感染。 由于进行细菌在动物体内的附着试验在技术上非常困难，许多体外模型被用来 进行细菌附着或附着抑制试验，如红细胞凝集和凝集抑制试验( r h o m eg me ta i ， 1 9 7 9 ；m e n gq e ta 1 ，1 9 9 8 ) 、肠细胞( c h a r v i e r ege ta i ，1 9 9 2 ) 、上皮细胞体外培养的细 胞系( b e r n e tm f e ta i 。1 9 9 3 ) 等。l a u xd c 等( 1 9 8 4 ) 建立的固定化肠粘液模型具有灵敏 度高、重现性好、操作技术简单等特点，j o n s s o nh 等( 2 0 0 1 ) 应用该模型研究l r e u t e r i 的黏附能力与粘液蛋白量的关系。后来此方法经b l o m b e r g1 ( 1 9 9 3 ) 等加以改进。j j n l z 等( 2 0 0 0 ) 采用此方法进行了屎肠球菌( e n t e r o e o c c u s f a e c i u m ) 对e c o l ik 8 8 的附着抑 制试验。马玉龙等( 2 0 0 4 ) 进行了乳酸杆菌抑制病原菌粘附肉鸡肠粘液黏附试验。高 巍等( 2 0 0 4 ) 利用同位素标记方法，大肠杆菌、乳杆菌和双歧杆菌用3 5 s 蛋氨酸标记 后，分别附着固定在2 4 孔细胞培养板上的猪小肠上皮细胞粘液蛋白、牛血清白蛋 白( b s a ) 和培养板( 聚苯乙烯) 。大肠杆菌、乳杆菌和双歧杆菌附着小肠粘液蛋白的数 量与b s a 和培养板上附着数量的比率分别为1 2 6v s1 3 1 ( p 0 0 5 ) ，1 2v so 9 4 ( p = 0 0 5 ) ，1 1 9 v s 0 8 7 ( p 0 0 1 ) ，表明双歧杆菌和乳杆菌附着小肠粘液蛋白的能力相对 较强。 本研究采用j o n s s o n h 等( 2 0 0 1 ) 的方法固定黏蛋白的量和菌体的量，用酶标仪测 定了被黏附菌体的吸光值，以此反映菌株的黏附性，这种方法在国内还未曾见过。 试验结果表明乳酸菌都具有黏附性，但是o d 值不能反映不同菌株对黏蛋白黏附的 数量和比例。为了比较不同株乳酸菌与粘蛋白的黏附力大小，笔者设想在9 6 孔板上 包被固定量的粘蛋白后，加入相同量各株菌，将其中一个9 6 孔板真空抽干后用酶标 仪测定o d 值( a ) ，另外的9 6 孔板用洗脱液洗脱干燥后用酶标仪测定o d 值( b ) ，最 后求得各株菌的黏附率c = b a * 1 0 0 ，即细菌的粘附率= 用洗涤液洗后的o d 4 0 5 值 加入细菌冻干后的o d 4 0 5 值x 1 0 0 。鉴于国内外在研究细菌黏附方面还没有统一 标准，笔者大胆设想：在用黏蛋白包被9 6 孔板时可以做一蛋白梯度，摸索蛋白量与 菌株黏附率的关系，从而得到黏蛋白与黏附量的关系值，这样就解决了黏附研究中 因黏蛋白的量不统一，菌株不统一，菌含量不统一造成的无法横向比较。由于笔者 时间限制，有关益生菌粘附能力评估的模型和标准的设想有待课题组继续研究。 各种益生菌都具有其特定的生理功能，如噬酸乳杆菌对寄主的免疫系统有较强 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 的调节作用，而鼠乳杆菌对大肠杆菌有较强的抑制作用等。只有对各菌株的生物特 性有深入研究，才能根据不同情况有针对性的设计微生态制剂。e f a e c i u m 对e c o l i 0 1 3 9 、k 9 9 有较强的抑制作用，e f a e c a l i s 对s t0 4 h i 有较强的抑制