（环境工程专业论文）对二氯苯对盐城湿地土壤酶活性和微生物群落结构的影响.pdf

江苏大学硕士学位论文 摘要 氯苯类化合物( c b s ) 性质稳定、用途广泛，其相关的环境生态风险已引起了人们 的日益关注。以对二氯苯( 1 ，4 d i c h i o r o b e n z e n e ) 为研究对象，运用平板菌落计数法、酶 活性测定和p c r d g g e 等技术考察了对二氯苯胁迫下盐城湿地土壤微生物数量、群落 结构及典型酶活性的变化规律，探讨了不同浓度对二氯苯对盐城湿地土壤微生物群落结 构和功能的影响。 平板菌落计数法研究表明：不同浓度对二氯苯胁迫下，试验初期( 4d ) 细菌生长得 到促进，6 0 0m g & g 试验组细菌数量可达到对照组数量的2 1 0 ：随着处理时间的延长， 细菌数量逐渐降低，4 5d 后细菌数量与对照组之间并无显著性差异。但是，放线菌数量 变异规律与细菌明显不同，试验初期与对照组相比差异不显著，而后放线菌的生长受到 抑制，4 5d 后与对照组相比其抑制率达到4 2 。真菌数量则呈现先增加后抑制的趋势， 在第1 1d 时，各个处理组的真菌数量达到最大值，且高浓度( 6 0 0m g 厥g ) 对二氯苯胁迫 下的真菌数量是低浓度组( 1 2 0m g k g ) 数量的1 6 6 ；处理中后期真菌数量明显抑制， 4 5d 时各处理组的真菌数量均少于对照组。 对二氯苯胁迫土壤中脲酶活性研究发现：对二氯苯对湿地土壤脲酶活性有不同程度 的抑制作用，并且随着浓度的增大而增加；其中，6 0 0m g k g 试验组脲酶的活性降低了 4 0 以上。对于过氧化氢酶，1 1d 时显示出显著的抑制作用，抑制率达到2 0 ，但随 着处理时间的延长，过氧化氢酶活性逐渐恢复至对照水平。对二氯苯对湿地土壤磷酸酶 活性具有一定的激活效应，虽然低浓度( 1 2 0m g 厥g 和2 4 0m g k g ) 组下的激活作用尚不 显著，但3 6 0m g k g 和6 0 0m g l 【g 试验组磷酸酶活性分别提高了4 2 3 和6 3 7 。 p c r _ d g g e 图谱揭示对二氯苯胁迫对土壤细菌群落结构多样性具有一定影响。相同 对二氯苯浓度下，群落结构多样性随着时间变化先下降后上升：同一时问内，群落结构 多样性则随着对二氯苯浓度的增加而降低，表明不同浓度下都产生了适应该浓度的细菌 群落。 研究结果能够为湿地土壤对二氯苯的环境生态风险评价提供基础数据和科学依据， 对盐城湿地土壤氯苯类有机污染物的防治具有重要的科学意义和应用价值。 关键词：对二氯苯；微生物群落；土壤酶；聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t e c o l o g i c a lr i s k so fc h l o r o b e n z e n ec o m p o u n d s ( c b s ) i ne n v i r o n m e n th a v eb e c o m eo n e o ft h ek e yt o p i c si ns c e i e n t i f i cr e s e a r c hb e c a m eo ft h e e rw i l d l yu s e a g ea n ds t a b l e p h y s i c o - c h e m i c a lp r o p e r t i e s m i c r o o r g a n i s i ma m o u n t ，c o m m u n i t ys t r u c t m ea n dt y p i c a l e n z y m e sa c t i v i t i e si n1 , 4 d i c h l o r o b e n z e n es t r e s s e ds o i lf r o my a n c h e n gw e t l a n dw e r ew e l l s t u d i e du s i n gp l a t ec o l o n y c o u n t i n gm e t h o d ，p c r - d g g et e c h n o l o g ya n dc h e m i c a lt i t r a t e m e t h o d ，a n dt h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f1 ，4 - d i c h l o r o b e n z e n eo nt h em i c r o b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r ea n df u n c t i o nw e r ea l s ot h r o u g h l yd i s s c u s s e d r e u l t si nt h ep l a t ec o l o n y - c o u n t i n gs t u d ys h o wt h a t ，b a c t e r i ag r o w t hi nt h es t r e s so f t d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f1 , 4 一d i c h i o r o b e n z e n ew e r ep r o m o t e d ，a n dt h en u m b e ro fb a c t e r i ai n s o i lp o l l u t e db y6 0 0m g k go f1 , 4 - d i c h i o r o b e n z e n ew a s210 o ft h en u m b e ro fc o n t r o l g r o u pi nt h eb e g i n n i n gp e r o i d s ( 4 md ) o fe x p e r i m e n t s ；b u tw i t ht h ee x t e n do f i n c u b a t i o nt i m e ， t h en u m b e ro fb a c t e r i ar e d u c e dg r a d u a l l y , a n dt h e r ei sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sb e t w e e nt e s t g r o u p sa n dc o n t r o lg r o u p t h ev a r i a t i o np a t t e r n so fa c t i n o m y c e sn u m b e rw e r e d i f f e r e n tw i t h t h eb a c t e r i a a n dt h e r ei sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sb e t w e e nt e s tg r o u pa n dc o n t r o lg r o u pi n t h eb e g i n n i n go fe x p e r i m e n t s ，t h e nt h eg r o w t ho fa c t i n o m y c e t e si sr e s t r a i n e d ，a f t e r4 5dt h e i n h i b i t i o nr a t er e a c h e d4 2 c o m p e r e dt oc o n t r o lg r o u p t h en u m b e ro ff u n g ir e v e a l e dat r a d e o ff i r s ti n c r e a s ea n dt h e ns u p p r e s s i o n ，e a c hg r o u pr e a c h e dam a x i m u mn u m b e ri nt h ed a yo f e l e v e n ，a n dt h en u m b e ro ff u n g ii nh i g h1 , 4 一d i c h i o r o b e n z e n ec o n c e n t r a t i o n ( 6 0 0m g k g ) s t r e s s e di s16 6 o ft h en u m b e ro ff u n g ii nl o w1 , 4 - d i c h i o r o b e n z e n ec o n c e n t r a t i o n ( 12 0 m g k g ) t e s t i n gg r o u p ；t h en u m b e ro ff u n g is i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e di n t h el a t e rp e r i o d ，a n dt h e n u m b e ro ff u n g ii nt e s tg r o u p sa r el e s st h a nt h en u m b e ri nt h ec o n t r o lg r o u pa f t e r4 5d a y so f i n c u b a t i o n s o i li l l e a s ea c t i v i t i e sw e r ei n h i b i t e di nav a r y i n gd e g r e e sb y1 , 4 d i c h l o r o b e n z e n e ，a n d t h ei n h i b i t i o ni n c r e a s ew i t ht h ec o n c e n t r a t i o no f1 , 4 d i c h l o r o b e n z e n ea d d e d a n d6 0 0m g k g u r e a s ea c t i v i t yr e d u c e dm o r et h a n4 0 s i g n i f i c a n te f f e c to fi n h i b i t i o nw a sm a n i f e s t e di nt h e e l e v e nd a y so fi n c u b a t i o na tt h em a x i m u mr a t i oo f2 0 ，a n dr e c o v e r e dt ot h ec o n t r o lg r o u p w i mt h et i m ep r o l o n g i n g h o w e v e r , ac e r t a i nd e g r e e so fa c t i v a t i o ne f f e c to ns o i lp h o s p h a t a s e i i 江苏大学硕士学位论文 w e r ea l s of o u n d ，a l t h o u g hn os i g n i f i c a n te f f e c t i o nw a sf o u n di ns t r e s s i n go fl o wc o n c e n t r a t i o n ( 12 0a n d2 4 0m g k g ) o f1 , 4 一d i c h l o r o b e n z e n e p h o s p h a t a s ea c t i v i t i e si nt h et e s t i n gg r o u po f 3 6 0a n d 6 0 0m g k gi m p r o v e d4 2 3a n d6 3 7 c o m p a r e dt oc o n t r 0 1 r e s p e c t i v e l y t h ee f f e c t so f1 , 4 一d i c h l o r o b e n z e n ea td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no nt h e d i v e r s i t ya n d s i m i l a r i t yo fb a c t e r i ac o m m u n i t yw a ss i g n i f i c a n ti nt h ep c r d g g es t u d i e s t h ed i v e r s i t yo f b a c t e r i ac o m m u n i t yd e c r e a s e df i r s ta n dt h e ni n c r e a s e dw i t ht h ec h a n g i n gt i m ea tt h es a m e c o n c e n t r a t i o no f1 , 4 一d i c h i o r o b e n z e n e w h i l et h ed i v e r s i t yo fb a c t e r i ac o m m u n i t yd e c l i n e d w i t ht h ei n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o no f1 4 - d i c h l o r o b e n z e n ea tt h es a n l et i m e t h es i m i l a r i t yo f b a c t e r i a c o m m u n i t yi n t h ew e t l a n dd e c l i n e d w i t ht h e i n c r e a s i n g t i m ea td i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so f1 , 4 一d i c h l o r o b e n z e n es u g g e s t e dt h a tt h eb a c t e r i ac o m m u n i t i e sa p p e a r e da n d a d a p t e dt h e m s e l v e st ot h ec i r c u m s t a n c e sa td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so f1 , 4 d i c h l o r o b e n z e n e t h ei n f l u e n c e so f1 , 4 一d i c h l o r o b e n z e n eo nt h es t r u c t u r eo fm i c r o b i a lc o m m u n i t yi nt h e w e t l a n dw e r ew e l ls t u d i e d ，w h i c hp r o v i d e dv a l u a b l e n s c i e n t i f i cd a t af o rt h ef u r t h e rr e s e a r c ho n e c o l o g i c a lr i s ka s s e s s m e n to f1 , 4 一d i c h l o m b e n z e n ea n dp o l l u t i o np r e v e n t i o ni ny a n c h e n g c o a s t a lw e t l a n d k e y w o r d s ：1 , 4 一d i c h l o r o b e n z e n e ，m i c r o b i a lc o m m u n i t y , s o i le n z y m ea c t i v i t y , p c r d g g e 篡 i i i 江苏大学硕士学位论文 1 1 课题背景 第一章绪论 江苏盐城作为中国湿地之都，具有中国暖温带地区中最完整和最广阔的湿地生态系 统，也是国际上重要的湿地和世界迁徙水禽停歇和越冬地。盐城湿地受到海陆作用， 生态系统复杂而脆弱，并且由于海滨地区众多的化工企业所产生的污染物质很容易进入 盐城湿地，湿地环境遭受前所未有的威胁。湿地本身可以通过动植物的吸收【2 1 、微生物 的降解【3 j 和土壤基质的吸附等途径来吸附和降解有害物质，具有一定的自净能力。在上 述自净过程中，湿地土壤中各种微生物的活动起着关键的作用，在一定程度上降解污染 物质，减轻了污染物质对湿地环境生态系统的破坏程度。了解盐城湿地土壤在氯苯类有 机污染物胁迫下的微生物群落结构变化过程，对保护湿地环境和进行污染湿地修复具有 重要意义。 1 1 1 对二氯苯的结构和性质 苯环上只有氢原子和氯原子两种原子的单环芳香族化合物称为氯苯类化合物 ( c h l o r o b e n z e n e s ，简称c b s ) 。它们具有较强气味，理化性质稳定，水中溶解度小，溶于 醇、醚、苯和酮类多种有机溶剂等特点，属于中度挥发的有机污染物，根据氯原子在苯 环上的位置，可以将氯苯类化合物分为1 2 种同系物。由于氯苯类化合物具有广泛性、 高毒性、生物蓄积性、半挥发性和持久性。容易沿着食物链富集和放大，英国的w o l s k 曾在他的有关论述中声称：在水，沉积物，和水生生物体内均有氯苯类有机物检出【4 ，5 】， 甚至在人类的脂肪组织和人乳中也有存在【6 l ，造成世界范围内的环境污染，影响动植物 的正常生长【7 1 。所以在持久性有机污染物( p e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t s ，简称p o p s ) 1 8 j 的名单上榜上有名。其中一氯苯( m o n o c h l o r o b e n z e n e ) 、邻二氯苯( 1 ，2 d i c h l o r o b e n z e n e ) 、 对二氯苯( 1 ，4 d i c h l o r o b e n z e n e ) 和及六氯苯( h e x a c h l o r o b e n z e n e ) 也被我国环保部门列入 水中优先监测污染物的黑名单 9 1 中。作为c b s 系列产品，我们主要集中在二氯苯的研究。 其中以对二氯苯和邻二氯苯尤为重要。 对二氯苯又称1 ，4 - 二氯苯，英文名l ，4 d i c h i o r o b e n z e n e ，分子式为c 6 i - h c l 2 ，结构如 图1 1 所示，分子量为1 4 7 0 0 ，相对密度1 4 6 ( h 2 0 - - 1 ) ，蒸汽相对密度5 0 8 ，熔点5 3 1 ， 江苏大学硕士学位论文 沸点1 8 0 4 ，蒸汽压1 3 3k p a 5 4 8 ，闪点6 5 ，不溶于水，溶于乙醇、乙醚、苯 等有机溶剂，常态下是白色结晶，有樟脑气味。 c ic l 图1 1 对二氯苯结构图 f i g i is t r u c t u r ec h a r to fl ，4 一d i c h l o r o b e n z e n e 对二氯苯在工业生产中是一种用途广泛的精细化工产品【1 0 】，它不仅参与农药、医 药、香料以及工程塑料的制作过程，同时也具有优良的杀菌、消毒和除臭效果。其主要 用途概述如下： 制造防蛀防霉剂是对二氯苯最主要的用途【l i 】。传统工艺是使用萘作为制造卫生球 的原材料，但是由于萘在体内代谢产物的萘酚和萘醌会引起血管内溶血及内脏出血。并 且萘可以储存在人体脂肪内，而脂肪转化成热量的同时即会释放出其中的萘，从而引起 中毒，是潜在的致癌物质。所以对二氯苯便取代萘成为了主要的防蛀防霉用品【1 2 】。 在工程塑料方面，对二氯苯是聚苯硫醚的原料，公式见图1 2 。生产1 吨的聚苯硫 醚需对二氯苯1 3 6 吨1 3 】。由于聚苯硫醚优良的耐热、耐燃、耐腐蚀、耐辐射、无毒和 高稳定等性能，被当做玻璃、钢材、陶瓷、铝、银、镀铬以及镀镍制品的粘合剂。广泛 用于制造电器零件、汽车零件、精密零件、模型制品和层压材料等。目前为止，聚苯硫 醚已成为了世界第六大通用工程塑料，同时也是八大宇航材料之一【1 4 】。 弋 - i - 2 n n a c i 图1 2 聚苯硫醚合成反应式 f i g 1 2p o l y p h e n y l e n es u l f i d e ( p p s ) s y n t h e s i sr e a c t i o n 1 1 2 典型土壤酶的生态学意义 土壤酶作为土壤中最活跃的有机成分之一，广泛的存在于土壤。是土壤进行新陈代 2 江苏大学硕士学位论文 谢的催化剂。土壤酶活性的大小能够直接反映土壤微生物对有机污染物降解强度和方向 n s , t 6 l 。土壤酶和土壤微生物一起作用，共同推进了土壤新陈代谢过程【1 7 1 。由于土壤酶是 一种活性蛋白质，理化活性易受土壤环境中物理、化学以及生物等因素影响，使得土壤 酶对自然和人为因素所引起的变化非常敏感【l 引，从而可以表征出土壤中微生物总体活 性。土壤酶活性的变化将会影响土壤中养分的释放，因此，测定土壤酶活性将有助于判 明土壤的理化性质。 ( 1 ) 土壤脲酶 脲酶是一种酞胺酶，能降解有机物质分子中的肽键，是土壤氮循环中重要的组成成 分。它能促进尿素水解形成n h 4 + ，有利于氮元素被植物吸收。脲酶是由活细胞释放出 来的胞外酶以及裂解细胞所释放的胞内酶组成，其中一部分脲酶以游离状态存在于土壤 溶液中，另一部分脲酶以吸附状态结合在细胞组分上，也有吸附在土壤颗粒上，并与土 壤颗粒成分结合在一起而形成吸附态脲酶。脲酶的活性与土壤中有机物质含量、氮的供 给与利用情况、土壤微生物量和其它养分含量相关【1 9 1 。 ( 2 ) 土壤过氧化氢酶 、r 过氧化氢酶最早是在1 8 11 年被发现者泰纳尔( l o m sj a c q u e s t h 6 n a r d ) 首次发现的。 1 9 0 0 年，o s c a rl o e w 将这种能够降解过氧化氢的酶命名为“c a t a l a s e ”，即过氧化氢酶， 并发现这种酶存在于许多植物和动物中。随后学者们对过氧化氢酶进行了大量的研究。 过氧化氢酶广泛存在于土壤以及微生物体内，能促进过氧化氢的分解，有效防止了土壤 及生物体在新陈代谢过程中产生的过氧化氢对生物体产生毒害，保护细胞免受各种自由 基的毒害，起到保护细胞的作用，是生物细胞保护酶，对动植物的生长发育及代谢活动 都具有重要意义【2 0 1 。过氧化氢酶也被看作是好氧微生物的指示物，并且过氧化氢酶活性 与好氧微生物的数量、土壤肥力均有密切的联系，其活性可以用来表示土壤生化活性。 此外其活性还与土壤呼吸作用和土壤微生物活动息息相关。 ( 3 ) 土壤磷酸酶 土壤磷酸酶也是一种广泛存在于自然界胞内酶。是一类催化土壤有机磷化合物矿化 的酶，土壤磷酸酶活性的高低会直接影响到土壤中有机磷的分解转化及生物有效性的利 江苏大学硕士学位论文 用。它能促进有机磷向无机磷转化，从而利于植物吸收无机磷量的增多。与此同时， 磷酸酶在营养物质转化和环境污染修复等方面发挥着重要作用，研究土壤磷酸酶活性， 对于弄清土壤中磷的转化过程、方向及强度具有重要意义。 1 1 3 土壤微生物群落结构特征 ( 1 ) 土壤微生物数量 由于土壤微生物在形成土壤过程中扮演了重要角色，并且参与地球生物生态系统的 化学循环，以及污染物质降解【2 2 , 2 3 】。所以土壤微生物作为一个重要因素，能够影响土壤 生态过程【2 4 1 。但是土壤微生物个体微小，数量众多，以及土壤中微生物分离和鉴定困难， 土壤环境条件复杂等原因。到目前为止，大约仅有1 1 0 的土壤微生物被分离和鉴定， 这极大的限制了我们对土壤微生物的认识。虽然，我们对土壤微生物的认识有限，但这 并没有影响它们在维护整个陆地生态系统稳定中的重要作用。 自上世纪七十年代起，就有研究表明有机污染物对微生物毒性的效应与污染浓度有 很大的关系，浓度的大小与微生物数量一般呈现负相关性，其中相关的显著性与其污染 物的类型。土壤类型和微生物类群相关。但是由于在确定土壤中有机污染物的生物有效 性上有一定难度，并且土壤微生物的复杂性及研究方法不同，导致结论与结论之问的可 比性较差【2 5 1 。 ( 2 ) 土壤微生物群落 土壤微生物群落是指土壤中不同微生物群落的种类和种间的差异，主要是指微生物 群落的生理功能多样性、细胞组成多样性以及遗传物质多样性。土壤微生物群落结构用 来表征土壤生态系统群落结构和稳定性，通过了解土壤微生物群落发生的变化，我们便 可以较早地预测到土壤中养分及土壤环境质量的变化，所以现在微生物群落结构被认为 是表征土壤受胁迫时一个潜力的敏感性生物学指标。土壤微生物多样性研究更是土壤生 态系统功能分析的基础。长期以来，土壤生态系统复杂性、土壤生物多样性和技术手段 的不足等是研究土壤微生物群落结构产生困难的主要原因。土壤复杂的物理、化学结构 和组成特点为栖居多样的微生物奠定了基础，但是土壤理化结构和组成的时空异质性使 土壤微生物多性和群落结构研究比地上动物和植物多样性研究更为困难口6 。 4 江苏大学硕士学位论文 1 2 微生物群落结构研究方法 1 2 1 传统培养的技术 建立在微生物纯种分离培养基础上的传统群落分析方法是通过对分离出来的纯菌 种进行显微观察和生理生化特性研究来认识群落结构。到现在为止仍旧是一种不可替代 的经典方法。高军2 7 1 等人的实验结果还表明，多氯联苯( p c b s ) 长期污染土壤中细菌数 量受污染程度的影响较小，则真菌数量降低较为明显。滕应等人2 8 1 证实在重金属污染土 壤中的耐性细菌群落的数量比自然土壤中的多1 5 倍。y a m a m o t o 等人【2 9 】发现在对照土壤 ( c u 1 0 0 0m g l ( g ) 中有2 5 种真菌， 同时在高度污染土壤( c u 1 0 0 0 0m g k g ) 只有1 3 种真菌。 但是由于环境中能被可培养的微生物数量只占微生物总数量很小的一部分，这种结 果直接导致了培养得到的微生物数量只占原有微生物群落总数微乎其微的一部分。再者 j 由于传统的分离富集培养微生物的方法是带有选择性的，培养后检测得到的微生物在种 类、数量和功能上都已经无法准确地反映最初自然条件下土壤微生物群落结构，以及微 生物群落的生态功能以及相对应的关系等。 赢? 1 2 2 荧光技术 现在以荧光为基础的技术在微生物学研究中应用很广泛，其中主要包括荧光标记蛋 白、测定总菌数、活菌数测定以及荧光定位杂交。 ( 1 ) 荧光标记蛋白 由于许多微生物在环境中表现出一种“存活但不能被培养”状态。在这种状态下，细 胞不能在传统的培养基上生长，但事实上仍然处于存活状态，并能在适当条件下重新恢 复代谢活性并转入可培养的状裂3 0 j 。m l o w d e r 等人用绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n t p r o t e i n ，g f p ) 一种短半衰期突变株作为新陈代谢的指示，对这种状态的微生物进行了研 究。这种不稳定的蛋白不同于一般的g f p ，在“饥饿”或者v b n c 状态下很快失去荧光。 这样，我们就可以用g f p 作为指示剂监测由于环境变化而引起微生物新陈代谢的变化 3 1 , 3 2 。 5 江苏大学硕士学位论文 ( 2 ) 荧光染色计算菌数 b o u l o sl 提出了一种简便、快速计量活菌死菌的方法【3 3 1 。他用两种染料对样品染 色。一种是s y t 0 9 ，分子量约为l o d a 的绿色染料，它可以进入活的或死的细胞中：另 一种是p r o p i d i u mi o d i d e ，分子量约为6 6 8 d a 的红色染料，它只进入死的细胞。活菌率 即为： 活菌= 蕊需鬻襞丽圳。活菌5 两酥蠢蒙若螽面丽蚶0 0 ( 3 ) 荧光定位杂交 荧光定位杂交主要是用于研究原核生物，它可以直接鉴定以及定量分析样品中特定 微生物或者是分类群。该方法中，整个细胞是被固定的。它的1 6 s 或者2 3 sr r n a 与 荧光标记的特异性寡核苷酸探针杂交。再由共聚焦激光扫描显微镜( s c a n n i n gc o n f o c a l l a s e r m i c r o s c o p y ，s c l m ) 观察固定的细胞。由于杂交的是整个细胞，省去了提取d n a ， p c r 扩增以及克隆等步骤。g a l l 和p a r d u e 最早介绍了荧光定位杂交技术畔】。这项技术 最早应用于放射性的互补序列作探针对d n a 靶序列进行研究。后来m a n n i n g 等人首次 将非放射性的定位杂交技术应用于细胞遗传学的研刭3 5 j 。而荧光定位杂交( f l u o r e s c e n c e i n s i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) ，就像n o r t h e r n 、s o u t l l e m 印记一样，是基于两个寡核苷酸 通过互补序列配对。但是对f i s h 来说，靶序列是留在组织中而没有必要像n o r t h e m 、 s o u n l e m 技术一样在杂交之前首先要分离核酸p 6 1 。h u u p h o f f 等人在研究海洋微小浮 游生物的时候应用f i s h 技术来确定群落的丰度【3 刀。r u s s e l lc o n n a l l y 等人应用时段荧光 显微技术( t i m e r e s o l v e df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y , t r f m ) 检测环境微生物样品，解决了 藻类以及矿物颗粒的自荧光对免疫荧光以及f i s h 的干扰【3 引。 f i s h 技术的应用受到环境样品微生物的生理状态的影响，芽孢、放线菌及休眠时 期的细胞的细胞膜的通透性低，影响群落中部分种属丰度的错误估计。而且，由于f i s h 技术先要根据已知种属设计探针，不能检测出环境样品中的未知种属1 3 9 。 1 2 3 基于p c r 的研究方法 基于p c r 的方法有很多，以下例举的几种是现代微生物生态学常用的方法。他们 的共同点是首先提取环境样品的核酸，然后用合适的引物扩增。 6 江苏大学硕士学位论文 ( 1 ) p c r - r f l p ( p c r 一限制性片段长度多态性) 分析方法 限制性内切核酸酶，又称限制酶( r e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e ) ，特异的结合于一段d n a 的识别序列或其附近的特异位点上，并在此切割双链d n a t 4 0 1 。因此，特定的限制性酶 谱图可以对群落中的微生物加以区分。p c r 1 玎l p ( p c r - r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m s ) 法是将p c r 引物中的一条加以荧光标记，反应后用限制酶切、电泳分 析，再根据片断的大小不同以及标记片断种类和数量的不同分析群落的结构及组成多样 性【4 1 1 。现在很多研究人员利用1 6 sr r n a 来研究土壤微生物的多样性4 2 4 5 1 。d h b u c k l e y l 4 6 等人提取土壤中微生物的r n a ，通过标记过的不同引物扩增，确定1 6 sr r n a 的丰度。了解了耕作过的土壤中微生物群落结构的变化，同时可以根据p c r 扩增的1 6 s r d n a 的荧光标记末端限制性片段长度多态性( f l u o r e s c e n t l yt a g g e dt e r m i n a lr e s t ri c t i o n f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ，t - r f l p ) 来判断微生物群落的生态状况。 ( 2 ) p c r s s c p 方法 p c r - 单链构象多态性研究( s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o n a lp o l y m o r p h i s m ，p c r - s s c p ) 方法近年来被应用到微生物生态学的研究4 7 a 8 1 。由于单链d n a 片段呈复杂的空问折叠 构象，这种立体结构主要是由内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的。当有一个碱 基发生改变时，会或多或少地影响其空问构象，使构象发生改变。空问构象有差异的单 链d n a 分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳( p a g e ) ，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开，这是此方法用来分离不 同d n a 片段的理论基础所在。 f r a n ks c h w i e g e r 等人通过对根系微生物的分析表明p c r - s s c p 可以很好地分析微 生物群落的动态变化，并应用此方法研究了种植对土壤微生物群落的影响【4 9 】。s a b i n e p e t e r s 等用该法研究群落的演替和菌种的多样性，并同传统的培养方法比较指出 p c r - s s c p 方法避免了传统培养的费时费力以及误差大的干扰，适合对微生物群落结构 和演替的分析【5 0 】。 ( 3 ) 定量p c r 技术 对定量p c r ( q u a n t i t a t i v ep c r ) 技术最早描述的是h o l l a n d 等【5 i 】。后来，g i b s o n 等 7 江苏大学硕士学位论文 人对实时p c r ( r e a lt i m ep c r ，r t - - p c r ) 技术进行了描述。这种技术保留了p c r 技术 的敏感性和特异性，而且由于应用了荧光探针，可以通过光电传导系统直接探测p c r 扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有d n a 杂交的高特异性和光谱 技术的高精确性，克服了常规p c r 的许多缺剧5 2 ，5 3 。 定量p c r 技术有广义概念和狭义概念。广义概念的定量p c r 技术是指以外参或内 参为标准，通过对p c r 终产物的分析或p c r 过程的监测，进行p c r 起始模板量的定量。 狭义概念的定量p c r 技术( 严格意义的定量p c r 技术) 是指用外标法( 荧光杂交探针 保证特异性) 通过监测p c r 过程( 监测扩增效率) 达到精确定量起始模板数的目的， 同时以内对照有效排除假阴性结果( 扩增效率为零) 。目前最为常用的技术是实时荧光定 量p c r 技术( r e a lt i m ef l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep c r ) 。 实时荧光p c r 技术基于荧光共振能量转移( f r e t ，f l u o r e s c e n tr e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e r ) 原理：当两个荧光基团靠近时，高能量荧光基团会将受激发产生的能量转移 到相邻的低能量荧光基团上。由于标记在探针上的两种荧光基团所发出荧光信号的变化 可以反映p c r 扩增产物的数量变化，从而使得荧光p c r 技术可以起到实时检测的目的。 日前，根据荧光基团在寡核苷酸探针上的不同标记形式，各种荧光p c r 检测试剂盒所 采用的荧光探针基本可以分为三种类型：t a q m a n 探针、分子信标和荧光杂交探针。 ( 4 ) 其他分析方法 g a r l a n d 和m i l l s 提出了一种研究异养微生物群落代谢多样性的方法一b i o l o g m i c r o p l a t e s 5 4 】。这种方法是基于微生物群落对9 5 种不同碳源的利用度来描述群落中微生 物动态变化。微平板中有氧化还原指示剂和9 5 种不同的碳源，加入样品后，由于样品 对每种碳源的呼吸能力不同，导致氧化剂颜色变化不同，用分析系统分析变化结果，就 可以得出群落代谢的变化情况。这样，这种碳源利用度的信息就可以用来研究不同环境 条件引起的微生物群落变化。 ( 5 ) 组合应用 以上几种方法是近几年来常用的微生物生态学研究方法。在解决实际问题的过程 中，往往不拘泥于一种方法。n r o s s 等人收集了地下水中的微生物，让它们在陶瓷表 面形成生物膜，并分别分析地下水中的微生物群落以及生物膜的微生物群落。他们采用 8 江苏大学硕士学位论文 s s c p 方法和b i o l o gm i c r o p l a t e s 法研究它们的遗传多样性和代谢多样性5 5 1 。a m a r k i b e k w e 等人研究薰剂对土壤微生物的影响时同时采用了p c r - d g g e 法和p l f a 谱图法 5 6 1 。各种方法组合应用，避免了由于每种方法原理本身所带来的不可避免的偏差，向我 们提供了更加全面的群落组成和变化方面的信息。 l - 3 研究中相关的分子生物学技术 1 3 1 湿地土样中基因组d n a 的提取和纯化 作为一个关键的技术问题，从环境中提取和纯化d n a 将直接影响后续的实验进展。 尤其是抽提阶段中土壤中的腐殖质类物质的排除，否则将直接影响后续的p c r 扩增及 检测等。一般从土壤或沉淀物中提取d n a 的方法可以分成两类。一类是在土壤中直接 裂解微生物体，再提取d n a 。还有一类是先将微生物与土壤颗粒分离开来在提取d n a 。 一般来说，第一类方法的提取率比较高。通常采用高速离心和玻璃珠击打最后进行的有 机物预处理步骤 5 7 , 5 8 】，将土壤颗粒与微生物剥离开来。 ( 1 ) d n a 的提取 由于d n a 都是作为与蛋白质及部分r n a 结合成染色体而存在的，因此分离核酸 首先要破碎细胞，然后采用各种方法将d n a 中的蛋白质、糖类和脂类物质等去除以纯 化d n a 。在提取过程中，即要保证d n a 不被内源或外界污染以保持d n a 的完整性， 又要排除其它分子的污染。常用的细胞破碎有机械法、物理法、化学及生化法【5 9 , 6 0 1 等几 种方法。因此，根据所分析土样的特点，反复对提取方法进行检验和修正是极为必要的。 ( 2 ) d n a 的纯化 无论采取哪种方法提取d n a ，都有不同程度的蛋白质、多糖以及一些盐类污染， 将会影响后续实验，因此进一步纯化d n a 是必要的，常用的方法有有机溶剂抽提、沉 淀、梯度离心法、酶温和消化杂质等。目前，d n a 纯化已经可以使用试剂公司提供的 商业化核酸纯化试剂盒，也可以使用传统的方法进行纯化。高平平等【6 l j 对用于微生物群 落分子生态学研究的活性污泥总d n a 提取方法进行了探索研究。他们将活性污泥样品 经液氮速冻、沸水浴融化、溶菌酶处理和s d s 裂解后，结果表明d n a 片断长度在2 0 k b 9 江苏大学硕士学位论文 左右，产量达至t j t ( 1 7 5 6 - a ：0 1 ) m g g m l s s ，样品的a 2 6 0 a 2 8 0 的值蔓- j ( 1 9 6 - a ：0 2 ) 。使用提 取的总d n a 为模板进行p c r 扩增获得了成功。因此，这一实验研究为活性污泥中的微 生物群落分子生态学研究提供了一种简便、可靠的d n a 提取方法。 1 3 2p c r ( 聚合酶链式) 反应 ( 1 ) p c r ( 聚合酶链式) 反应原理 聚合酶链式反应于1 9 8 3 年由美国c e t u s 公司的k m u l l i s 建立，并和定点突变的发 明者m s m i t h 一起荣获1 9 9 3 年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时 代。成为近年来分子生物学领域中迅速发展和广泛应用的一种技术，能迅速和特异地在 体外扩增所希望的目的基因或d n a 片段。在某种意义上来说，p c r 扩增技术可以看成 是酶促合成d n a 的技术，类似于d n a 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两 端互补的寡核苷酸引物。在t a q d n a 聚合酶的作用下，于7 2 。c 左右，以d n t p 为反应原 料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板d n a 链互补 的半保留复制链重复循环变性退火延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而 且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2 4 m i n ，2 3 h 就能将目的 基因扩增几百万倍。 p c r 实验包括以下几个步骤： 变i 生( d e n a t u r a t i o n ) ：将反应体系混合物加热到9 4 * c ，维持较短的时间，使目标d n a 双螺旋的氢键断裂，形成单链d n a 。变性温度过高或变性时间过长都会导致d n a 聚合 酶活性的下降，从而影响p c r 的产量。而变性温度过低则导致d n a 模板变性不完全使 引物无法与模板结合，导致p c r 反应的失败。对于富含g 、c 的模板应适当提高变性温 度。 退火( a n n e a l i n g ) ：将反应体系冷却至特定的温度( 引物的t m 值左右) ，引物与d n a 模板的互补区域结合，形成模板引物复合物。这时必须精确地计算退火温度以保证引 物只与模板相对应的序列结合。 延 * ( e l o n g a t i o n ) ：d n a 模板- 引物结合物在t a q d n a 聚合酶的作用下，以d n t p 为 反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板