化学分析方法验证程序.doc

化学分析方法验证程序编制说明一、任务来源经国家标准化管理委员会同意，设立认证认可行业标准，由国家认监委归口管理。本标准是由国家认监委下达的2013年认证认可行业标准制修订计划项目化学分析方法验证程序（立项编号为2012RB010），由上海出入境检验检疫局和广东出入境检验检疫局负责起草。二、立项背景对分析方法进行验证的主要目的是确证该方法达到某一分析目标。在验证过程中往往能够发现方法的不足之处，或发现方法中存在的非预期的问题，例如出现干扰物、试剂和设备不再可用、设备需要改造等，这些问题的出现要求对方法进行的改进。此外，通过实验室间的验证还常常会发现这样的情况，一个新建方法在某一实验室内获得的分析结果令人满意，但在同样的操作条件下应用于另一实验室则不能获得满意结果，这也同样说明方法存在问题和需要改进。对方法进行验证和改进两个步骤需要反复进行，直到方法的各方面参数均能满足预期的分析目标。目前我国针对方法的验证尚无统一的验证程序，以往国家标准及检验检疫行业标准制定过程中对方法的验证均是按照约定俗成的做法（以下称为“原验证模式”），即仅进行实验室内验证及协同试验验证两个步骤。近年来在标准的审定过程中发现，原验证模式在实施中存在以下几个主要问题：（1）原验证模式对验证参数的选择这一关键性验证步骤未作规范，导致方法起草人在实施验证过程中做法不一致，影响验证的有效性。原验证程序中未规定如何选择验证参数（即方法的特性参数），一般由方法起草人自行选择，则可能出现所选验证参数不全面或不具代表性的问题。此外，即使是对同一参数的验证，起草人的做法也不统一和不规范。新验证程序中规范了验证参数的选择及具体验证过程的实施等技术要点，统一验证做法。（2）原验证模式中对验证实验室的选择、验证物料的获取等直接影响到验证结果有效性的步骤未设定具体要求。原验证模式中，已有一些文件对标准的验证作出部分规定，如SN/T 0001-1995 出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定和SN/T 1831-2006 进出口化矿金商品化学分析方法标准编写的基本规定。然而这些文件仅对验证提出简单要求，例如规定协同试验应由8-11家实验室进行等。在实际操作过程中，由于现存文件对于验证实验室的选择未作规定，一般由起草人自行选择，因而可能存在所选验证实验室不具代表性的问题，这将直接影响验证结果的有效性。新的验证程序中对可能影响到验证结果的参数均作出详细规定，保障了验证结果的有效性。因而，验证是保证一个新建方法具有适用性、科学性和严谨性的关键步骤，因此，十分有必要建立一个统一的验证程序来规范标准方法开发过程中的验证工作。三、 标准制定依据1、 参考文献本标准在大量调研国内外同类文件、文献的基础上制定，主要参考文献列举如下：（1）美国公职分析化学家协会（AOAC）单实验室验证导则（AOAC Guidelines for Single Laboratory validation ）和协同试验验证导则（AOAC Guidelines for Collaborative Study validation ）。（2）欧盟委员会决议2002/657/EC分析方法性能及结果解释（COMMISSION DECISION of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC the performance of analytical methods and the interpretation of results ）（3）国际纯粹与应用化学协会（IUPAC）统一的单实验室分析方法验证指导原则（IUPAC harmonized guidelines for single laboratory validation of methods of analysis）（4）人用药品注册技术规定国际协调会议（ICH）分析过程的确证：方法学（Guidance for Industry Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology）。（5）国内转化ICH导则：化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则。（6）ISO 5725-2/GB/T6379.2：测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法。（7）HJ 168-2010 环境监测 分析方法标准制修订技术导则2、本标准和同类文献的差异本标准的技术内容与上述文献的主要差异如下：（1）较之于国内外同类程序及文件，本标准将“实验室内验证”、“独立实验室验证”、“协同试验验证”三个关键性步骤，规范于同一个标准程序中，以使整个验证流程更具完整性、延续性和可操作性，有利于标准使用者了解并顺利完成整个验证流程；（2）本标准参考了上述国内外权威文献资料中的技术手段，但对于每一项“验证参数”，都具体制定了的验证方法，以资料性附录的形式给出，以供标准使用者参考使用。四、标准主要内容的技术论证1、适用范围化学分析方法种类多样，在化学品、矿产品、金属材料等化矿金分析领域的化学方法占比例较大，其中包括化学分析方法和仪器分析方法，仪器分析方法又包括色谱法、质谱法、光谱法等。本标准制定的验证程序，适用于化学品、矿产品、金属材料等领域化学分析方法的验证，由于食品检测项目较多、检测方法较为复杂，因而对分析方法验证的要求也与化矿金化学分析方法验证的要求略有差异，因而本标准适用范围未将食品检测用化学分析方法列入其中，但食品检测类化学分析方法的验证也可参考本标准的技术内容进行。因而本标准的适用范围规定如下：本标准规定了对化学分析方法进行验证的程序。本标准适用于化学品、矿产品、金属材料等领域化学分析方法的验证。2、技术内容概要根据方法验证的步骤，分为三个部分：一为实验室内验证（in-house validation），指方法开发方通过本实验室内对方法特性指标的测试，初步判断方法的适用性；二为独立实验室验证（independent laboratory validation），指独立于方法开发方的实验室，通过重复测试方法的性能指标，以审核方法特性指标是否能够满足预期的分析目标；三为协同实验验证（collaborative study validation），指协同实验室通过协同实验以获得测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）。3、“实验室内验证程序”技术内容的设定本实验室内验证程序部分：规定了本实验室内验证方案的设计，包括对方法文本的要求、对方法稳健性的验证、对方法预期用途的描述、验证参数的选择方法、本实验室内验证步骤等技术参数。3.1 对“方法文本”的技术要求由于验证所考察的分析方法应是一个标准化的方法，因而这个方法（1）首先应是稳健的，即试验过程中的微小变动不会导致试验结果产生不可预估的大变化。为便于标准使用者，本标准以资料性附录的方式，在附录A中给出了稳健性试验步骤。（2）此外，所建立分析方法的文件应该是明确和完整的。所有涉及该方法使用环境的重要操作，包括试剂和器具、设备的初始检查、测试样品的准备等都应包括在分析方法中。分析方法中还应规定校正程序和校正频率。3.2 对“方法预期用途描述”的技术要求“方法预期用途”是指开发一项方法的目的。为达到好的验证效果，方法开发方应根据实际情况描述方法的预期用途。预期用途的描述内容应当包括制定方法的目的，分析物的形态、存在形式及其分布的介质、浓度，现有法规及动态等相关信息；必要时，还应包括其应用的时域、地域、行业等信息。3.3 验证参数的选择方法方法开放方应根据所开发方法的预期用途选择合适的验证参数，并形成实验室内验证方案。典型的验证参数包括方法的选择性、检出限、定量限、线性、范围、灵敏度、稳健性、正确度、精密度。方法的预期用途决定了对方法性能的具体要求，验证参数的选择应根据方法的预期用途加以确定。对于不同类型的化学检测方法，标准给出了验证参数的选择原则：表1：典型验证参数的选择检测限定量限正确度/回收率精密度选择性/专属性适用性/稳健性/稳定性线性/灵敏度/范围定性方法S+-+-C+-+-定量方法S+-+C+备注：“S”=筛选方法（Screening methods）；“C”=确证方法（Confirmatory methods）“+”=必选参数；3.4 对“实验室内验证步骤”的技术要求方法开发方应按照计划的验证方案首先完成本实验室内的验证，初步判断方法的适用性。为便于标准使用者，标准以资料性附录的方式，在附录B中给出了选择性、检出限、定量限、线性、范围等各验证参数的具体验证步骤。本实验室内验证的目的，是为了让方法开发方在其实验室内对方法的性能指标进行验证，判断在其实验室内，所开发的方法是否已经能够达到方法制定之初所设定的目标。因而，在本实验室内的验证过程中，若某一参数的结果表明分析方法不能满足检测目标的特定要求，方法开发方应对该方法进行必要的修改后，并重新进行验证，直至能够证明其满足检测要求。4、“独立实验室验证程序”技术内容的设定在建立化学分析方法的过程中常常会发现，一个新建方法在某一实验室内获得的分析结果令人满意，但在同样的操作条件下应用于另一实验室则不能获得满意结果，可能由于地域、操作人员、仪器设备等各种原因导致，这也同样说明方法存在问题和需要改进。此时，“独立实验室验证”发挥的作用就尤为重要，需要由1-2 家独立于方法开发方的验证实验室，按照方法开发方设计的验证方案，即选择的验证参数，进行独立实验室验证。验证实验室通过重复测试实验室内验证参数，以审核方法性能指标是否能够满足预期的分析目标，或查找和发现方法无法满足预期分析目标的原因。若独立实验室验证结果无法满足方法预期的分析目标，则应将结果反馈给方法开发方，并要求其对方法进行必要的审查并重新进行本实验室内验证流程；若结果能满足方法预期的分析目标，则完成独立实验室验证流程。5、“协同试验验证程序”技术内容的设定本部分的技术内容涉及：协同试验验证实验室的选择、物料的准备、以及协同试验的开展实施等技术内容，分别论证如下：5.1 对“验证实验室数”规定的技术要求 为了使验证试验的数据具有统计学意义，实验室数的选择是在可利用资源与将估计值的不确定度降低至一个满意的水平之间的一种折中。从图1中可以看出，当参加试验的实验室数很小（p=5）时，重复性标准差和再现性标准差的不确定度是很大的，而且增加2-3个实验室，不确定度将会有很大的降低。而当p大于20时，再增加2到3个实验室只能使估计值的不确定度降低很少。一般取p为815为宜。只有在极个别的情况下，如能够参加验证试验的实验室确实不足，或者测试非常昂贵，或者样品本身确实难以得到等原因，可以采用5个实验室进行验证试验（SN/T 0001中规定参加协同试验的实验室个数不得少于5个，且所提供的结果数据都要在统计估计的置信区间之间。另一来自ASTM E691的规定为：在任何情况下分析方法的精密度结果必须基于来自同一物料的不少于6个验证实验室的可接受测试结果），在这种情况下，鼓励验证试验的组织者要增加每个实验室的重复测量次数n，不低于4次。图1 以概率水平95%，预期sr的偏离不超过其真值得倍数 因而本标准中规定：“6.1.1参加协同实验的实验室个数一般取815，要求获得至少8 个有效数据报告。只有在极个别的情况下，如参加验证试验的实验室确实不足，或者测试非常昂贵，或者样品本身确实难以得到等原因，可以采用较少实验室（不少于5 个有效数据报告）进行验证试验。”5.2对“每个实验室在每个测试水平需要进行的测试次数，n”规定的技术要求ISO 5725中说明，当实验室间标准差sL大于重复性标准差sr（即g大于2，g=sR/sr，）时，每个实验室在每个水平的测试结果数n=2时，并不会获得比n=2时多太多的信息。因此若认为存在可疑测试结果的危险性较小时，一般可取n=2（如图2）。ASTM E691规定，一般情况下每个实验室在每个测试水平进行测试的次数为化学测试3次，物理或光学测试34次。图2：以概率水平95%，预期sR的偏离不超过其真值的倍数因而本标准中规定：“6.3.2一般情况下每个实验室在每个测试水平进行测试的次数为3 次。若认为存在可疑测试结果的危险性较小时，一般可取n为2”。5.3对“验证实验室的选择”的技术要求从统计的观点来看，那些参加验证试验的实验室宜从所有可使用该测量方法的实验室中进行随机选取，自愿参加的实验室可能不代表实验室的实际组成。且参加的实验室不宜仅由那些在对测量方法进行标准化过程中已获得专门经验的特别“标准”的实验室组成。在征集所需数目的协同实验室时，应明确规定这些实验室的职责。一个“实验室”被认为是操作员、设备和测试场所的一个组合。一个测试场所（或通常意义的一个实验室）可产生几个“实验室”，只要它能够为几位操作员的每一位提供独立的仪器设备和测试场地。因而本标准中规定：“6.1.2验证实验室选择要具代表性和公信力，参加的实验室不宜仅由那些在对测量方法进行标准化过程中已获得专门经验的特别“标准”的实验室组成”。5.4对“物料水平”的技术要求在确定一个测量方法的准确度的测试中，所使用的物料应该完全能代表该测量方法在正常的使用中的那些物料。作为一般规则，使用5种不同的物料通常就能够满足较大的水平变化范围，用这些水平完全能够确定所要求的准确度。（ISO 5725）此外，实验室间验证中物料的类型和数目将取决于该类待测物料的水平范围以及在此范围内精密度与浓度水平的关系，取决于获取、加工、及分发样品过程的难度和费用，取决于进行测试所需要的时间和费用等。例如，若已知道在待测物料的水平范围内精密度相对恒定或与平均水平成比例，则较之于仅仅知道在不同水平精密度不同，前一种情况下只需要较小的物料数目。一个实验室间验证试验应最少选择3种物料代表不同的测试水平。（ASTM E691）因而本标准中规定：“6.2.2作为一般规则，使用5 种不同的物料通常就能够满足要求。此外，实验室间验证中物料的类型和数目还取决于获取、加工及分发样品过程的难度和费用，取决于进行测试所需要的时间和费用等。一个实验室间验证试验应最少选择3 种物料代表不同的测试水平。物料的选择既应确保其能代表测量方法在正常使用中的那些物料，又应满足方法的预期用途。如为评估材料与技术法规的符合性而开发的化学检测方法，在进行实验室间验证时，物料中至少应包含一种目标分析物浓度（含量）接近于法规限量的样品”。5.5 对“物料制备”的技术要求物料的制备应考虑抽样、均匀性、稳定性、在运输中可能的损坏及周围环境条件的影响等。应尽可能选择均质的物料或对物料进行均质化。当物料必须进行均质化时，应对该种物料以最合适的方式进行均质化。在对不能均质化的固体物料（如金属、橡胶、纺织品等）进行测量时，或不能对相同试样重复测量时，物料的非均质性将成为该测量方法精密度的一个重要分量。（ISO 5725）如果容器一旦被打开，物料就有变质的危险（例如被氧化、损失挥发或吸湿物料），那么对于每一水平下的样本，应对每个实验室使用n个不同的容器。对于不稳定的物料，应给出特殊的储藏和处置说明书。如果要测量的物料是由不同相对密度的粉状物料混合而成或由不同大小的颗粒组成的，那么由于震动可能会产生分离（例如在运输过程中），因此需要特别注意。在受试样本可能与空气发生反应时，样品可以被封在被抽空或者用惰性气体填充的玻璃瓶内。因而本标准中对物料制备的要求规定如下：“6.2.1方法开发人应进行验证用样品的准备，对样品进行匀质化，并对其均匀性和稳定性进行测试”。此外，本标准中以资料性附录的方式在附录C中给出了均匀性与稳定性实验步骤。5.6 对“物料数量”的技术要求在决定试验所需的物料数量时，应考虑到在获得某些测试结果时会出现偶然的操作过失，从而需用到额外的物料。（ISO 5725）需准备的物料数量应当足以满足测试之用，并且允许适当的冗余。应考虑在得到正式的测试结果之前一些实验室为了熟悉测量方法而获得某些初步测试结果是否可取，如可取，则也应考虑是否应提供额外的物料（非精密度试验样本）。（ASTM E691）但是，也不能提供过多的物料样品，以防止有实验室出于某种原因，过多地进行实验，并且从中“挑选”报告某些检测结果，从而人为地提高了该实验室的精密度。一般以所需试验的物料量的2-5倍为宜。因而在本标准中规定：“6.2.3在决定试验所需的物料数量时，应考虑到在获得某些测试结果时会出现偶然的操作过失，从而需用到额外的物料。需准备的物料数量应当足以满足测试之用，并且允许适当的冗余。但是，也不能提供过多的物料样品，以防止有实验室出于某种原因，过多地进行实验，并且从中“挑选”报告某些检测结果，从而人为地提高了该实验室的精密度。一般以所需试验的物料量的2-5 倍为宜”。6、资料性附录6.1 稳健性实验步骤（附录A） 一个好的分析方法应该不受环境等因素的变化而变化，即对于温度、湿度、气压等环境因素的变化，以及对于加入试剂量、反应时间等其他因素呈现不灵敏性。稳健性（耐变性）试验是考察环境或其他条件变量对分析方法影响的一项检验程序，进行稳健性试验的目的在于鉴别这些必须仔细控制的实验条件，并在试验方法文本中予以明确的书面说明。例如，实验室温度或试验中使用的某一加热装置的温度，这些条件在某些情况下具有不可忽略的影响，而在另一些情况下则影响很小，进行稳健性试验可引入温度自由变量以建立温度控制允许范围。本标准附录A中介绍的是数理统计学家尤登设计的耐变性试验（Youdens Ruggedness Test），无需繁琐的方差分析，只需一般的数学计算即能对因素的影响作出判断，同时它还具有试验次数少的优点。6.2化学分析方法验证参数验证方法（附录B）本标准在附录B中给出了各验证参数的验证方法，分别进行技术论证如下：（1）选择性（附录B.1）：选择性指在杂质、辅料等其他成分可能存在的情况下，采用的分析方法能够正确鉴定、检出被分析物质的特性。为一种分析物或一组分析物选定一种方法，这种方法就是特定的，通常鉴别、杂质测定、含量测定方法中均应考察其选择性。应当用各种样品来研究方法的选择性，所用的样品种类从单纯的测量标准到具有复杂基体的混合物。在每种情况下，都应当确定被研究的分析物的分离情况，并充分说明可疑干扰的影响。如采用的方法的选择性不够，应采用多个方法予以补充，方法选择性的任何限制都应在方法中有文件化的规定。标准附录B.1给出了了选择性的具体验证方法。（2）检出限（附录B.2）：检出限指试样中的被分析物能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量。该验证指标的意义在于考察方法是否具备灵敏的检测能力。如对杂质限量试验，需证明方法具有足够低的检测限，以保证检出需控制的杂质。方法检出限的确定方法可有以下几种，根据不同的检测方法选择合适的确定方法。然而无论用何种方法，均应用一定数量的浓度为近于或等于检测限试样进行分析，以可靠地确证检测限。建议在给出检测限时说明引用的是哪一种方法。标准附录B.2给出了了检出限的具体验证方法。（3）定量限（附录B.3）：定量限指试样中的被分析物能够被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。杂质定量试验，需考察方法的定量限，以保证含量很少的杂质能够被准确测出。方法检出限的确定方法有许多种，根据不同的检测方法选择合适的确定方法。然而无论用何种方法，均应用一定数量浓度为近于或等于定量限的试样进行分析，以可靠地确定定量限。建议在给出定量限时说明引用的是哪一种方法。标准附录B.3给出了了定量限的具体验证方法。（4）校正与线性（附录B.4）：线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如杂质定量和含量测定均需要验证线性。对线性进行验证时需考虑到基质效应。基体对待测组分的影响称为基体效应，基体效应对于选择合适的测量方式有很大的影响。常用的校准曲线测量法只有在没有基体效应或基体效应不影响测定结果时才能使用。如果基体效应影响测定结果，但对测定结果影响不是太大时，可用标准加入测量法来消除存在的基体效应的影响。但基体效应很明显时，