（应用化学专业论文）化学发光和染料探针在检测生物分子中的研究及应用.pdf

济南大学硕士学位论文 摘要 核酸和蛋白质的定量分析在生物化学和i 临床医学中具有重要意义，常用的方法主 要是分光光度法和荧光法，但它们都存在一定的缺陷。分光光度法灵敏度低、步骤复 杂、耗时长；荧光光度法仅限于荧光体系，试剂昂贵且有毒。而化学发光法( c l ) 和共 振光散射法( r l s ) 灵敏度高、简便快捷，是新型生化分析方法。 本文第一章对化学发光法、共振光散射法和染料探针的应用进行了综述。 第二章，经过实验发现并应用一种新的流动注射化学发光法检测蛋白质，此方法 利用了蛋白质在r u ( p h e n ) 3 b r 2 k m n 0 4 - h c l 体系中产生较强化学发光的性质。在最佳 条件下，牛血清白蛋白( b s a ) 浓度在6 o x lo 7 1 0 x 1 0 - 4 9 m l 范围内与化学发光强度呈 良好的线性关系，检出限0 回为2 5 x l o 7g m l ，对1 o x l o e g m l 的b s a 进行1 1 次平 行测定，相对标准偏差( r s d ) 为2 1 ：卵蛋白( e a ) 浓度在6 0 1 0 - 6 - 1 o x l 0 4 9 m l 范围 内与化学发光强度呈良好的线性关系，检出限0 a 为3 5 x 1 0 。7 e g m l ，对8 o x l o 巧g m l e a 进行1 1 次平行测定，r s d 为1 4 。本方法已成功用于鸡蛋蛋清中总蛋白含量的测定， 回收率在9 7 - 1 0 2 。 蛋白质在酸性介质中可与高锰酸钾反应产生化学发光，并且甲醛对发光强度有很 强的促进作用。我们用流动注射法在最佳条件下研究此化学发光体系，实验结果表明， 在最佳条件下b s a 浓度在4 0 1 0 l 1 0 x l 旷g m e 和1 o x l o 。5 - 1 o x l 0 4g m i , 范围内分 别与化学发光强度呈良好的线性关系，检出限( 3 a ) 为8 6 x l o 8 9 m l ，对8 0 x 1 0 4 9 m l 和2 0 x 1 0 巧咖l 的b s a 分别进行1 1 次平行测定，r s d 分别为1 9 和2 3 ；e a 浓 度在4 0 x 1 0 4 - 1 0 x 1 0 4 9 m l 范围内与化学发光强度呈良好的线性关系，检出限( 3 0 ) 为 3 2 x i 0 g m l ，对6 o x l o t g m le a 进行1 1 次平行测定，r s d 为1 8 。本方法已成功 用于鸡蛋蛋清中总蛋白含量的测定。 第三章，核酸可与高锰酸钾在酸性介质中反应产生化学发光，甲醛对发光强度有 很强的促进作用。我们用流动注射法研究此体系，结果表明，在最佳条件下，酵母 r n a ( y r n a ) 浓度在2 o x l o 7 1 o x l 0 4 9 ，m l 范围内与化学发光强度呈良好的线性关系， 检出限( 3d ，为1 6 x 1 0 7 r g m l ，对8 0 x 1 0 。g m e 的y r n a 进行1 1 次平行测定，r s d 为1 2 。 小牛胸腺d n a ( c t d n a ) 的浓度在8 0 x lo 7 - 1 o x l o 。4 9 m l 范围内与化学发光强度呈现良 化学发光和染料探针在检测生物分子中的研究及应用 好的线性关系，对1 1 2 x l 矿g ，m l 的c t d n a 进行1 1 次平行测定，r s d 为2 3 ，检出限为 ( 3 0 ，为4 7 x 1 0 。本方法已用于啤酒酵母提取液中r n a 含量的测定，结果良好。 第四章合成了4 一硝基锰酞菁并探讨了其在共振光散射中对生物大分子的测定。首 先研究了4 硝基锰酞菁共振光散射法在核酸测定中的应用，4 一硝基锰酞菁在 2 5 0 0 7 5 0 o h m 之间有弱的共振光散射，在酸度合适的介质中，核酸能使其3 9 6n n l 处 的共振散射蜂显著增强，且增强程度与核酸呈良好的线性关系。据此，建立了核酸的 共振光散射增强的分析方法。在最佳条件下，c t d n a 和y r n a 的线性范围分别为 0 - 5 0 0 0 n g m l 和0 - 1 0 0 0 o n g m l ，检出限( 3 0 ) 分别为1 0 n g m l 和2 2 n g m l ，分别对 1 0 0 n g m l 的c t d n a 和y r n a 进行1 1 次平行测定的r s d 为1 5 和2 1 。使用本方 法测定了合成样品中的d n a ，结果令人满意。 关键词：流动注射，化学发光，蛋白质，共振散射，核酸，4 硝基锰酞菁 一一 济南大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h eq u a n t i t a t i v e a n a l y s i so fn u c l e i ca c i d a n dp r o t e i ni so fg r e a ti m p o r t a n c ei n b i o c h e m i s t r y a n dc l i n i cm e d i c i n e t h ec o m m o n a n a l y t i c a l m e t h o d si n c l u d e s p e c t r o p h o t o m e l r y a n df l u o r i m e t r y , b u tt h e yh a v es o m es e r i o u s + d i s a d v a n t a g e s s p e e t r o p h o t o m e t r ys u f f e r sf i o ml o ws e n s i t i v i t y , m u l t i p l es t e p s ，a n dl o n gt i m e ；f l u o r i m e t r yi s r e s t r i c t e db yf l u o r i m e t r i es y s t e m sa n df l u o r i m e t r i e r e a g e u t sa l et o x i ca n de x p e n s i v e c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) a n dr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ( r l s ) t e c h n i q u ea l en e wa n a l y t i c a l m e t h o d sw i t hh i g hs e n s i t i v i t y , s i m p l i c i t y , r a p i d i t yi nb i n - a n a l y s i s i nc h a p t e rl ，w ec o m m e n t e dt h ep r o g r e s so f c l ，r l sa n dd y ep r o b e s i nc h a p t e r2 ，af l o wi n j e e t i o nc h e m i l u m i n e s c e n c em e t h o dh a sb e e nd e v e l o p e da n d a p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n t h ep r o p o s e dm e t h o di sb a s e do nt h el u m i n e s c e n t p r o p e r t i e so ft h er u ( p h e n ) 3 b r z - k m n 0 4 - - h c ls y s t e m b o v i n es e n l ma l b u m i n ( b s a 、 d e t e r m i n e de v e s t h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f6 0 x 1 0 - 7 一1 0 x 1 0 珥g m ew i t had e t e c t i o nl i m i t o f2 5 x 1 0 - te g m l ( 3 0 ) ，t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) f o r1 1i n d e p e n d e n td e t e c t i o n s o f1 0 x 1 0 + e g m lb s a w a s2 1 t h ec li n t e n s i t yw a sl i n e a r l yr e l a t e dt ot h ec o n c e n t r a t i o n o fe aw i t h i nt h er a n g eo f6 0 x 1 0 缶- 1 0 x 1 0 4 9 m e ，w i t had e t e c t i o nl i n l i t ( 3 0 ) o f 3 5 x 1 0 4 e m e , t h er s di s1 4 f o r8 o x l o 。e m ee as o l u t i o ni n 1 1r e p e a t e dm e a s u r e m e n t s t h ep r o p o s e dm e t h o dw a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ea n a l y s i so fp r o t e i ni ne g gw h i t ew i t h ar e c o v e r yo f 9 7 - 1 0 2 i tw a sf o u n dt h a tp r o t e i nc a nr e a c tw i t hk m n 0 4i na na c i dm e d i u n lt op r o d u c e c h e m i l u m i n e s c e n c e ，w h i c hi sg r e a t l ye n h a n c e db yh c h o t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h i s c h e m i l u m i n e s c e n c er e a c t i o nw e r es t u d i e di nd e t a i lu s i n gaf l o w - i n j e c t i o ns y s t e m t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t si n d i c a t et h a t , u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ec li n t e n s i t yi sl i n e a r l y m i m e dt ot h ec o n c e n t r a t i o no fb s ai nt h er a n g eo f4 x 1 0 - 7 _ 1 0 x 1 0 。5g m la n dl x l 0 一一 1 o x l o 。4 e m l w i t had e t e c t i o nl i m i t ( 3 6 ) o f8 6 x 1 0 一e m e t h er s da r e1 9 f o r 8 0 x 1 0 。7 9 m ea n d2 3 f o r2 0 x 1 0 e m eb s as o l u t i o nr e s p e c t i v e l y ( n = 1 1 ) t 1 1 e c l i n t e n s i t yw a sl i n e a r l y r e l a t e dt ot h ec o n e e n u a t i o no fe aw i t h i nt h e r a n g e o f 4 0 x 1 0 7 _ 1 0 x 1 0 _ 4e m e ，w i t had e t e c t i o nl i m i t ( 3 0 o f 3 2 1 0 7 e m e t h er s di s1 8 f o r 6 0 x 1 0 “e m ee as o l u t i o n ( n # 1 1 ) t h i s m e t h o d w a ss u c c e s s f u l l y a p p l i e d t o t h e h i 化学发光和染科探针在检测生物分子中的研究及应用 d e t e r m i n a t i o no f p r o t e i ni ne g gw h i t e i nc h a p t e r3 , tw a sf o u n dt h a tn u c l e i ca c i dc a nr e a c tw i t hk m n 0 4i na na c i dm e d i u m t o p r o d u c ec h e m i l u m i n e s c e n c e ，w h i c hi sg r e a t l ye n h a n c e db yh c h o t h eo p t i m u m c o n d i t i o n sf o rt h i sc h e r m l u m i n e s c e n c er e a c t i o nw e i es t u d i e di nd e t a i lu s i n gaf l o w - i n j e c t i o n s y s t e m t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t si n d i c a t et h a t , u n d e ro p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ec li n t e n s i t y i s l i n e a r l y r e l a t e dt ot h ec o n c e n t r a t i o no fy e a s t r n a ( y r n a ) i nt h e r a n g eo f 2 0 x 1 0 7 1 0 x 1 0 4 e c m l w i t had e t e c t i o nl i m i t ( 3 c oo f1 6 x 1 0 7 9 m l 1 1 l cr e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o n sa r e1 2 f o r8 0 x1 0 “g m ly r n as o l u t i o n ( n = 11 ) ；n l ec li n t e n s i t yi sl i n e a r l y r e l a t e dt ot h ec o n c e n t r a t i o no fc a l t t h y m u s d n a ( c t d n a ) i nt h er a n g eo f8 0 x 1 0 。7 - 1 0 x 1 0 4 9 m l ，w i t had e t e c t i o nl i m i t ( 3 a ，o f4 7 x 1 0 7 9 m l n 塘r s da r e2 3 f o r 1 2 x l o 。g m lc t d n as o l u t i o n ( n = 1 1 ) f i n a l l y , w eu s e dt h i sm e t h o dt od e t e r m i n et h e c o n c e n t r a t i o no f y r n ai nb e e ry e a s ta n dr e c e i v e das a t i s f i e dr e s u l t i n c h a p t e r 4 ，a p p l i c a b i l i t y o ft h er l so ft e t r a - s u b s t i t u t e d n i t r y lm a n g a n e s e p h t h a l o c y a n i n et o t h ed e t e r m i n a t i o no fn u c l e i ca c i di se x a m i n e d i ti sf o u n dt h a t t e t r a - s u b s t i t u t e dn i t r y lm a n g a n e s ep h t h a l o c y a n i n ea q u e o u ss o l u t i o n ( p h l 0 1h a sw e a kr l s i nt h ew a v e l e n g t hr a n g eo f2 5 0 0 - 7 5 0 0 n m , h o w e v e r , t h ei n t e n s i t yo fr l si s g r e a t l y e n h a n c e dw h e nt r a c ea m o u n t so fn u c l e i ca c i da l ea d d e d , w i t ht h er l sp e a kl o c a t e da t 3 9 6 01 1 1 1 1 t h ee n h a n c e di n t e n s i t yo fr l si sp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fn u c l e i c a c i d b a s e do nt h i sf a c t , an e wq u a n t i t a t i v em e t h o df o rn u c l e i ca c i da s s a yi sp r e s e n t e d u n d e ro p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h el i n e a rr a n g e so ft h ec a l i b r a t i o nc u r v e sw e r e 0 - 5 0 0 0n g m l f o r c t d n aa n d0 - 1 0 0 0 0 n g m lf o ry r n a t h ed e t e c t i o nl i m i t sw e r e1 0 n g m lf o rd n aa n d 2 2 n g m lf o ry r n a t h er s da r e1 5 f o r1 0 x 1 0 “g m lc t d n as o l u t i o na n d2 1 f o r 1 0 x lo - g m ly r n as o l u t i o nr e s p e c t i v e l y ( n = 1 1 ) f i n a l l y , w eh a v ea p p l i e dt h i sm e t h o dt o d e t e r m i n et h ec o n c e n t r a t i o no f c t d n ai ns y n t h e t i cs a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s k e y w o r d s ：f l o w 埘e c t i o n , c h e m i h i m i n e s c e n c e , r e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g ，p r o t e i n , n u c l e i c a c i d ，t e t r a - s u b s t i t u t e dn i t r y lm a n g a n e s ep h t h a l o c y a n i n e 一一 济南大学硕士学位论文 c l ：化学发光 f i a ：流动注射技术 r l s ：共振光散射 h s a ：人血清白蛋白 b s a ：牛血清白蛋白 e a ：鸡蛋清白蛋白 c t d n a ：小牛胸腺脱氧核糖核酸 y r n a ：酵母核糖核酸 n b s ：n 溴代丁二亚胺 c t m a b ：溴化十六烷基三甲铵 s d s 十二烷基磺酸钠 o p 1 0 ：乳化剂t x - 1 0 符号说明 i c l 化学发光强度 z l i g z s ；加入样品后体系共振光散射强度增加值 r s d ：相对标准偏差 m v 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：删日期： 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解济南大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借鉴；本人授权济南大学可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保 存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：上丑主j 萄导师签名： 盟 - 生f 济南大学硕士学位论文 引言 第一章绪论 蛋白质是生物体内最重要的物质之一，是生命的物质基础。催化生物体内几乎一 切化学反应的酶、调节物质代谢的许多激素以及人和动物体内防御疾病、抵抗外界病 原入侵的抗体等都是蛋白质或多肤，因此进行蛋白质的定量测定，研究蛋白质与其他 物质的相互作用具有十分重要的意义。 核酸是构成生命的重要化学物质，分为脱氧核糖核酸( 简称d n a ) 和核糖核酸( 简 称r n a ) ，所有生物细胞都含有这两类核酸。1 9 5 3 年w a t s o n ( 美) 和c r i c k ( 英) 提出了著名 的d n a 双螺旋结构模型，从此揭开了分子生物学的序幕；1 9 6 0 年，c r i c k 提出了遗传 信息传递的中心法则，核酸的研究进入了突飞猛进的发展时期；7 0 年代初，d n a 体 外重组技术获得成功，以核酸研究为基本内容的基因工程高新技术，已成为当前科技 领域中发展最快的学科之一，并大大推动了其他生物学科的发展。核酸定量测定有助 于测量生物流体和基因诊断中的其它生物活性成分，对于研究核酸的复制、转移及蛋 白质的合成等过程均有重要的意义，是生物时代人们关注和研究的重要课题之一。 蛋白质和核酸常见的定量测定方法有分光光度法、荧光光度法、共振光散射法和 高效液相色谱法等。 本章主要对流动注射化学发光法和共振散射法在生物分子定量检测方面的近期 进展进行了综述。 第一节流动注射化学发光分析 化学发光法是近3 0 年来发展起来的一种新型、高灵敏度的痕量分析方法，由于其 不需要外来光源，避免了瑞利散射和拉曼散射等噪音，因而光电倍增管在高压下工作 时具有比荧光法更高的信噪比。化学发光分析法以其灵敏度高、线性范围宽、仪器设 备简单、操作方便、分析快速和容易实现自动化等优点，成为分析化学中一个十分活 跃的研究热点，在痕量分析、环境科学、生命科学及临床医学上得到广泛的应用。化 学发光的定义为化学反应引起的光辐射，物质分子在化学反应过程中吸收了化学反应 产生的化学能而处于激发态，激发态分子返回到基态时以光的形式释放出能量，就产 生发光现象。要在可见光范围内观察到化学发光现象，化学反应除了要有非常快的反 化学发光和染料探针在检涮生物分子中的研究及应用 应速度外，还要求反应的焓变h 大约处于1 7 0 3 0 0 k j m o l 。化学发光反应大多是具备 这种要求的氧化还原反应。上世纪9 0 年代以来，化学发光分析法的发展呈现以下三个 主要特点：一是化学发光新体系研究活跃；二是化学发光与其他分析技术联用多样； 三是化学发光分析应用范围广泛。用于化学发光分析的手段也有很大的进步，从照相 法发展为光电检测，操作方式从手动发展为自动、原位及在线检测。 流动注射分析口l o w 坷e c t i o na n a l y s i s ，f i a ) 的出现是现代科学技术发展过程中对 化学信息的质量与数量要求不断提高的结果，f i a 是从实验室操作中的最基础部分入 手来提高整个化学分析过程的效率及改善提供信息的能力。f i a 的定义为：“从注入 一定体积并在无空气分隔的连续载流中得到分散的试样区带形成的浓度梯度中收集 信息的技术”。流动注射技术可以用较简单的实验设备在广泛的领域中实现分析的自 动化与高效率，还能够通过单次测定提供有关试样不同稀释，或试样与试剂不同混合 比例的多维信息，因此在现代分析化学中占有非常重要的地位。 流动注射( ( f l o wi n j e c t i o n ，f d 作为一种强有力的样品处理技术，只有同特定的检 测技术相结合才能形成一个完整的分析体系，但也正因此它才有极为广泛的适用性。 对于化学发光分析( c h e m i l u m i n e s c e n c e ，c l ) ，由于通常所使用的发光反应速度很快， 所以必须保证样品与发光试剂能够快速、有效、高度重现的混合，流动注射技术满足 了这一要求，它与化学发光分析相结合产生的流动注射化学发光分析法集两者的优点 于一身，不仅灵敏度高，线性范围宽，而且快速、重现性好、自动化程度高，在药物 分析、免疫分析和环境分析等领域得到了迅速的发展。 目前国内外化学发光法的应用较多，常用其检测无机离子、有机物等，但用于检 测蛋白质、核酸等生物分子的较为少见，尤其联合流动注射技术检测生物分子的更为 少见。 1 1 化学发光分析基本原理 化学发光分析是根据化学反应产生的光辐射( 化学发光) 确定物质含量的一种痕 量分析方法。产生化学发光的化学反应，必须具备两个条件：一是反应能释放出一定 的能量，且能量可以被某种反应产物或中间体吸收，使其处于激发态；二是这种激发 态物质具有一定的化学发光量子产率，或可以将其能量有效地转移给某种荧光物质， 产生光辐射。化学发光可以产生于紫外、可见或近红外区，现有已知的化学发光反应 主要产生在可见区。 - - 2 - - 济南大学硬士学位论文 化学发光反应之所以能够用于化学分析，主要是因为化学发光强度与被测物质的 浓度之间有一定的内在联系，对不同类型的化学发光，其分析的依据也不相同。根据 其形成过程的不同，化学发光可分为直接化学发光和间接化学发光，其发光过程可以 分别简单表示为： 直接化学发光；a + b c + + d c + _ c + 幻 间接化学发光：a + b 专c + + d 幸 c + f f + c f 专f + u 其中c 既可以是反应的中间体或反应产物，也可以是a 或b 的未反应部分。 在直接化学发光中，反应产生的激发态分子是光的发射体。化学发光反应所发出 的光强度决定于化学发光反应速度，而反应速度又决定了反应分子的浓度。化学发光 光强度( i t ) 与反应物浓度( 【r 】) 及时间( t ) 之间有下列函数关系1 1 ： 正= 庐d , r d t 其中，中为发光反应量子产率；皿 为被测物在t 时浓度：d , r t d t 为发光反应速率； 五为t 时刻的发光强度。 从上式可知，化学发光光强度( d 是时间( ，) 的函数，它与反应物质的浓度及发光反 应量子产率( 回成正比，也与反应速率成正比。因此，通过测量某一时刻的化学发光 强度或利用一定反应时间内相对发光强度对反应时间的关系曲线，就可以对反应物进 行定量分析。 根据被测物是否为反应的催化剂，直接化学发光又包括两种情况： ( i ) a + b 斗c 怕 由于化学发光反应大都是瞬时的快速反应，所以尽管a 物质( 假设b 过量) 的起始浓 度各不相同，但化学发光强度达到峰值所需的时间却基本相同，因此，化学发光最大 强度就与反应物质a 的起始浓度有线性关系，借此可对a 进行定量分析。 ( i i ) a + b c + 幻 其中，物质m 为a 和b 的化学发光反应的催化剂，其浓度可视为常数，且一般来 说，催化剂的浓度很小( 常在l 舭以下) ，因此，保持每次a 物质( 假设b 过量) 的起始 浓度不变时，所测得的化学发光最大强度就和催化剂m 的浓度有线性关系，借此可进 行催化剂m 的定量分析。 一1 一 化学发光和染料探针在检测生物分子中的研究及应用 在间接化学发光( 也叫敏化化学发光或能量转移化学发光) 中，反应最初产生的激 发态中间体不发光，而是将其激发能转移到荧光受体上导致荧光物质发光。如：过氧 草酸酯类化学发光等。间接化学发光的相关机理还有待进一步探讨。 1 2 常用发光试剂 1 2 i 鲁米诺及其衍生物体系 鲁米诺( 5 氨基邻苯二甲酰肼) 是使用最早、应用最广泛的化学发光试剂之一，它 性质稳定，结构简单，易于合成，而且无毒，不污染环境，水溶性较好。它在碱性溶 液中可以被强氧化剂氧化而处于激发态，激发态发射蓝光同时回到基态。利用生物分 子、有机物对鲁米诺化学发光反应的增强作用测定病毒唑【2 1 、硫胺素【3 】、葡萄糖【4 l 、 尿酸【5 】和芦丁( 6 1 等物质；利用有机物对鲁米诺化学发光的抑制作用已成功地测定了儿 茶烈7 1 、氨基非林和氨甲基苯甲酸f 8 】等物质，由此建立了各自的检测方法。鲁米诺类 衍生物也常用于设计新型的化学发光生物传感器。其中，最经典和常用的方法是使用 鲁米诺化学发光结合固定化酶技术来检测分析物 9 - 埘，国内近年的工作如封满良掣1 2 】 利用固定化酶的化学发光体系测定d 丙氨酸，检出限为1 8 x l o s r d m l 。 1 2 2 光泽精和吖啶类衍生物体系 光泽精是使用较早的一种发光试剂，现在仍用于化学发光分析。应用光泽精化 学发光体系可定量测定某些催化剂或催化剂标记的组分、过氧化物或可转化为过氧化 物的组分如f e ( i i ) 盼1 4 1 ，p b ( ) 1 6 】0 v ( v ) 【1 7 】等金属离子和核黄素【1 8 】、葡萄糖和果糖【1 9 】、 多巴胺1 2 0 1 、连苯三酚【2 1 1 等有机物质。以辣根过氧化物酶( m 冲) 和吖啶酯( a e ) 为化学发 光标记试剂分别标记神经生长因子( n g f ) 单克隆抗体，经分离纯化制成标记抗体 ( h r p a b ，a e - a b ) ，采用化学发光免疫分析法( c l i a ) p - j i ；j n g f 进行检测，其检出限为 o 5 n g m l ，线性范围为2 1 2 8 n g m l t m 】。 1 2 3 过氧草酸酯类体系 过氧草酸酯化学发光体系主要用于过氧化氢的定量检测或一些荧光团的分析。 k w a k m a n 等【2 3 】对过氧草酸酯的化学发光检测作了评述。一些易被氧化的非荧光发射 物质如s 0 2 、n 0 2 、苯胺、有机硫化物等能猝灭过氧化氢、草酸酯、荧光团之间的化 - - 4 - - 济南大学硕士学位论文 学发光，通过检测发光强度的降低值可以对这些物质进行定量分析f 2 4 - 2 6 。 1 2 4 酸性高锰酸钾体系 高锰酸钾化学发光反应大多在酸性条件下进行，该体系己成功用于吗啡【2 7 1 、l 酪氨酸口甜、毗哌酸四】、维生素b 6 p o 、核黄素【3 ”、氨基比林 3 2 1 、儿茶酚胺类药物【3 3 】 等的发光测定中。虽然目前对该体系的系统研究相对较少，但作为酸性介质中为数不 多的发光体系之一，高锰酸钾体系仍具有广阔的发展前景，尤其是它与某些荧光染料 相互作用可形成新的发光体系。药物及其它酸性条件下才能稳定存在的生化物质的在 线检测将是该体系发展的一个重要的研究方向。 1 2 5 r u ( b i p y ) 3 2 + 及r u ( p h e n ) 3 2 + 配合物体系 自从l y t l e 等p 4 1 于1 9 6 6 年首次报道了r u ( b i p y ) 3 2 + 的化学发光现象后，r u ( b i p y ) 3 2 + 逐 渐应用于化学分析。s k o t t y 等【3 5 】用丹磺酰氯先将氨基酸衍生化，然后用h p l c 分离， j 丑r u ( b i p y ) 3 2 + 电致化学发光测定了6 种氨基酸。利用r u ( b i p y ) ，2 + 体系化学发光分析法也 可直接测定脯氨酸和天冬氨酸，其检出限可分别达2 0 p m o l 和5 0 p m o l 【3 6 】。此外，利用 r u ( b i p y ) 3 2 + 化学发光体系还实现了对维生素b l p 7 】，6 - 巯基嘌呤 3 8 1 、含氮类神经药物1 3 9 、 空气中二氧化硫1 4 0 等物质的测定。r u ( p h e n ) 3 2 + 同r u ( b i p y ) 3 2 + 一样也可用作化学发光试 剂，g e r a r d 等h 1 1 对二者的作用进行了比较。何治柯等用r q b i p y ) 3 2 + 及r u ( p h e n ) 3 2 + 化学 发光法在酸性介质中测定草酸、酒石酸及5 种羟基酸1 4 2 4 4 ，对其化学发光反应机理也 进行了研究。 1 2 6 其它发光试剂 除了上述几类主要的化学发光体系外，还有洛粉碱、硅氧烯、l ，2 - 二氧杂环丁烷、 金刚烷、多元酚类、氧化二甲基吲哚、n - 溴代丁二亚胺( n b s ) 直接氧化、过氧化氢直 接氧化和铁氰化钾直接氧钇等化学发光体系，文献【4 5 。4 q 均有介绍。 1 3 化学发光法的应用研究 1 3 1 金属离子的测定 利用金属离子对化学发光的催化作用测定无机物的报道最多，利用被测无机物的 化学发光和染料探针在检测生物分子中的研究及应用 氧化作用、化学发光的抑制作用或偶合反应测定金属离子也较为常见。铬是一种有毒 元素，它在环境中的排放是受限制的，但它也是人体需要的微量元素，张小燕等【4 7 l 用常规发光体系鲁米诺一h 2 0 2 c r ( m ) 成功检测了血清和头发中微量铬，样品测定的相 对偏差小于1 1 o ，回收率介于9 0 1 0 5 之间。铅的毒性比铬高得多，因此人们研 究出多种发光体系来实现对不同环境中铅的测量。唐守渊等【4 8 】采用铅催化氧化鲁米诺 检测汽油样品和尿中的铅。刘丽莉等 4 9 1 利用复杂物料中的锟和钽对鲁米诺 h 2 0 2 一k 3 f e ( c n ) 6 发光体系的抑制作用，结合在线离子交换方法，实现了对这两种金属 的同时测定。田玉平等【5 0 】在地质样品银含量的测定中，采用了7 3 2 阳离子交换树脂， 静态吸附分离大量的基本元素，可不经富集直接以连续流动化学发光法测定，适应野 外的快速测定。部分金属离子的分析见表1 1 。 表1 1 金属离子的化学发光分析 1 3 2 无机非金属元素的测定 流动注射化学发光在无机非金属元素的测定中有着广泛她应用。亚硝酸盐是一种 常见的有毒物质，因此建立一种高效测定亚硝酸盐的方法很重要。高崎【5 们和i c a r d o 5 5 】 基于酸性介质中n 0 2 - 将亚铁氰化钾氧化为铁氰化钾，在尿酸的增强作用下或在消毒 灭菌剂抑制作用下，n 0 2 ：还原高锰酸钾，建立了检测亚硝酸盐的发光体系。 亚硫酸盐具有杀菌、溶解、防腐、增酸和抗氧等作用，常用作食品添加剂，但过 量的亚硫酸盐残留对人体有害，因此对亚硫酸盐的化学发光检测体系的研究较多 【5 “9 】，吴风武等删采用三邻菲咯啉亚硫酸根过氧二硫酸钾化学发光法测定了空气中 s 0 2 。 一6 一 济南大学硕士学位论文 h 2 0 2 是一种常用的氧化剂，所以在化学发光测定中经常利用h 2 0 2 的氧化性间接 测定其他物质，n o z a k i 等【6 1 1 使用一对微流动单元化学发光反应器测定h 2 0 2 ，也可使 用b r 2 作氧化剂流动注射化学发光法测定h 2 0 2 。f u j i w a r a 等 6 2 1 用鲁米诺溴化十六碳烷 基三甲胺逆胶束系统，经过在线氧化和提取，测定溴及溴化物。对于某些物质用在线 电生流动注射化学发光法存在的不稳定问题，依据恒电流电解产生c i o 与流动注射 化学发光分析相结合，提出电生不稳定试剂c i o 化学发光分析法测定卜多巴时，很 好地解决了化学发光反应中c 1 0 。不稳定问题。部分无机非金属离子的化学发光分析 见表1 2 。 表1 2 无机非金属元素的化学发光分析 1 3 3 有机化合物的测定 与无机物相比，有机物数目众多，可达几百万种。有机物对人类具有重要意义， 地球上所有的生命形式，主要是由有机物组成的，如脂肪、蛋白质、糖、叶绿素、酶、 激素等。生物体内的新陈代谢和生物的遗传现象，都涉及到有机化合物的转变。此外， 许多与人类生活有密切关系的物质，例如石油、天然气、染料、天然和合成药物等， 均属有机化合物。可见对有机物的检测具有重要意义。部分有机物的化学发光分析应 用见表1 3 。 利用微芯片化学反应器可实现酶催化化学发光测定葡萄糖刚，该法使用含微混合 器的微芯片化学反应器，建立了流动注射化学发光直接在线测定葡萄糖含量的方法， 并研究了增大测定灵敏度的方法及相关条件，此体系稳定，操作方便，整套设备易于 化学发光和染料探针在检测生物分子中的研究及应用 实现自动化在线检测。 卤化海因是一种高效低毒新型杀虫剂和消毒剂，正逐步被应用于水处理和游泳池 消毒等，因此需要随时检测其有效成分的浓度，以便准确判断其在水中随时间变化的 杀菌能力。利用流动注射化学发光法分别测定1 ，3 二氯5 ，5 - 二甲基海因和1 溴3 氯 5 ，5 二甲基海因，该法灵敏度高，二者检出限分别达0 5 和0 2 n m o 儿，不但快速、简 便，且可随时监控该药剂在水中杀菌能力的变化，为海因类化合物的开发利用提供了 一种实用的检测手段【6 卯。 流动注射化学发光法在生物分子定量测定中所表现出来的优势正逐渐引起越来 越多科研工作者的兴趣。 聂菲等m 1 根据锰( ) 氧化酪氨酸可以产生弱的化学发光，甲醛对这化学发光反 应有较强的增敏作用的原理，建立了测定酪氨酸的流动注射化学发光分析法。实验结 果表明，该方法检出限为2 o 1 0 7 9 m l ，线性响应范围为0 8 x 1 0 - 7 1 o x l o 巧咖l 。张 小燕等 7 3 】采用硫氰化钾鲁米诺化学发光体系对酪氨酸进行定量测定，该方法的线性 范围为o 1 1 0 o m g l ，检出限为1 o x l o 8 9 m l 。方卢秋等【7 叼发现在碱性条件下，n b s 氧化谷氨酸产生强烈的化学发光信号，结合流动注射技术，建立了测定味精中谷氨酸 含量的流动注射化学发光分析法。实验研究了影响化学发光信号强度的各种因素，方 法的测定线性范围为3 0 1 0 6 1 0 x 1 0 3 9 m l ，检出限为1 0 x 1 0 6 9 r n l 。史伯安等7 5 1 发 现在酸性条件下，半胱氨酸对r u q h e n ) 3 2 + c e ( ) 反应体系化学发光有显著的增强作 用，据此建立了流动注射化学发光法检测半胱氨酸的新体系，该方法的线性范围为 1 0 x 1 0 s - 8 0 x 1 0 g m l ，检出限3 7 x l o g g m l 。 谢志鹏等【7 粤基于维生素还原铬( ) 产生的铬( m ) 催化鲁米诺h 2 0 2 发光体系的研 究，结合流动注射技术建立了一种灵敏度高、线性范围宽的流动注射化学发光测定维 生素b 2 的新方法。该方法在1 0 x 1 0 一o 1 0 x 1 0 巧m o l l 之间分段回归，呈良好的线性关 系，检测限达到3 0 x 1 0 “m o l l 。 莫小曼等【7 7 1 系统地研究了在碱性介质和阳离子表面活性剂c t m a b ( 溴化十六烷 基三甲铵) 存在下，n a c i o 氧化异硫氰酸荧光素牛血红蛋白标记物的化学发光行为和 化学发光反应的条件，提出了反相流动注射化学发光测定牛血红蛋白的新方法。该方 法测定牛血红蛋白的线性范围为o 2 6 1 2 8 p g m l ，检出限为o 1 3 耀细l 。 朱霞萍等【7 8 】发现在硝酸介质中，d n a 被高锰酸钾氧化能产生很强的化学发光， 而且发光强度在一定的范围内与d n a 的浓度呈线性关系，据此建立了流动注射化学 - 8 一 发光测定d n a 的新的分析方法。测定的线性范围为2 0 - 1 0 0 t t g m l ，检出限为 6 2 p g m l 流动注射化学发光分析法具有选择性好、灵敏度高，设备简单等优点，已在生命 科学、环境科学等领域发挥了巨大的作用。虽然已知的化学发光体系很多，但应用生 物分