（水生生物学专业论文）草鱼干扰素及其调节因子1和7.pdf

摘要 4 i l lll ll l1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1l q l l l l y 17 4 6 9 0 8 捅要 干扰素系统在所有脊椎动物非特异性免疫系统中都扮演着举足轻重的作 用。虽然研究表明鱼类具有与哺乳类相似的 干扰素系统，但对其具体信号转导路径和分子机理的研究还远不如哺乳类 深入。为进一步了解鱼类干扰素系统的分子机制，本文克隆了草鱼干扰素( c i 肋 和干扰素调节因子1 、7 ( “砸，仍的基因组序列，进行序列比对和进化树分 析，搜索启动子数据库对启动子序列进行潜在转录因子结合位点预测。组织表达 分析表明c i i f n 和c i i r f 7 均受p o y ( i ：c ) 诱导。分别原核表达并纯化了c i i r f i 的d n a 结合结构域( d b d ) 、非d n a 结合结构域( n d b d ) 和完整的开放阅读框( o r f ) ， 并克隆了c i i f n 启动子序列的8 个不同片段，通过凝胶阻滞分析( e m s a ) 表明 c i i r f 7 的d b d 结构域能够与c i i f n 启动子序列结合，揭示了其可能为调控甜删 转录的转录因子。同时，本文还鉴定了受干扰素诱导水平较高的两个i s g 基因： c i i f l 5 8 和c i g i g l 。组织表达分析表明两者在多个组织都有本底表达，且受 p o l y ( i ：c ) 上调。此外，还构建了真核表达载体p c d n a 3 卜c i i r f l 3 7 和荧光素 酶报告基因重组载体p g l 3 - b a s i c c i i f n p l - 8 ，为下一步研究体内c i i r f l 3 7 对 c i i f n 的诱导效应做好准备。 关键词：i f n ：i r f ；克隆；表达；e m s a ；草鱼 i i a b s t r a c t a b s t r a c t i f np l a y sac m c i a nr o l ei ni n n a t ei m m u n es y s t e mi na l lt h ev e r t e b r a t e s a l t h o u g h s e v e r a le v i d e n c es h o wt h a tt h e r ea r es i m i l a ri f ns y s t e mb e t w e e nf i s ha n dm a m m a l i - f i l l ，t h ed e t a i l e dp a t h w a yo fs i g n a l l i n gt r a n s d u c t i o na n dm o l e c u l a rm e c h a ni s mi ss t i l l n o te l u c i d a t e dc l e a r l y t of u t h e ru n d e r s t a n dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fi f ns y s t e m i nf i s h ，w ec l o n e dt h eg e n o m eo fc i l f na n dc i l r f l 7 ( i n t e r f e r o nr e g u l a t o r yf a c t o r 1 7 ) ，a n dc a r r yo u tt h em u l t i p l es e q u e n c ea l i g n m e n ta n dp h y l o g e n et i ca n a l y s i s t h e a n a l y s i so ft i s s u ee x p r e s s i o ns u g g e s tt h a tb o t l lc i l f n a n dc i l r f 7c a nb ei n d u c e db y p o l y ( i ：c ) w ee x p r e s sa n dp 丽f 3 ，t h ed b dd o m a i n s ，n d b dd o m a i n sa n dt h ef u l l o r f so fc i l r f 7i np r o k a r y o t i cc e l l ，r e s p e c t i v e l y , a n da l s oc l o n e8d i f f e r e n ts e g m e n t so fc i l f n p r o m o t e rr e g i o n t h ee m s a ( e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y ) s h o w t h a tt h ed b dd o m a i no fc i l r f 7c a ns p e c i a l l yb i n dt ot h ec i l f np r o m o t e r , i n d i c a t e - t h a ti tm a yb et h ep o t e n tr e g u l a t o ro fc i l f nt r a n s c r i p t i o n t h e nw ei d e n t i f i e dt w o i f n - i n d u c i b eg e n ei nf i s h ：c i l f l 5 8a n do g i g j w h i c hc a l lb es t r o n g l yi n d u c e db yi - f n t h ea n a l y s i so ft i s s u ee x p r e s s i o ns h o w e dt h a tb o t l lg e n e sh a dc o n s t i t u t i v e e x p r e s s i o ni nm o s to ft h et i s s u ee x a m i n - e d ，a n du p r e g u l a t e db yp o l y ( i ：c ) t of u r t h e r s t u d yt h ei nv i v oi n d u c t o na c t i v i t yo fc i l r f 1 3 7t oc i l f n ，w ec o n s t r u c t e dt h e r e c o m b i n a n tv e c t o r ( p c d n a 3 1 一c i l r f1 3 7 ) f o re u k a r y o t i ce x p r e s s i o n ，a n dt h e r e c o m b i n a n tl u c i f er a s er e p o r ts y s t e m ( p g l 一3 - b a s i c c i l f n p1 - 8 ) k e yw o r d s ：i f n ；i r f ；c l o n e ；e x p r e s s i o n ；e m s a ；g r a s sc a r p i i i 目录 目录 第一章文献综述1 1 1 干扰素及其转录诱导l 1 2i 型i f n 的转录调控1 1 3i 型i f n 的诱导路径2 1 3 1t l r s 信号通路2 1 3 2c p r r s 信号通路3 1 3 3 其它信号通路4 1 2 干扰素调节因子家族5 1 2 1i r f l 一6 1 2 2i r f 2 7 1 2 3i r f 3 8 1 2 4i l 心4 0 0 00 0 9 1 2 5i r f 5 1o 1 2 6i r f 6 ? ：”11 1 2 7i i 心7 l l 1 2 8i i 江8 13 1 2 9i r f 9 1 4 1 2 1 0 病毒i r f 1 4 1 3 本研究目的和意义1 4 第二章材料和方法1 6 2 1 仪器与试剂。1 6 2 1 1 主要仪器设备16 2 1 2 主要试剂、试剂盒”1 6 2 1 3 载体和菌株1 7 2 1 4 引物17 2 2 实验材料1 9 2 3 实验方法1 9 2 3 1d n a 提取19 2 3 2r n a 提取2 0 2 3 3 反转录合成c d n a 第一链2 0 目录 2 3 4 草鱼i r f l 、7 的克隆2 1 2 3 4 1 草鱼i r f l 的克隆2 1 2 3 4 2 草鱼i r f 7 全长e d n a 的克隆2 2 2 3 5 草鱼i r f l 、7 基因组的克隆”2 2 2 3 5 1 草鱼i r f l 基因组的克隆“2 2 2 3 5 2 草鱼i r f 7 基因组的克隆”2 2 2 3 6 草鱼i r f l 、7 启动子序列的克隆”2 2 2 3 6 1 草鱼i r f l 启动子序列的克隆2 2 2 3 6 2 草鱼i r f 7 启动子序列的克隆2 3 2 3 7 草鱼i f n 完整基因组的克隆”2 3 2 3 8 草鱼g i g l 和i f l 5 8c d n a 全长的克隆”2 3 2 3 9 分子鉴定、序列比对及其进化树分析一2 3 2 3 1 0r t - p c r 分析2 3 2 3 1 1 原核表达及纯化2 3 2 3 11 1 原核表达2 3 2 3 1 1 2 表达产物的纯化2 4 2 3 1 2 草鱼i r f l 、7 真核表达载体的构建2 5 2 3 1 3 草鱼i f n 启动子一报告基因重组载体的构建”2 5 2 3 1 4 草鱼i r f 7 与i f n 启动子序列的亲和性分析”2 5 第三章结果与分析“2 6 3 1c i i r f l ，7 基因组的克隆及其分析2 6 3 1 1c i i r f l 的克隆及其分析2 6 3 1 2c i i r f l 完整基因组的拼接2 6 3 1 3 同源序列比对2 3 1 4c i l r f 7 的克隆及其分析3 0 3 2 系统进化树分析3 4 3 3a 崩彤组织表达3 4 3 4 原核表达“3 6 3 5c i i f n 完整基因组的克隆及分析3 6 3 5 1c i i f n 基因组的克隆3 6 3 5 2c i i f n 启动子的克隆3 6 3 5 3c ii f n 完整基因组的拼接3 7 v 目录 3 5 4 鱼类i 型干扰素基因结构比较分析4 0 3 5 5 鱼类i 型干扰素同源性分析3 9 3 5 6i 型干扰素启动子结构比较分析4 2 3 5 7i 型干扰素系统进化分析4 3 3 5 8r t p c r 分析4 4 3 6c i 6 i g l 和c i i f l 5 8 的基因克隆和表达分析4 5 3 6 1c i g i g l 全长c d n a 的克隆4 4 3 6 2c i g i g l 的表达一4 6 3 6 3c i i f l 5 8e d n a 的克隆4 7 3 6 4 序列同源分析4 8 3 6 5i f i t 基因家族系统进化”4 9 3 6 6 草鱼i f l 5 8 基因组织特异性表达51 3 7c i i r f 7 与i f n 启动子序列的亲和性分析( e m s a ) 5 2 第四章讨论5 4 4 1 鱼类i 型干扰素5 4 4 1 1 鱼类i f n 的分类和进化5 4 4 1 2 鱼类i f n 的转录调控5 5 4 2 鱼类i r f s 一5 6 致谢5 7 参考文献5 8 附录1 ：缩略语6 8 附录2 ：论文列表6 9 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 干扰素及其转录诱导 干扰素( i n t e r f e r o n ，i f n ) 的发现是人类免疫学研究中的一大历史性突破。虽 然被发现至今已经跨越了半个多世纪，但因其在免疫系统中的重要地位使得干 扰素系统仍是目前免疫学研究的热点之一。它是一个大的基因家族，包括i 型 和i i 型，i 型主要包括i f n a 和p 以及目前研究不多的1 c 、6 、t 和九等， 型i f n 只有一个成员，即i f n 7 。i f n a 主要来自白细胞，i f n b 主要来源于成 纤维细胞，而i f n y 则主要由t 淋巴细胞和n k 细胞产生。i f n 基因通常状态下 并不表达，只有当受到病毒、d s r n a 、l p s 等( i 型) 或促细胞分裂素、t 细胞特 异性抗原等( i i 型) 诱生剂刺激后，通过一系列信号级联反应最终激活i f n 基因 的转录。 干扰素生物学功能的发挥主要通过与未感染病毒的细胞受体结合，诱导细 胞产生大量的i s g ( i n t e r f e r o ns t i m u l a t e dg e n e s ) 蛋白来实现。i 型i f n 主要诱导 p k r 、2 5 寡聚核苷酸合成酶r n a s e l 以及m x 蛋白等而使细胞进入一种抗病 毒状态。i f n 丫通过增强n k 细胞和巨噬细胞的杀伤活性以及调节b 细胞和t 细 胞的功能而发挥多种免疫调节作用。另外，i f n 还具有抗肿瘤和控制细胞凋亡 等功能。现在普遍认为，机体在被感染时分泌的干扰素是一种联系先天免疫和 获得性免疫关键的细胞因子【l 引，也是目前所知的机体防御反应中出现最早的细 胞功能调节组分，构成机体抗病毒反应的第一道防线。 1 2i 型i f n 的转录调控 i f n b 基因的主要转录调控序列位于其转录起始位点上游1 0 0b p 的启动子区 域，至少包含有4 个正调控元件( p o s i t i v er e g u l a t o r yd o m a i n sp r d s ) ，即p 助i ，i i ， i i i 和【4 1 。其中p r di 和p r d i i i 元件包含多个g a a a n n 重复序列，被干扰素调节 因子( i f nr e g u l a t o r yf a c t o r s ，i r f s ) 家族成员所激活【5 】，p r di i 和p r d i v 元件分别 是n f r d 3 结合序列和a t f 2 c j u n 结合位点，是参与病毒诱导其早期表达所必需 的。 i f n a 家族基因的5 侧翼序列具有7 5 的同源性，通过对1 1 个人i f n a 基因启 动子序列的比对，发现具有6 个潜在的转录调节元件。t a t a 盒、g t a t g t 基序、 病毒应答元件、近端干扰素调节因子结合位点、远端干扰素调节因子结合位点和 t g 序列。干扰素0 【的启动子区域不含有n f r b 结合位点，主要由p r di 和i i i 类似 元件( p r d l e s ) 所调控，其特征为具有多个a a n n g a a a 重复序列【6 刁l ，它们被干 扰素调节因子( 主要为i r f l ，3 和7 ) 所激活，但是否有其它转录因子参与其转录调 控还有待研究哺j 。 第一章文献综述 1 3i 型i f n 的诱导路径 干扰素在正常状况下并不表达或只有少量表达，但能被病毒、细菌等病原体 迅速并强烈诱导。这种现象很早就被大量证实，但病原微生物通过何种机制引起 细胞的免疫应答以至于激活干扰素的表达却直到2 0 世纪初才被逐渐阐明。现有的 研究表明，i 型干扰素的激活主要通过2 个受体家族来实现，即细胞膜样式识别 受体( t r a n s m e m b r a n ep a t t e m - r e c go n i t o nr e c e p t o r s t p r r s ) ，也p q t o l l 样受体( t o l l - l i k er e c e p t o r s ，t l 风) 以及细胞内样式识别受体( c y t o s o l i cp a r e m r e c g o n i t o n r e c e p t o r sc p r r s ) 8 。1 0 。两类受体位于细胞的不同位置，但主要都是通过识别病原 微生物的核酸来激活机体的免疫应答。且t l r s 介导的i 型干扰素的转录激活具 有细胞种类特异性。 1 3 1t l r s 信号通路 1 9 9 6 年，l e m a i t r e 等在研究果蝇抗真菌感染过程中发现了t o l l 受体。次年， 在哺乳类发现了t o l l 受体同源物( 虽0 t l r 4 ) ，它能诱导炎症应答相关基因的表达 【i 引，且t l r 4 点突变的小鼠不能对脂多糖( l p s ) 的刺激产生应答。接着，结构上与 t l r 4 相似的一组基因被鉴定出来，并命名为t o l l 样受体。哺乳类t o l l 样受体家族 共有1 3 个不同成员( 人1 0 个，鼠1 3 个) 【1 1 以2 1 。所有成员均为跨膜蛋白，根据细胞内 的定位可以分为两类。一类位于细胞膜表面，主要有t l r l 、2 、4 、5 、6 ；另一 类位于内涵体表面，包括t l r 3 、7 、8 、9 【4 】。所有成员的细胞质内部分与白介素 i ( i l 1 ) 受体家族相似，命名为t o l l i l i ( t i r ) 结构域，胞外域富含亮氨酸重复序列 【b l 。它们各自识别不同的病原微生物包括病毒、细菌、真菌和原生动物的组分， 诱导细胞产生免疫应答，从而使机体抵抗几乎所有病原体的入侵。 t l r 2 能够识别各种病原体的脂蛋白或脂多肽、革兰氏阳性菌的脂磷壁酸和 肽聚糖、来自分枝杆菌的阿拉伯糖甘露糖脂、枯氏锥虫的甘油磷酸肌醇、葡萄球 菌的一类酚溶调控蛋白、真菌的受精卵、嗜麦芽密螺旋菌的糖脂以及非肠道菌如 钩端螺旋体、卟啉单胞菌和幽门螺旋杆菌的脂多糖。t l r l 和t l r 2 形成异源二聚 体，能够识别二酰脂多肽和伯氏疏螺旋体外表面的脂蛋白【1 3 】。t l r 6 和t l r 2 形成 异源二聚体，能够识别三酰脂多肽【l 引。t l r 3 主要识别病毒的复制产物双链 r n a ( d s r n a ) 。t l r 4 主要识别脂多糖，此外还能识别紫杉醇、热休克蛋白以及呼 吸道合胞病毒的融合蛋白、小鼠乳瘤病毒的包膜蛋白和莫洛尼鼠类白血病病毒。 t l r 5 主要识别细菌鞭毛。t l r 7 和8 主要识别源于病毒如人免疫缺陷病毒、水疱 性口炎病毒及流感病毒等的富含鸟苷或尿嘧啶的单链r n a ( s s r n a ) 。t l r 9 能够识 别细菌和病毒的d 型和b k 型c p gd n a ，还能识别自身染色质引起自免疫疾病 如风湿和全身性红斑性狼疮。 t l r s 在先天和后天免疫中都发挥重要作用【1 3 以4 1 ，其中一个重要的路径就是 2 第一章文献综述 诱导i 型干扰素的表达。介导i 型干扰素转录激活的t l r s 主要包括t l r 3 、4 、7 、 8 和9 。它们的表达具有细胞特异性，所介导的信号通路也有细胞特异性。 在髓样树突状细胞( m dc ) 、巨噬细胞以及其它细胞中，t l r 3 和t l r 4 通过受 体t r i f ( t o l l i l 1 rd o m a i nc o n t a i n i n ga d a p t o r - i n d u c i n gi f n - b e t a ) 介导i 型干扰素 的表达【1 5 j6 1 ，但t l r 4 只能诱导干扰素q 的表达，而t l r 3 则能诱导干扰素a 和p 的 表达。t l r 4 识别病原体的脂多糖，激活胞质内部分使其结合并激活受体 t r a m ( t r i f - r e l a t e da d a p t o rm o l e c u l e ) ，t r a m 通过t i r 与t 砌f 结合使其激活。而 t l r 3 则通过识别病毒的d s r n a 使其结合并激活t r i f 。t r i f 通过n 端部分与信号 分子n a p l 结合，n a p l 活化后与激酶t b k i ( t r a ff a m i l ym e m b e r - a ss o c i a t e d n f r ba c t i v a t o rb i n d i n gk i n a s e1 ) 结合使其活化，接着t b k l 激活激酶i k k e ( i r b k i n a s ee p s i l o n ) ，然后i k k e 磷酸化i r f 3 使其激活，活化的i r f 3 转移至核内结合干 扰素d 的i r e 元件起始其转录【8 1 7 之1 1 。此外，有研究表明t l r 4 和t l r 3 也能激活i r f 7 并最终诱导i 型干扰素的表达，但具体的信号通路还未知1 8 2 2 。 在类浆胞样树突状细胞内，t l r 9 亚家族t l r 7 和9 介导i 型干扰素的表达依 赖于受体m y d s s ( m y e l o i dd i f f e r e n t i a t i o np r i m a r yr e s p o n s eg e n e8 8 ) p 圳，t l r 9 识别 细菌或病毒的a 型c p g 岛基序而被激活。t l r 7 通过识别病毒如流感病毒和v s v 病毒基因组中的s s r n a 使其激活。活化的t l r 7 9 通过其胞t i r 与受体m y d 8 8 结 合，m y d 8 8 被激活后招募信号分子i r a k i ( i l 1 r a s s o c i a t e dk i n a s e ) 、i r a k 4 、 t r a f 6 ( t u m o rn e c r o s i sf a c t o rr e c e p t o r - a s s o c i a t e df a c t o r3 ) 和转录因子干扰素调节因 子7 ，通过i 删i r a k l t r a f 6 i r f 7 的信号放大使i r f 7 激活并二聚化后进入细 胞核起始干扰素0 【和p 的转录【8 , 2 3 也5 1 。 二 在髓样树突状细胞和巨噬细胞，t l r 9 识别细菌或病毒基因组的b 型c p g 寡聚 核苷酸，使其结合并激活受体m y d 8 8 ，接着m y d s 8 招募i r f l 使其磷酸化而激活， 最终起始干扰素b 的转录【2 6 j 。 t l r 8 也能通过识别病毒的s s r n a 诱导干扰素的表达从而抵抗病毒的感染， 但其具体信号通路还不清楚。 1 3 2c p r r s 信号通路 虽然t l 黜能够在某些特定细胞诱导i 型干扰素的表达，但是几乎所有的细 胞在遭受病毒感染后都能表达干扰素，这就说明还有其它信号路径参与了i 型干 扰素的转录激活，这类通路即是由c p r r s 介导的。 c p r r s 主要包括r i g i ( r n ah e l i c a s e sr e t i n o i c a c i di n d u c i b l e g e n e i ) 、 m d a 5 ( m e l a n o m ad i f f e r e n t i a t i o na n t i g e n5 ) 、p k r ( d s r n a - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e ) 、 n o d ( n u c l e o t i d e b i n d i n go l i g o m e r i z a t i o nd o m a i n ) 蛋白等【l 训。结构上，r i g i 和 m d a 5 在c 端有个d e x d c ( d e a d d e a hb o xh e l i c a s ed o m a i n ) 结构域，此区域能够 第一章文献综述 利用a t p 水解产生的能量解开d s r n a 双链。n 端具有c 6 岷d ( c 嬲p a s er e c r u i t m e n t d o m a i n ) 结构域，它主要介导蛋白之间的相互作用【1 0 2 7 1 。两者都在各种细胞中普 遍表达，对细胞的免疫应答发挥重要作用。r i g i 主要对v s v 病毒、n d v 病毒、 仙台病毒、流感病毒、副粘病毒和日本脑炎病毒等r n a 病毒产生免疫应答【2 7 。2 8 1 ， 而m d a 5 主要识另i j r n a 聚合体p o l yi ：c 和细小核酸病毒e m c v 2 8 - 2 9 1 ，所以g i 和m d a 5 识别不同结构的r n a ，其具体生化机制上的差异还不清楚。 p k r 有许多资料，这里不做阐述。 n o d 蛋白家族主要包括n o d i 和n o d 2 。n o d l 包含有一个c a r d 结构域，一 个n o d 结构域以及c 端的l r r 区域。它在2 9 3 细胞系中的过量表达能够引起对肽 聚糖的免疫应答【3 0 3 1 】，进一步分析表n i e d a p ( 丫一d g l u t a m y l m e s od i a m i n o p i m e l i c a c i d ) 是n o d l 识别所必需的。n o d 2 结构与n o d l 相似，但在n 端有两个c a r d 结 构域。同样它也能使2 9 3 细胞对肽聚糖产生应答，但其识别的基本结构为衍生自 肽聚糖的m d p ( m u r a m y ld i p e p t i d em u r n a c l a l a d i s o g l n ) t 3 2 - 3 3 。所以n o d1 和 n o d 2 识别肽聚糖的不同结构。由于m d p 结构存在于几乎所有的细菌，而i e d a p 只局限于革兰氏阴性菌，所以n o d l 很可能主要探测革兰氏阴性菌在细胞内的感 染【1 3 1 。 当遭受某些病毒感染后，r i g i 缺陷的细胞不产生干扰素【2 7 之8 】，表明对g i 介导了特定病毒诱导的i 型干扰素的表达。同样，m d a 5 是细胞应答某些r n a 病 毒诱导i 型干扰素表达所必需的【2 抛9 1 。虽然n o d l 和n o d 2 能够识别病原微生物 的脂多糖，并引起相应的信号转导通路，但它们并不能诱导干扰素的表达1 3 4 。 r i g i 和m d a 5 信号路径依赖于细胞内受体m a v s ( l p s 1 v i s a c a r d i f ) 3 5 。3 引，m a v s 缺陷的大鼠受被r i g i 和m d a 5 识别的r n a 病毒 感染后表现出与r i g i 和m d a 5 缺陷体相同的表型【3 9 4 0 1 。病毒的复制产物d s r n a 在细胞质内被r i g i 和m d a 5 的r n a 螺旋酶结构域所结合，诱导后两者通过 c a r d 结构域与位于线粒体膜上的l p s 1 结合，供受体间的相互作用激活激酶 t b k l 。活化t b k l 使i r f 3 和7 磷酸化并同源或异源二聚化后进入细胞核最终起始 i 型干扰素的转录【l o 】。最新的研究表明另一个包含d e x d c 结构域的r n a 螺旋酶 l g p 2 对r i g il m d a 5 信号通路具有正调节作用【4 h 2 1 。 1 3 3 其它信号通路 除了t l r s 和r i g i m d a 5 路径外，一些d n a 也能被细胞内的某种或几种受 体识别从而诱导细胞产生干扰素，表明还存在着其它信号通路 4 3 郴j 。这种d n a 识别系统可能主要检测d n a 病毒基因组或者其复制产物，但其是否与r i g i 和 m d a 5 相似存在于所有细胞中，还有待进一步研究。其中的两种d n a 受体已被鉴 定，命名为d a i ( d n a d e p e n d e n ta c t i v a t o ro fi r f s ) ，也叫d l m 1 或z b p i ( z d n a 4 第一章文献综述 b i n d i n gp r o t e i n1 ) 【4 嗣和s t i n g ( s t i m u l a t o ro fi n t e r f e r o ng e n e s ) ，也q m i t a ( m e d i a t o r o f i r f 3a c t i v a t i o n ) 1 4 7 4 引。越来越多的证据表明还有其它d n a 受体的存在【4 9 - 5 0 1 。 1 2 干扰素调节因子家族( i r f s ) 干扰素调节因子是病毒、细菌、真菌、原生动物等病原微生物以及干扰素 诱导的信号通路的转录调控因子，在抵御病毒入侵、细胞生长发育、细胞分化， 肿瘤抑制和细胞凋亡等过程中扮演着重要的角色 1 3 , 5 1 - 5 2 】，此外，最近有报道表 明i r f s 还参与了脂肪形成1 5 3 。 至今，已在哺乳类鉴定了9 个成员( i r f 1 ，i r f 2 ，i r f 3 ，i r f 4 p i p i c s a t ， i r f 5 ，i r f 6 ，i r f 7 ，i c s b p i r f 8 ，i s g f 3 9 p 4 8 i rf 一9 ) ，在病毒也发现了类似i r f 基因，命名为v r f l ，v l r f 2 和v l r f 3 l a n a 2 1 5 1 , 5 4 - 5 5 】，在鸡中鉴定了第1 0 个成员 i r f l 0 5 6 】。所有成员在n 末端都具有l h 5 个酪氨酸重复序列组成的高度保守区域， 形成螺旋转角螺旋的二级结构，能够特异结合干扰素刺激基因的 i s r e ( a g n g a a a n n g a a a c t ) 或者i 型干扰素基因启动子的v i e 序列。除了 i r f l 和2 外，其它成员都包含i a d 结构域( i r fa s s o c i a t e dd o m a i n ) ，它介导成员之 间以及与其它转录因子如p u 1 和s t a t 等的相互结合作用【5 7 1 。总体上，各成员之 间i a d 区域的同源性很低，但i r r 3 、5 和7 却具有较高的同源性【5 引，预示着三者可 能具有类似的功能。 i r f 家族基因在机体免疫系统中发挥了多方面的作用：所有的i r f 成员都参与 了免疫应答，其中i r f l 、3 、5 、7 、8 和9 主要诱导i 型干扰素、i s g 及前炎症因 子等免疫基因的表达，而i r f 3 和7 对i 型干扰素的诱导具有最关键性作用，i r f 2 和4 具有负调节作用，i r f 6 的功能有待进一步研究；发挥调节免疫细胞发育和分 化作用的有：i r f l 、2 、4 和8 ；几乎所有的成员都参与了调节细胞生长和凋亡。 每个成员具有特定的功能，但不同成员之间也有部分功能的重复，如i r f l 、4 、5 、 6 和7 都能结合受体分子m y d 8 8 ，介导t l r s 信号路径；i r f 4 和i r f 8 在b 细胞分化 中具有冗余的作用；i r f 3 和7 都能被r i g i m d a 5 信号通路中的t b k l 激酶磷酸 化。这些功能上的相同点主要是由它们的结构所决定的。如i i 强3 和7 的同源性很 高，其介导的信号通路和活性也相似。正是由于各个成员的功能特异性和共同点， 使它们相互补充，保证机体抵御各种病原微生物的入侵以及调节自身内环境的紊 乱，从而健康地发育和生长。 宿主为了生存，不断地完善自身的防御系统。但从病毒等病原体的角度，其 要生存也必需具备抵御宿主免疫系统的防御系统，所以进化出了相应的逃避机 制。病毒编码的v l r f s 就是为了干扰宿主的干扰素系统抑制其活性而使自身得到 复制并传播。 1 2 1i r f l 第一章文献综述 i r f l 是最早被发现的i r f 家族成员。它在各种细胞中组成型表达且受干扰素 诱导，主要存在于细胞核，部分位于细胞质【5 2 1 。它能特异结合干扰素p 启动子序 列的p r d i 元件。其过量表达能提高i 型干扰素的转录水平。它受i 脚强烈诱导， 但i f m 不足以激活i r f l 。在髓样树突状细胞和巨噬细胞中，i r f l 通过t l r 9 介导 的受体分子m y d 8 8 依赖的信号通路诱导干扰素d 的表达【2 酬，m y d 8 8 通过其中间部 位结合i r f l 使后者激活，并进入细胞核起始干扰素d 的转录【5 9 1 。最近的研究表明 在巨噬细胞中，i r f l ；是t n f a 介导干扰素b 基因表达所必需的【6 0 1 。但是，i r f l 缺 陷的鼠胚胎成纤维细胞受感然后并没有表现出i 型干扰素表达水平的下降。表明 i r f l 并不是诱导i 型干扰素表达所必需。 事实上，i r f l 在i v n t 介导的信号路径中扮演重要角色。i r f l 缺陷的鼠胚胎 成纤维细胞在i f n y 处理后一氧化氮合成酶( i n o s ) 、鸟苷结合蛋白和2 ，5 o a s 的 表达受到阻碍【5 。i r f l 敲除的髓样树突状细胞和巨噬受i f n t 和c p gd n a 刺激后， 干扰素b 、i n o s 署i i i l 1 2 p 3 5 的表达也受到抑制1 6 。所以，i f n 7 诱导i n o s 的表达由 i r f l 所介导。 此外，i r f l 能够调节多种免疫细胞的发育和分化，介导了m h ci 的诱导表 达以及细胞凋亡和抑制肿瘤基因诱导的转化。 在多种鱼类都鉴定了i r f l ，包括虹鳟【6 2 1 、乌鳢【6 3 1 、点带石斑鱼【6 4 1 、鲫鱼【3 钢、 海鲷和大鲮鲆【矧、鳜鱼以及牙鲆【6 8 1 。鱼类i r f l 普遍具有1 0 个外显子和9 个 内含子。乌鳢i r f l 启动子含有n f 1 c b 、s p l 结合位点和丫干扰素刺激位点( g a s ) ， 证明它是干扰素诱导基因【6 3 1 。除了病毒和d s r n a 外，鲫鱼i r f l 还能被含鲫鱼 c a b 干扰素的上清液所诱导。它在细胞内定位于核中，具有两个核定位信号 ( n l s ) ，其中一个与哺乳类相似，位于1 1 7 1 4 6 氨基酸之间，另一个位于d n a 结合域内，这是鱼类所特有的【6 5 1 。虹鳟i r f i 在肝组织中没有本底表达，注射 抗病毒性出血败血症病毒d n a 疫苗一周后，其表达在所有被检组织中都被上 调【3 4 2 1 。点带石斑鱼i r f l 能被l p s 所诱导【6 4 1 。大鲮鲆和海鲷各具有两个i r f i ( a 和b ) ，大鲮鲆i r f l a 和b 只有4 个核苷酸的差异，海鲷i r f l a 和b 可能是两个 可变剪切产物【矧。鳜鱼i r f l 的表达与m x 相比具有时间上的前导性【d 7 1 。 研究表明鱼类i r f l 能产生免疫应答。将虹鳟i r f l a 基因启动子克隆至i h n v 病毒g 基因的上游构建成d n a 疫苗重组载体能够很好地免疫虹鳟鱼体，重组载体 能够在小鼠n i h 3 t 3 细胞中进行转录【6 9 】。将牙鲆i r f l 克隆至c m v 启动子序列下 游构建成重组载体p c m v - j f l r f l 并转染同源细胞( h i n a e ) ，获得的上清液能够保 护异源细胞( e p c ) ，抵抗比目鱼弹状病毒( h i r r v ) 和v h s v 病毒的感染【7 0 1 。将 p c m v j n i 讧l 肌肉注射牙鲆后，其外周血白细胞中一氧化氮和酸性磷酸酶的表达 水平有所提高，且细胞上清液具有细胞因子类似物，能够保护h i n a e 和e p c 细胞 6 第一章文献综述 免受h i r r v 和v h s v 病毒的感染。且免疫7d 后，牙鲆鱼体内的m x 基因的表达达 到峰值。 1 2 2i r - z i r f 2 也能在各种细胞中组成型表达且受干扰素诱导，主要位于细胞核【5 2 1 。他 与i r f l 一样，能够结合干扰素d 启动子上v i e 元件的相同序列，晶体分析表明其 一致序列为a a n n g a a a 。但它却是作为阻隔蛋白下调i 型干扰素的表达。同样， i r f 2 也能调节细胞生长发育和分化。 在免疫应答过程中，i r f 2 主要与i r f l 和9 竞争结合底物来抑制i l u l 和9 的功 能，所以它能负调控m y d 8 8 依赖的t l r s 信号路径，从而阻碍i 型干扰素及其诱 导基因的表达。i r f 2 缺陷的c d s + t 细胞在体内对抗原刺激呈现出过强反应，同时 伴有i 型i s g 基因的不正常表达，但这种皮肤病的发生和i s g 基因的异常上调表 达在有关正调节i 型干扰素信号路径的基因被敲除后得到有效的抑制。这些说明 i r f 2 是免疫系统中一种独特的用来平衡i 型干扰素信号路径利与弊的负调控因 子。 i r f 2 能够促进i l 1 2 驱动的t h l 细胞分化，并抑制i l 4 驱动的t h 2 细胞分化。 i r f 2 缺陷的鼠由于嗜碱性粒细胞的积聚以及i l 4 的上调表达呈现出异常的t h 2 细 胞极化现象【7 1 1 ，同时由于i l 1 2 的表达抑制使得t h l 细胞分化受阻。这可能由于 i r f 2 与i r f l 协同作用促进i l 1 2 p 4 0 基因的表达，这样i r f 2 就不是前面所说一种单 纯的阻遏因子。也有可能是因为i r f 2 缺陷体中n k 细胞的分化缺陷导致了t h l 细胞 应答失效【5 2 】。i r f 缺陷的鼠表现出贫血，其脊髓中晚期成熟红细胞数量下降，而 早期的网织红细胞i i 体数量上升，所以i l 江2 能通过减弱i 型干扰素信号通路来实 现红