（化学工艺专业论文）脂肪酶的化学修饰及其界面催化性能研究.pdf

摘要 脂肪酶的化学修饰及界面催化性能研究 m o d i f i c a t i o no f l i p o l a s ea n ds t u d yo fi n t e r f a c i a l c a t a l y s i so f m o d i f i e de n z y m e 研究生：翁永珍导师：蒋惠亮副教授专业：化学工艺 摘要 脂肪酶作为一种水解酶，不仅催化水解反应而且催化有机相中酯合成和酯交换反 应。有机相酶催化自上世纪八十年代开创以来，已获得了巨大的发展，得到广泛应 用，但还存在酶在有机相中溶解性、稳定性差、催化效率低等缺点。化学修饰是克服 上述缺点，提高酶催化功能的有效方法之一。本章研究的目的是：用具有长链烷基的 硬脂酸对l i p o l a s e 脂肪酶进行化学修饰得到具有两亲分子结构的修饰脂肪酶，提高修 饰酶的表界面活性及其在有机相或两相界面的催化性能。本文研究的主要内容如下： 1 选择合适的修饰剂并对其进行活化：为了提离酶在有机相中的溶解性，应在酶表面 引入疏水性物质，我们选择长链硬脂酸作为修饰剂。通过查阅文献，比较多种活化 方法，本实验采用n _ 羟基琥珀酰亚胺活化法活化硬脂酸，此方法成本低、毒性小且 反应温和。通过红外光谱和质谱对硬脂酸琥珀酰亚胺酯进行了结构分析。 2 脂肪酶的修饰：由于蛋白质分子表面游离氨基较多并且具有较高的反应活性，因此 氨基常被选为修饰基团。此反应即为硬脂酸琥珀酰亚胺酯与脂肪酶表面氨基的反 应。反应条件：p i - i 值7 4 、常温磁力搅拌。分离方法：透析。通过改变脂肪酶与硬 脂酸琥珀酰亚胺酯的质量比和反应时间得到不同修饰度的修饰酶。 3 酶活测定：对修饰酶的水解活性和有机溶剂中的酯化活性和界面催化活性进行了测 定，并与未修饰酶进行了比较。实验结果表明修饰酶的水解活性略有下降，但在有 机溶剂中的酯化活性和在油，水界面催化活性明显提高。 4 有机溶剂溶解性、稳定性及热稳定性测定：脂肪酶修饰后在表面存在长链烷基，分 子具有两亲性，亲油性增加。实验结果表明修饰酶在正己烷中的溶解度增加，稳定 性及热稳定较之未修饰酶均有所提高。 5 界面化学性能表征：酶修饰后结构发生了变化：一端是亲水基，一端是疏水基，类 似于表面活性剂，应有一定的表面活性。本论文考察了修饰酶与未修饰酶水溶液的 江南大学硕士学位论文 表面张力与界面张力。结果表明：与未修饰酶相比，修馋酶降低溶液表面张力与晃 面张力的能力提高。 6 l b 膜的制备及其结构表征：酶经修饰后表面活性提高，更容易在界面吸附。l b 单分子膜由l b 成膜装置制备，并在原子力显微镜m ) 下观察其形貌特征。l b 膜制备的同时得到a 曲线实验结果表明：修饰酶的n a 曲线上移；由a f i v i 图象分析发现在修饰酶的分子表面有暴露的长链烷基。 关键词；l i p o l a s e 脂肪酶：化学修饰；酯化活性；界面活性；界面张力；表面张 力；l b 膜；a f m 摘要 a b s t r a c t l i p a s e se a t a l y z en o to n l yt h eh y d r o l y s i so fh p i d si n 啪l e rb u ts y n t h e t i c 哟c t i o 璐j n o r g a n i c l 、懂止s u c ha se s t e r i f i e a l i o na n dm t e r e s t e r i f i c a t i o n 。卫摇a p p l i c a t i o no ff i p a s ef o r s y n m e t i c 卿h a sb e e nl 】r d 盱i n t e n s i v es t u d yi nr e c e n ty e a r si nt h ef o o d , p h a r m a e e u t i c c o s m e t i e sa n ds oo n h o w e v 盯, l h es t a b i l i t ya n dd i s p e r s i n l i t yo fn a t i v ef i p a s ei no r g a n i c 眦i sm u c hp o o r 盯t h a ni nw l t t e l i ts e e m sr e a s o n a b t et oa t t e m p tt 0 3 i 嘞l r cm o s t a b l e g , n z y m 嚣i n0 r g a n i es 0 1 v 髓t st oo v e l c o m ei t sp r o b l e m s c h e m i e a lm o d i f i c a t i o n 勰ar a p i d 锄d m c x p e m i v em e t h o do l i no y e r c o m ep r o b l e m sa b o v ea n di m p r o v ei 括d i s l u d o na n dc a t a l y s i s p r o p e r t yi no r g a n i c l v e n t 1 ki n t r o d u c t i o no fh y d r o p h o b i co ra m p h o t e r i ee o m p o t m d s 伽【协 t h ee n z y m e 岛耐如ec a r lp r o m o t ed i s s o l u l i o ni n t oo r g a n i es o l v e n tt h r o u g hf a v o r a b l ei n t e r a c t i o n b e t w e e n 血e s ec o m p o u n d sa n dt h e l v e n t h 也ep a p e r , w ei n l r o d u e e 自l 哆a c i d s 伽【幻t h ee l l z y m es u r 缸e 1 1 1 es t e a r i e i dw a s a c t i v a t e db yn - h y d r o x y s u c e i n i m i d e 1 1 坞f i p o l a s ew 鹊m o d i f i e d 埘t ha c t i v a t e ds t e a r i e 勰i d 1 a y d r o x y s u e e i n i m i d ce s t e rt h r o u g ht h el 瑚t c t i o nb e t w e e nt h ea l l l i n o 伊d u p sa n d f i v a t e df a t t y a c i d s 1 1 地咒a e d o nw 硒c a r r i e do u ta lr o o mt e m p e r a t u r ea n di nt h ec 躐o ft h ep h7 4 m m o d i f i c a d o nr a t i oc a l lb ec o n t r o l l e db yc h a n g i n gt h em o l a rr a t i oa n dr e a c t i o nt i m e 缸t h e r e a c t i o ns y s t e m 啊垃e d z y l n a l i c 缸v i 竹，s 1 1 嘞c ea e t i 啦a n di m e r f a c eb e h a 嘶w e 婶s t u d i e d 1 1 尬 h y d r o l y s i s 出慨m t e r f a e i a lh y d r o l y s i sa e l i v i 够a n de s t e r i f i c , a t i o na e t i 嘶o ft h em o t t l e d e n z y m ew e r e 蠲s a y e 正1 k s l l l l ss h o w e dt h a tt h ei n t e r r a c i a lh y d r o l y s i sa e t i 啦砒t l a e m t e r f 孔eo fo i l - w a t e rp h a s ea n d 蒯c a t i o na e t i 咖i nh e x a n eo ft h em o d i f i e de n z y m e i n c r e a s e da p p a r e n d y , a n h o u g h 血eh y d r o l y s i sa e t i 嘶d e c r e a s e d1 i t t l ec o m l 搬c d 诵也t h e u n m o d i f i e de l l z y m e a f t e rm o d i f i c a t i o nt h es u r f a c ea e t i v i t yo fm o d i f i e de l l z y m ew a s i m o v e d n l es u r f a c et e n s i o na n d 也ei n t e r f a c i a lt e n s i o no ft h em o d i f i e da n du n m o d 砺e d 自吡w m e sw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d t h es u r f a c et e n s i o na n dr a t e r f a c i a lt e m i o no ft h es o l u t i o no f m o d i f i e de n z y m ew 鹊m n c hl o w e rt h a nt t l a to fu n m o d i f i e de n z y m e 1 1 br e d u c t i o ni ns u r f a c c t e n s i o na n di n t e r r a c i a lt e n s i o ni sd u et 0t b ea d s o r p t i o no f - 2 1 1 z y m e 疵t w o p h a s ei n t e r f a c e a s e l d t z y m ea d s o r bt o 缸i n t c 】d j c c ，t h er e d u e t i o no fs u r f a c e i n t e r r a c i a lt e n s i o n 西v 鹤趾i n d i c a t i o n o f 伍ec h a r a c t e r i z ea d s o r p t i o m ml a n g m u i r - b l o d g t tm 舢o i a 博f i l mo fm o d i f i e de n z y l n e w 硒g a i n e db yu s co fl bt e c h n i q u ea n dt h es t l r f a c ep r e s s u r ew a sh i g h c rt h a nt h a to f u n m o d i f i e do n e ，s h o w nw m e l aw a sm u c h 如o e 蝴t 0 咖g 陀g a 把o ni n t e r f a c e t h ea f m f i g u r e o f m o d i f i e d e l l z y m es h o w e d ad i 丘b 啪f i o m t h a t o f u n m o d i 丘e d e n z y m e w ec a n f i n d 1 h ea l k y o nt h es u r f a c eo f 恤m o d i f i e de i l z y m e f m m 也ea b o v ee x p e r i m 瓤t a l 代s l m s ，i te o d db e 舢l u d e dt h a tt h el i p o l a s em o d i f i e d 嘶也f a t t y i dh a dg o o db e b 椭i no r g a n i c l v e n ta n d a ti n t e 触o f t w o - p h a s ec o m p a r i a g t 0u n m o d i f i e d l i p o l a s e k e yw o r d s ：】i p o l a s e ；e h e m i c a im o d i 丘c a 吐o n = e s t e r i f i c a t i o na e t m 够；i n t e r r a c i a lm t e n s i o n ； s l l r f a c cm t e t t s i o 珥l bf i l m s ；a f m 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：硷盘亟日期：刁年6 月弓日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 盆熟吟 导师签名： 日期：劬刁年月垆日 第一章绪论 1 1 前言 第一章绪论 酶是一种具有特殊催化功能的高效生物催化剂，它不仅催化生物体内化学反应，而且催化非体 内的化学反应，并且能够催化化学方法难以完成的反应。与化学催化剂相比，它虽具有底物专一性 强、催化效率高和反应条件温和等优点，但也存在对热、酸、碱、有机溶剂稳定性差等缺点，限制 了酶的工业应用。这促使科研工作者不断研究寻找新酶，或开发一些新方法来改变或提高酶的原有 催化性能，克服其缺点来满足各种不同条件对酶的需求。 目前已有一些成功的方法：如采用固定化技术、诱变技术或克隆技术对酶进行基因修饰和表 达，基因修饰能从根本上改变酶的结构，使之满足研究和应用的需要，其稳定性和重复性较好，但 投资大，成本高，研究周期长。目前化学方法是修饰酶的一种有效方法。酶化学修饰的定义：通过 对酶分子主链的。切割”、。剪接”和侧链基团的“化学修饰”对酶蛋白进行分子改造，以改变其 理化性质及生物活性。这种应用化学方法对酶分子施行种种。手术”的技术，称为酶分子的化学修 饰。从广义上说，凡涉及共价部分或部分共价键的形成或破坏的转变都可看作是酶的化学修饰。从 狭义上说，酶的化学修饰则是指在较温和的条件下，以可控制的方式便一种蛋白质同某些化学试剂 起特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生共价的化学改变。化学修饰技术起源于 1 9 5 0 年代，但当时主要用于蛋白质的结构分析，主要为小分子修饰。1 9 7 0 年代后，开始采用合成的 或天然的大分子来修饰蛋白质用以改变免疫原性，或者使酶能在有机溶帮中溶解以增加其稳定性并 保持活性等。与其它方法相比，化学修饰具有操作简便，方式灵活，周期短，见效快等优点，是一 种颇有实用价值和巨大潜力的生物工程技术。 酶化学修饰的目的在于人为她改变天然酶的一些性质，创造天然酶所不具备的某些优良特性甚 至创造出新的功能，来扩大酶的应用领域，促进生物技术的发展。就应用来讲，主要用于生物医学 和生物技术两个方面。在生物医学方面，其修饰可以降低免疫原性的免疫反应性，抑制免疫球蛋白e 的产生和抗衰性等。在生物技术领域，酶经化学修饰后可进行结构分析或用于提高原有催化功能或 增加新的功能。用修饰法研究酶分子的结构和催化机理已成为是生物化学领域的研究热点。事实说 明，只要选择合适的修饰剂，利用化学修饰法可快速、廉价地提高酶的稳定性，甚至合成出新的 酶。化学修饰被认为是台造新型生物催化荆的一种有效方法1 1 1 ，其发展前景是非常诱人的。在理论 及实用上均具有重要意义。 i 2 化学修饰方法分类 1 2 1 肽链氨基酸切除 胰岛素是最简单和最广泛应用的蛋白质之一，研究也最多。将化学修饰技术运用于胰岛素所得 胰岛素衍生物具有良好的医用应用前景和潜在的巨大价值。胰岛素是由a 和b 两条肽链构成，肽 链之间由两对二硫键相连接。万柱札嘲等研究去掉a 链n 端a l - 6 1 y 以及a 链n 端a l 七l y 被不同 构型氨基酸取代后的结构特征，还研究了b 链氨基端去二肽，羧基端去五肽胰岛素，这些为阐明胰 岛素分子与其受体结合相互作用的可能机理提供了重要信息。 1 2 2 定点突变和化学修饰技术相结合 由于定点突变只是用天然氨基酸进行取代，有一定的局限性，仍然无法满足有机合成的需要。 为此，人们便将定点突变所得酶进行化学修饰，得到一些新颖的酶制剂。先用定点突变技术在酶的 关键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰法修饰突变的氨基酸残基，即引入一个小分 子化合物得到一种化学修饰突变酶。最成功的例子是利用定点突变法在b a c i l l u si e n t u s 枯草杆菌蛋 江南大学硕士学位论文 白酶( s b i ) 的特定位点中引入半贱氨酸，然后用甲基磺酰硫醇( e c l 姗，垃l i o s u 蜘r 脚曲试剂进行硫代烷 基化，得到一系列新型的化学修饰突变枯草杆菌蛋白酶 1 2 3 蛋白质交联 一酶的人工交联可在一条多肽链内形成，是一种作用于分子间或分子内部的交联方式，能提高 酶的稳定性，防止酶在不良环境中失活。使用交联剂作为中间体，如戊二醛、聚乙二醇、双亚氨醅 等，能在分子同发生交联反应形成酶的小晶体，这些交联酶晶体在储藏和使用时的稳定性有了显著 提高，而且容易得到纯度更高的产品。1 9 9 2 年s t c l a i r 等首次证实，利用交联酶晶体( c l e c 嫩术， 使用戊二醛交联剂能够在保持较高的酶活性基础上，提高嗜热芽孢菌蛋白酶的稳定性j 。另外交联 酶晶体技术与酶活性中心修饰结合应用，出现了一种新型的半合成酶一化学突变酶例。这种酶不仅 具有交联酶的特性( 稳定性提高) ，而且也能改变催化活性。 1 2 4 小分子化学修饰 1 2 4 i 用于结构分析的小分子化学修饰 化学修饰在研究酶的结构与功能方面的应用最多。研究也比较细，是最简便的一种方法。通过 对构成酶催化活性中心氮基酸残基的定向修饰，揭示酶的话性中心构成和催化机理。不厨氮基酸常 用修饰剂归纳如表卜1 ： 表1 - 1 各种氨基酸的常用修饰剂 氨基酸名称常用修饰剂 赖氨酸 组氨酸 色氨酸 毗哆醛磷酸酯，三硝基苯磺酸，琥珀酸酐 焦碳酸二乙酯酸盐 n - 溴代琥珀酰亚胺，澳乙酸，碘乙酸 谷氨酸天冬氨酸 卜乙基一( 3 一二甲氪基丙基) 羰二亚胺盐酸盐 精氨酸 丝氨酸苏氨酸 蛋氨酸 酪氨酸 半光氨酸 丁二酮，荤乙二醛，苯甲酰甲醛 苯甲酰磺酰氟 氯氨_ t 卜乙酰咪唑。对硝基苯磺酰氟 对氯汞苯甲酸 1 2 4 2 用于改变酶催化功能的小分子化学修饰 酶的化学修饰是通过化学修饰剂与酶分子侧链上的特定功能基团发生化学反应而实现的。在 2 0 种构成蛋白质的常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能进行化学修饰。利 用小分子化合物对酶的活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰，对酶的表面进行改造： 改善酶在有机相中的分散性；提高酶的表面活性；使酶的表面产生新的物理、化学、机械性能及新 功能；改善酶与其它物质的相容性 2 第一章绪论 在酶的表面有许多游离的巯基、羧基、氨基、羟基等官能团，可与一些小分子化合物如醛、 酮、羧酸等发生烷基化、酰化，醚纯等反应，如图l l 所示。酶分子表面游离的氨基( 主要是赖 氨酸的一氨基) 具有较高的亲核反应活性，常被选为修饰基团。氨基的烷基化、利用氰酸盐使氨 基甲氨酰化是重要的赖氨酸修饰方法。对于羧基基团，目前应用最普遍的标准方法是用水溶性的碳 酰二亚胺类修饰蛋白质分子的羧基基团，产物一般是酯类或酰胺类，它在比较温和的条件下就可以 进行，但由于羧基在水溶液中的化学性质使得这类修饰方法很有限。由于巯基具有很强的亲核性，u 因此巯基基团一般是蛋白质分子中最容易发生反应的侧链基团。烷基化试剂和其它一些卤代酸和卤 代酰氨是重要的巯基修饰试剂。但是巯基在酶分子中含量较少。随着定位诱变的迅速发展，半胱氨 酸的侧链基团的化学修饰有被取代的趋势。另外还有咪唑基、酚羟基和脂肪族羟基 9 1 和二硫键f l q 等的化学修饰。这些修饰反应的一个重要特征是反应条件要温和，这是防止蛋白质分子变性的一个 必要条件。p h 值是影响化学修饰反应的最重要条件，另外还要考虑温度、溶剂的影响。当前已被广 泛应用的小分子化合物有氨基葡萄糖、乙酸酐、硬脂酸，邻苯二酸酐等。下图为蛋白质的侧链化学 修饰反应类型。 氨基的修饰 羧基的修饰 酰化反应 巯基的修饰 p r o t e i n - s h 烷化反应 o p r o t e i n o 吁王墨r+ hx p r o t e i n 套珊r + h x o p r o t e i n - c o o r + h x p r o t e i n - c o o r + h 2 0 还原反应凹 3 o p r o t e i n s c r + h x p r o t e i n - s - r + h x p r o t e i n - s - 江南大学硕士学位论文 1 2 5 单功能聚合物化学修饰 可溶性大分子，如聚乙二醇( p e g ) 、聚丙烯酸、聚氨基酸、葡聚糖、肝素等通过共价键连接于 酶分子表面，形成覆盖层，与酶结合成具有特异功能的单位或聚合体。两性分子聚乙二醇( p e g ) 是 最常用的化学修饰剂i l ”。它不仅能提高酶在有机溶剂中的稳定性和溶解性，而且也能降低一些治疗 用多肽类药物的抗原性”日。最近的研究发现，非离子型两性聚氧乙烯十二烷基醚( 吨g ) 是一种比 p e g 更好的修饰剂。用m p e g 修饰的过氧化氢酶在有机溶剂中的溶解性提高，而且在水溶液中 m p e g 修饰的酶比p e g 修饰的酶活力更高【l 。胰蛋白酶经m p e g 修饰后，其热稳定性得到了显著 提高，这是由于修饰降低了胰蛋白酶的自溶和热变性速率 1 4 - i s 】。 下面图示为( r e ) p e g 常见的活化途径i l ”j ： 1 2 6 辅因子引入 酶在低温和中性介质中具有很高的底物专一性和催化活性。为了拓宽酶催化的底物研制出了一 些人工酶，其中最主要的方法是在己知蛋白或酶的特定位点引入一个辅园子或新的功能基团，以合 成新的蛋白或酶，如使c u ( p h e n ) ”配合物与脂肪细胞类脂键合蛋白( a d 取 c y t el i p i db j l l d i n gp r o m i n ， a l l p ) 共价结合，生成半合成金属酶a l b p p h e n c “) 删。该酶可对映选择性水解多肽，其对映 体过量值达8 6 ，同时其水解芳香族酰胺化合物的活性也明显提高。很多酶都含有辅酶或辅基活性 基团。天然酶中这些基团的种类有限，因而限制了酶的功能。如果能利用化学方法在这些辅因子中 接上一些其它基团，再将修饰后的辅因子取代天然酶的原有辅因子，便可制造出多种多样的新型 酶。现己将烷萋、聚阴离子、金属配合物、电子给体或受体、光致变色基团、肽等接到卧啉环上， 以修饰血红素蛋白( 肌红蛋白、血红蛋白和细胞色素b 5 6 2 ) ；该方法还成功用于葡萄糖氧化酶的修饰 p 。h a y s h i 等将卟啉环的丙酸基端置换成含8 个羧基的化合物，并用其取代天然肌红蛋白中的铁卟 4 第一章绪论 啉辅基，修饰后的肌红蛋白对邻苯二酚、对苯二酚及邻甲氧基苯酚的氧化速率比天然肌红蛋白高 1 4 - 3 2 倍阎 1 2 7 脂肪酶结构特征及化学修饰简介 脂肪酶( 1 i p a s e ) 也称酰基甘油水解酶( a e y l g l y c e r o lh y d r o l a s e s ) ，广泛存在于原核生物和真核生物 中。脂肪酶的天然底物是甘油酯类，然而研究表明，脂肪酶除了能够催化甘油酯类化合物的水解和 合成之外，还可以用于催化酯合成和酯交换反应印例、生物表面活性剂的合成，多肽合成、聚合 物的合成和药物的合成等，尤其是利用某些脂肪酶的立体专一性，催化旋光异构体的拆分和手性药 物的合成成为酶工程领域研究的新热点。因而脂肪酶及其改性制剂在食品与营养、日用化学工业、 油脂化学品工业、造纸工业、洗涤和生物表面活性剂的合成、以及药物合成等许多领域得到广泛应 用。 l 2 7 1 脂肪酶结构特征 研究表明：来源不同的脂肪酶，其氨基酸组成数目从2 7 0 - 6 4 1 不等，其分子量为2 90 0 0 - 1 0 0 0 0 0 。迄今为止，人们已经对多种脂肪酶进行克隆和表达，并利用x 衍射等手段和定向修饰等技术测 定了酶的氨基酸组成、晶体结构、等电点等参数，确定了组成脂肪酶活性中心的三元组结构。研究 表明驯，尽管不同来源的脂肪酶具有不同的氨基酸组成( 残基数目、分子量、三维空间结构等) ，但 由于生物的同源性和进化过程的保守性，其催化中心拥有相似或相同的特征区h i s - x - y - g l y - z s e x - w - g l y 或y l y - 碰s - s * w 由l yt w 、x 、y 、z 指非特异性氨基酸) 。绝大多数脂肪酶的活性中心都 由s e t h i s 参与组成，h i s ，s e t 与另一种氨基酸残基一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组。研究 证实，脂肪酶是一种。丝氨酸水解酶”。构成脂肪酶活性中心的三元组之间，丝氨酸残基通过氢键 与组氨酸相连，另一种氨基酸( 谷氨酸或天冬氨酸) 也通过羧基形成的氢键与组氨酸相连。在反应过 程中，三者通过与底物形成四面体中间体复合物完成催化过程。 1 2 7 2 脂肪酶的化学修饰 1 2 7 2 1 小分子修饰 脂肪酶表面暴露有许多游离的羟基、酚羟基、巯基、羧基、氨基等官能团，可以与一些小分子 化合物如醛、酮、羧酸等发生烷基化、酰化、醚化等反应尤其是赖氨酸末端的一唧2 具有较强的 亲核性，能够与许多亲电试剂在温和的条件下发生反应，这对在修饰过程中保持酶的活性、减少酶 活损失是十分有利的。因此，阿2 成为脂肪酶化学修饰的首选官能团。1 9 6 8 年m 醯n s 和f e e n c yp 咒 首先报道了用乙醛和丙酮借助于与氨基形成s c h i f 碱对蛋白质进行了修饰。k a i m a l 和s a r o j a 【蚓采 用类似的方法，用丁醛、异丁醛和丙酮对猪胰脂酶进行了化学修饰，结果发现修饰后脂肪酶的v m 提高了5 0 ，催化水解和酗化的活性都有所提高，而酶原有1 ，3 专一性未受影响。b a s i l 等p 7 】利用 氨基酯的盐酸盐使c r l 发生脒化反应。引人了疏水的长链烷基，大大改善了脂肪酶在有机溶剂中的 溶解度和热稳定性，催化酯化反应的活性有很大提高，但水解活性有所下降。t s u 口k i 等嘲在 r d l ( r h i z o p u sd e l e m a ru p a ) 上引入双十二烷基葡萄糖基谷氨酸而得到的修饰脂肪酶，除热稳定性 有所提高外，对长碳链甘三酯的催化专一性增加，但与游离酶相比，易受钙离子的抑制。1 9 9 3 年， m u r a k a m i 1 利用对一二甲硫基苯酚酯于温和条件下在酶上引入了脂肪酸，这种脂肪酸修饰的脂肪 酶在正己烷等有机溶剂中催化酯化反应的能力优于天然酶，而且改变了天然酶对不同底物的亲和 力，这种改变与引入的脂肪酸相关。 经过活化的脂肪酸可以在温和的条件下与赖氨酸残基的e n h 2 发生酰化反应，从而在脂肪酶侧 链偶联上不同链长的脂肪酸，进而改变酶的理化性质和催化活性。t a t s u om a r u y a m a 【柚l 等人曾用硬 脂酸对脂肪酶进行了修饰，修饰后酯化活性提高。如图i - 3 所示，脂肪酸的主要活化方法有3 种 ”j 制备成酰氯的形式、制成琥珀酰亚胺的形式、制成对一二甲硫苯酚酯的形式。酰氯制备方法 简单但反应剧烈、修饰过程中易造成酶的失活；对二甲硫酚酯反应条件温和，但成本较高，故琥珀 酰亚胺是常用的修饰方法。下面图式为脂肪酸常用的活化方法 江南大学硕士学位论文 r c o o 跹誓t k 俯p 本论文中用硬脂酸对l i p o l a s e 脂肪酶进行化学修饰，采用卜羟基琥珀酰亚胺活化法，但省略了 生成酰氯的中间过程，反应历程如下式所示。 一& 抄 a d hi + 印 近年来用于修饰脂肪酶的长链脂肪烃类修饰剂有辛醇蚴、十二醛f 4 3 l 、双十二烷基葡萄基谷 氨酸0 7 i 、氢基酯的盐酸盐p 埘等，修饰后发现修饰酶的热稳定性提高，在有机溶剂中的溶解性、 稳定性、酯化活性等都不同程度的有所提高，有的催化专一性提高。各反应式如图式所示。 t r e s y l - a c f i v a t e d c h 3 ( c h 2 ) 6 c h 2 0 h - - - - - - - - p r o t e i n - n h - c h 2 ( c h 2 ) 6 c h 3 c h 3 ( c h 2 ) 1l o c o c n h c o 斗c h 2 0 h o , ho , h 墅塑兰坌空哩 c h 3 ( c h 2 ) i i o c o ) o h 0 h c c h 3 h 3 ( c h z ) i i o c o ( c h g , i o c o 二c h 3 6 h 第一章绪论 宫 r c h r - c h = n - p r o t e i n 至堡 ，r c h 2 n h n 口t c i n 一nhh。ci+一一。+ch30hoch 3 、n h p r 柏n 1 2 7 2 2p 耐e 修饰 聚乙二醇或甲基聚乙二酵( m ) p e o 有一系列不同分子量分布的产品( 常用的分子量分布在5o o o - 1 00 0 0 之问) ，无毒副作用，无免疫原性，具有良好的生物相容性。p e g 必须经活化才能用于脂肪酶 的化学修饰。氰尿酰氯是一种常用的活化剂，价廉易得但毒性较大；羟化琥珀酰亚胺、卜羧基咪 唑、取代苯基氯甲酸酚酯等都是经常使用的p e g 活化剂。l n a d a 4 4 等、b a i l l a r g c o n f f g i s o n n e t l 4 s 采用三 聚氯氰活化技术，将p e g 共价偶联到不同的脂肪酶制各出具有双亲的性质的改性脂肪酶，修饰酶在 有机溶剂中的溶解度和催化酯化的活性都大大提高。 1 2 7 2 3 多醣及其它大分子修饰 右旋糖苷、肝索 4 7 j 、葡聚糖等经过活化可用于脂肪酶的修饰。脱酰壳聚耱也可以借助于戊二醛 偶联到酶分子上。其它合成高分子如聚马来酸酐明、p a a 、p v a 等也用来修饰脂肪酶。y h i m o t o 等将聚乙二醇乙烯基甲基二醚与马来酸酐共聚得到一种新的修饰剂聚口e g 马来酸酐) ，该聚合物不 需活化可直接用于酶的修饰。糖醑是另外一种酶化学修饰剂。国外，日本y o s h i o 4 9 1 等研究的糖酯 化合物修饰脂肪酶的方法，操作简单，酶活力也很高。国内学者潘冰峰，李祖义p o 利用蔗糖酯和 槐耱酯对脂肪酶进行修饰，发现脂肪酶经糖酯修饰后酶活增大 1 3 酶化学修饰的应用 1 3 1 在酶结构与功能研究方面的应用 化学修饰在研究酶的结构与功能方面的应用最多，研究也比较细，是最简便的一种方法。特别 是蛋白质的可逆化学修饰，在这方面能提供大量的信息。修饰蛋白质氨基的过程中，可以向蛋白质 引入正电荷或负电荷，这样就改交了蛋白质的表面电荷，由此而产生的静电效应常引起分子膨胀， 这有利于蛋白质和水的相互作用。因此，一些寡聚体蛋白质即选择性地被解离成可溶性亚基，它们 在水中很少发生聚集，并保持其生物活性，从而有利于这些蛋白质分子量的精确测定。另外，化学 修饰也常用于氨基酸顺序分析中。由于胰酶对精氨酸和蔌氨酸具有高度特异性，故常用此酶水解蛋 白质，以制备肽碎片。为防止精氨酸和赖氨酸相互干扰的问题，可利用选择性化学修饰剂修饰赖氨 酸和精氨酸，使水解局限在其中一个残基的肽键上。 i 3 2 在医药方面的应用 随着蛋白质化学和分子生物学的迅速发展，用于各种疾病治疗的蛋白质( 酶) 类药物的研制与 应用已成为生物医药产业发展的热点。然而外源蛋白质属于天然抗原，注射到体内会受到各种蛋白 质的攻击而失去活性；会引发抗体的产生；会因为半衰期过短，无法充分发挥其生物功能。目前主 7 江南大学硕士学位论文 要采用化学修饰、蛋白质交联等方式来改变目的蛋白质的性质，以降低药用蛋白的抗原性，延长半 衰期，确保生物活性的充分发挥。例如，天冬酰胺酶是治疗白血病的有效药物，但它往往带有抗原 性，若不除去，再度使用可能引起免疫休克。因此，有人用聚乙二醇修饰此酶的两个氨基，消除了 抗原性。吴梧桐等人利用高碘酸氧化法活化的右旋糖苷对大肠杆菌l - 天门冬酰胺酶进行化学修 饰，使酶抗胰蛋白酶水解的能力明显提高，抗原性显著减弱【5 l 】。 i 3 3 在工业方面的应用 目前，生物催化技术在工业上得到广泛应用，大大提高了产量，降低成本，而且减少了对环境 的污染。但工业生产要求高温、高压等条件，天然酶极易失活，而经过修饰的酶则完全克服了这些 缺点，特别是有机相酶催化技术，自上世纪八十年代开创以来，已获得了巨大的发展，广泛应用于 食品、医药、化妆品等行业。例如：b a s i l 幽1 等用氨基酯的盐酸盐对脂肪酶进行化学修饰，发现修 饰酶在有机溶剂中的溶解度、热稳定性和催化酯化反应活性都有很大提高。t a 扭u om a r u y a m a 一1 等 人用硬脂酸修饰了脂肪酶，发现虽然水解活性下降，但酯化活性明显提高。 1 4 酶化学修饰的前景与展望 近年来，许多科研工作者致力于酶的化学修饰的研究，并逐渐成为国际上前沿研究的一个热 点。酶的化学修饰不仅在研究酶活性中心的结构，揭示酶结构与其生物学功能之间的关系方面起着 重要作用。而且在提高酶的稳定性、延长半衰期、提高其催化活性、强化或改变其催化的专一性、 甚至刨造新的功能。只要选择合适的化学修饰剂及修饰方法，就可以快速、廉价地提高酶的稳定 性，甚至合成出新的酶。化学修饰为生物医药和生物技术领域的应用提供一条新颖而有效的途径， 其发展前景是非常诱人的，不仅在理论上，而且在实际上均有重要意义，并创造巨大的效益。 1 5 课题立题依据 酶是一种具有特殊催化功能的高效生物催化剂，它不仅催化生物体内化学反应，而且催化非体 内的化学发应。酶能催化的反应包括许多有机反应。而大多数酶为水溶性酶，不溶于有机相，而 几乎所有的有机反应是在有机相中进行的，在这种酶有机溶剂体系，如两相或悬浮体系为不均相 体系，酶只能有限的分散其中，这就限制了酶与底物的接触，直接影响了酶的催化效率和反应速 率。 化学修饰是提高和改变酶催化性能莳有效方法。因此为了提高反应速率，充分发挥酶的催化效 率，可以在水溶性的酶分子上引入长链疏水烷基，类似表面活性剂的结构，以提高其在有机溶剂及 两相界面中的溶解性及稳定性，从而达到上述目的。蛋白质分子表面游离氨基较多并且具有较高的 反应活性，因此氨基常被选为修饰基团。从文献来看，就化学修饰改善酶催化功能方面而言，前入 主要研究了修饰酶在有机相( 均相) 中的稳定性，催化活性等问题，而涉及非均相界面催化及界面 吸附性能的研究甚少。本课题主要是用硬脂酸对l i p o l a s e 脂肪酶表面的氨基进行了化学修饰，从界 面化学的角度对修饰酶的界面化学性质进行了研究，重点考察了修饰酶降低表界面张力的能力及 非均相界面催化活性。 s 第二章硬脂酸的活化及结构分析 第二章硬脂酸的活化及结构分析 化学修饰的整个过程主要分两步：第一步是修饰剂的活化反应，活化后降低了反应活化能使反 应更易向生成生成物的方向进行；第二步是活化产物与酶分子的偶联反应。由于酶的热稳定性差、 易失活，为了最大程度的保留酶活性，有酶参与的反应必须在低温、弱碱等温和环境下进行。本文 用n - 羟基琥珀酰亚胺活化法对硬脂酸进行活化，经过活化的硬脂酸可以在温和的条件下与酶分子表 面的氨基发生酰化反应，进而改变酶的理化性质和催化活性，并对硬脂酸琥珀酰亚胺酯的结构进行 了定性分析。 2 1 实验材料和方法 2 1 1 实验药品 药品名称规格 硬脂酸分析纯 n _ 羟基琥珀酰亚胺生化试剂 二环己基碳酰亚胺分析纯 n n - 二甲基甲酰胺分析纯 无水乙醇分析纯 无水乙醚分析纯 去离子水 2 1 2 实验仪器和设备 仪器和设备名称 电子天平 磁力搅拌器 旋转蒸发器 红外光谱仪 质谱仪p l a t f o r m 数字熔点仪 真空干燥箱 2 1 3 反应方程式 规格型号 f a l 6 0 4 匝- 9 0 2 r 一2 0 l f 。 2 0 0 0 刁4 0 0 0 w r s 一1 a d 髓6 0 3 0 a 2 1 4 实验方法 生产厂家 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 江南大学饮品有限公司 生产厂家 上海精科实业有限公司 上海浦江分析仪器厂 上海申顺科技有限公司 加拿大a b b 公司 美国w a t e r s 公司 上海精密科学仪器公司物理光学仪器厂 上海一恒科学仪器有限公司 丽3 0 c , 赢8 h & ； 唧 j 商丽i 吗撕u 埋。 入y。 盼 将硬脂酸溶入一定量的n , n - 二甲基甲酰胺中，并加入一定比例的n 一羟基琥珀酰亚胺和二环己 基碳酰亚胺( 脱水缩合剂) ，反应在锥形瓶中进行。三者摩尔比为1 ：2 2 5 ：2 2 5 【5 ”。反应物在密封 条件下磁力搅拌反应8 小时，反应温度为3 0 c 。 2 1 5 分离方法 采用多次萃取法分离产品。反应体系中各物质的物化性质如表2 - l 所示。 表2 - i 所用药品的物化性能 名称 物化性能 硬脂酸 删琥珀酰亚胺 二环己基碳二亚胺 白色片状，溶于醇、苯、醚、丙酮等溶剂 白色结晶，易吸湿，溶于水，有刺激性 白色结晶，与水反应，溶于苯、乙醇等有机溶剂 n , n - 二甲基甲酰胺 与水、乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂混溶 反应过程中卜羟基琥珀酰亚胺过量，二环己基碳酰亚胺为有机合成中的脱水缩含荆，与水结 合以沉淀的形式析出，溶于乙醇。反应结束后，首先过滤除去沉淀( 二环己基碳酰亚胺水合物) ， 滤液萃取分离，首先滤液中加入去离子水( 先用弱碱性水溶液，也许有未反应的硬脂酸，然后用去 离子水) 和乙醚充分摇匀，静置分层，乙醚层萃取多次以除净过量的n _ 羟基琥珀酰亚胺。乙醚层 旋转蒸发得到白色固体，然后用无水乙醇冲洗( 保证除净二环己基碳酰亚胺) 数次即得到产品产 品经真空干燥后。在干燥避光处储存备用 2 i 6 结构分析方法 硬脂酸琥珀酰亚胺酯的结构分析包括熔点测定、红外光谱分析( k b r 压片法) 和质谱鉴定。 熔点测定：取少量固体粉末装于已封好口的熔点管中约2 3m ，装紧后放于数字熔点测定仪中 检测。红外光谱：采用k b r 压片法测定。质谱鉴定：采用电喷雾质谱( e s i - m s ) 方法对硬脂酸琥珀 酰亚胺酯进行鉴定，溶剂为甲醇，样品浓度 m g m 1 2 2 实验结果与分析 2 2 1 熔点分析 测得所制备并经分离提纯的硬脂酸琥珀酰亚胺酯的熔点为：8 0 一8 2 8 ，与文献值8 0 一8 2 一致。 2 2 2 红外光谱分析 硬脂酸和所制各硬脂酸琥珀酰亚胺酯的红外谱图分别见附图l 和附图2 。 在附图1 硬脂酸的红外谱图中，2 9 2 0 c m 1 ，2 8 5 8 “处为甲基和亚甲基的伸缩振动，1 4 5 7c m 1 周围处的峰为甲基和亚甲基的弯曲振动；1 7 0 0c m - 处的单峰为羰基特征吸收峰：1 2 9 8c m 1 处为c o 键吸收峰；3 4 0 0c 1 4 处宽峰为羟基伸缩振动，9 4 5c m 处为羟基的变形振动；7 2 4c m - 1 处出现明 显吸收峰，表示分子中有多于四个碳的直链烷基存在。 l o 第二章碗脂酸的活亿及结构分析 在附图2 硬脂酸琥珀酰亚胺酯的红外谱图中，2 9 2 2g i l l 1 ，2 8 5 8c m 处为甲基和亚甲基吸收峰， 7 2 4 “处也有吸收峰。同附图i 的不同之处在于：在1 7 3 2c r a 。附近明显有多条吸收峰，这是因 为在硬脂酸琥珀酰亚胺酯中有三个羰基，与n 相连的两个羰基产生两个谱带，是三个羰基共同作用 的结果；1 0 0 0 - 1 3 0 0c m 1 处的峰为c - o ，n o 的伸缩振动，1 3 7 3g l n 1 处的峰为c - n 的伸缩振动，6 5 6 c m 一，8 7 0g i l l 1 处的蜂为环内亚甲基的变形振动；在3 3 3 0c m 1 和3 4 0 0 锄附近有弱吸收，可能是 由于产品中含有少量的n 羟基琥珀酰亚胺。 2 2 3 质谱分析 采用电喷