（植物学专业论文）盐地碱蓬45多巴双加氧酶基因的克隆和功能分析.pdf

山东师范大学硕士学位论文 盐地碱蓬4 ，5 一多巴双加氧酶基因的克隆和功能分析 摘要 盐地碱蓬是一种叶肉质化的稀盐盐生植物。盐地碱蓬在滨海的潮间带或者部 分涝洼积水地带在整个生长期植株地上部分皆为紫红色，而在地势较高或者距离 海边较远的地方植株则呈现绿色。作为一种真盐生植物，盐地碱蓬的耐盐机理已 得到了比较广泛的研究。且已证明盐地碱蓬中的红色素为甜菜红素。但是，盐地 碱蓬中甜菜红素积累的生物学意义至今尚未见报道。目前甜菜素合成的分子机理 和相关基因的表达调控也不明晰。甜菜素合成途径相关酶的功能定位、特性分析、 基因克隆以及相关基因表达调控的研究也是需要深入的领域。本实验克隆了合成 甜菜红素的关键酶之叫，5 多巴双加氧酶的基因和启动子，研究其表达特点， 为进一步研究甜菜红素在盐生植物进化和生态适应等方面的作用机理奠定了基 础。 研究结果如下： 1 盐地碱蓬d 基因克隆及序列分析 根据g e n e b 锄k 中已知的d 0 蜊基因的c d n a 和蛋白序列寻找保守区以合 成简并引物，以盐地碱蓬总r n a 为模板，通过r t - p c r 扩增获得5 0 0b p 的保守 片段；b l a s t 分析表明该片段与其它植物d d 删同源性较高，初步确定为盐地 碱蓬d a 基因序列：根据该序列设计用于3 r a c e 和5 求a c e 的基因特异性 引物，分别扩增得到3 5 0b p 的3 末端和2 5 0b p 的5 末端；将三段序列进行拼接， 获得盐地碱蓬基因d d 蜊的全长，进而设计引物扩增获得其全长。d 0 蜊c d n a 序列全长1 0 3 0b p ，包括7 1b p 的5 非编码区和1 4 6b p 的3 非编码区。开放阅 读框为8 1 3b p ，编码2 7 1 个氨基酸残基，分子量约3 0 4 k d a 。b u 峪t 分析表明盐 地碱蓬4 ，5 一多巴双加氧酶与来源于其他物种的4 ，5 一多巴双加氧酶具有较高的序 列相似性，与眈纪压弘廊在氨基酸水平上具有8 0 的序列一致性。 2 植物表达载体p r o k ：夙p d 刃的构建 经劢口i 和肋朋hi 酶切的p m d l 8 t ：风d0 1 d 4 和p r o k 载体通过t 4d n a 连接酶连接，连接产物转经p c r 以及酶切鉴定确定为重组质粒，且外源片段方 向正确，命名为p r o k ：& d d d 彳。 3 转基因拟南芥的筛选 p r o k ：& d d d 4 转化农杆菌g v 3 1 0 l ，阳性克隆侵染拟南芥。在5 0m g l 卡 那霉素的筛选压下，获得约1 0 0 株抗性苗。转化株自交以获得纯合的转基因株系。 4 蛐d 删启动子的分离和功能预测 使用t a 几p c r 法首次成功地从盐地碱蓬基因组中克隆了4 ，5 多巴双加氧酶 山东师范大学硕士学位论文 基因。妨h 的启动子片段。使用p l a c e 数据库对5 0 0b p 的舳启动子片 段进行顺式作用元件分析，结果表明启动子序列中除了t 觚a m o t i f 、c a a t m 嘶f 等典型的真核生物顺式调控元件外，还含有其他重要的顺式调控元件如光反应元 件：1 0 p e h 、旧s b d ，ib o x ；低温响应元件l t r ；脱水应答元件 m y c c o n s e n s u s a t 等。 5 植物表达载体p b l l 2 1 ：瞧妒d 删廿的构建 胁以d m 和肋m hi 双酶切p b l l 2 1 质粒，去掉约o 8 k b 的3 5 s 启动子片段， 回收大片段，并与同样经胁以m 和肋m hi 双酶切的启动子片段连接， 构建成与报告基因g u s 融合的植物表达载体p b l l 2 1 ：。如- p 。 6 孓妒d 删启动子的g u s 活性检测 将植物表达载体p b l l 2 1 ：舳4 中转入根癌农杆菌e h a l 0 5 ，阳性克隆转 化烟草，g 1 粥组织化学检测结果表明，盐地碱蓬& 咖d 删启动子片段能够驱动 报告基因g u s 在烟草叶片中表达，证明克隆得到的如d 蹦启动子片段具有启 动子活性。 关键词：盐地碱蓬；甜菜红素；舳0 1 踟，舳h 启动子；克隆；功能分 析；g u s 中图分类号：q 9 4 5 山东师范大学硕士学位论文 c l o n i n ga n d f i u n c t i o n a la n a l y s i so ft h eg e n ee n c o d i n g 4 ，5 一d o p ad i o x y g e n a s ei n 肌口p 勋s 口如口l a b s t r a c t 勋口日出册西口l i sal e a fs u c c u l e n te 1 1 1 1 a 1 叩t 1 ) 他1 ks h o o to f & s 口z s | 口p l a n ti s 心d - v i o l e tt 1 1 r o u g h o u t 也ew h o l e 伊o w mp e r i o di n 血ei n t e n i d a lz o n e ，b u tg r e e n0 n l l i 础a n da n dl 粗df 缸蠡0 mt 1 1 es e 弱i d e a sah a l o p h y t c ，p h y s i o l o 舀c a l 觚dm o l e c l l l 盯 r e s p o 璐e so f & j 口厶口t 0s a l i l l i t ys 仃e s sh a v eb e 锄e x t e l l s i v e l ys m 击e d a n di ti sp r o v e d 也a t 也e 魂p i 舯t sa c c 啦u l a t e di l l & s 口跆口a r eb e t a c y a n i 璐h o w c v e r ，n o m i n gi s h 伽嘎a b o u t 也eb i o l o 百c a l 劬c t i o 璐o f 吐l er e dp i g m e l l t si n & s 口加t h em o l e c u l a r m e c h a n j s ma n dm er e g l l l 撕o no fr e l 钾a n tg e n e si n _ v o l 讹gb e t a c y 砌ns 皿h e s i si ns j 口豇口h a v en o tb e 朗e l u c i d a t e ds 0 矗盯h l 吐l i sw o 血廿1 ec l o n i n go f 吐屺g e i l ed c o 幽唱f o r 廿1 e4 ，5 d o p ad i o x y g e l l 嬲e 丘0 m & s 口厶口a n di t sp m r n o t e rw e r ec 1 0 n e d ， a n dm e i r p 曲a r y 劬c t i o 粥w e r ed 舳e d t h er e s u n s 骶s h o w e d 弱f o l l o w s ： 1 c d n ac l o n i n ga n ds e q u e n c ea a l y z i n go f4 ，孓d o 誓ad i o x y g e n a s ei n & s 口z 跗 b a s e do ns e q u e n c eh o m o l 0 百e st 0t t l ed ( 您疆g e n e s 自o mo t l l e rp 1 觚饵w e 憾e d 叠e v e r s e 劬n s c 邱t 嬲er 1 - p c r 卸叩l i 矗c a t i o n 觚d5 一a n d3 一r a c e 锄1 p l i 丘c 撕0 nt 0 o b t a i n 日璩血n - l e n g ：t h 仃a n s c 邱ts e q u e i l c e so f 舳d 晚4 。t h ef i l u 1 e n g 吐lc d n ao f & d 爿w 嬲1 0 3 0b p 丽t h 雒8 1 3b p0 p 饥r e a d i n g 妇n e ( o r 日，、h i c he n c o d e da 2 7l a n l i n 0 - a c i dp o l y p 印t i d ew i mm ep r e d i c t e dm 0 1 e c u l a rm 弱so f3 0 铖d a b l 怂t s e a r c hr e s u l t ss h o w e dm a t 日1 es e q u 锄c eo fs s d o d aw 勰8 0 s i 】血1 a rt 0t h a to f 且醣口 l 和，话 2 c o n s t l i c t i o no fp i 柚te x p n s s i o v e c t o rp r o i ：弧d 删 b yl l s i i l g d n ar e c o m b i n a n t t e c l l i l o l o g 弘 t h e b i n a d ，e 】【p r e s s i o n v c c t o r r o k 卫：s 囝g i 叫，蛐f l l s e dn 地o p e nr e a d i n g 丘a m e ( o r f ) o f 劬么，w 罄 c o n s h l | c t e d 3 o b t a i n i n go ft r a n s g e i c 彳，坦6 五死l ；，翻函以i 口z 趾一口p l a n t s t b e 廿a 璐f o n n a t i o no f 么，口6 如筘括历口抛厅口w 勰m e d i a t e db y4 9 加6 口口仃胁聊 g v 3 1 0 1 s o m e 们i l s g e n i c 彳m 6 触猡括h a v eb e 0 b t a i l l e dn e rs c r c 饥e db y a p p l i c a 缸o n5 0m g lk a n t 0m em e d i u m 4 c l o n i n ga n ds e q u e n c ea n a l y z i n go f 蛐0 l 删p r o m o t e r t h e6 0 0b pp r o m o t e rr e 百o no f - 蚰啊g e n e 舶m & 船加w 勰锄p l i f i e db y t _ 6 l i l p c rt c c h n o l o g y p r o m o t e rs e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dm a tm ec l o n e d 的粤n e m i 山东师范大学硕士学位论文 c o n t a i n sl o t so f 灯r i c h - r e 玺。璐，t 觚a i b o x ，c 削尽b 0 x ，w k c ha r e 也ec h a r a c t 嘶s t i c r e 百0 1 1 si i la l lp r o m o t e r s m e 锄w 1 1 i l e ，m e r e a r es o m eo t l l e rr e g l l l a t i o nr e 百o n si i lm i s p r o m o t e rs e q 嘲l c es u c _ h 弱n g h t r e 矾a t c dr e 西o n 5 c o n s t u c t i o no fp l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp b l l2 1 ：舳0 蜊p p l a n t 仃a 1 1 s f o n i l a t i o nv e c t o rp b l l21w 弱d i g e s t e dc o m p l e t e l y 丽血胁，z d i 缸d 刀删hi t h eb i g g e r 触舯锄tw 硒i s o l a t e d 勰dl i g a t e dt 0 也e 舳删p r o m o t e r 脚e n tw k c hh a da l s ob e e nc l e a v e dw i 也胁玎d a n db 口聊hit og c n e r a t ep l 锄t e x p r e s s i o nv e c t o rn 锄e dp b i l 2 1 ：如曙中h 抽。血gm e 血s i o ng e n c 舳o ! 踟 p r o m o t o r ：g u s 6 h i s t o c h e i l l i c a l l yg u sa c t i 砚锣o ft h e 鼬d d 旦mp r o m o t e r 皿l e 仃a 璐f o m a l i o no ft o b a c c op l a i 】峪w 勰m e d i a t e db y 细d 6 口劭已r 觑脚e h a l 0 5 a n dl l i s t o c h e i i l i c a l l y ( 耵sa c t i 访t yd e t e 以n gr e s u l t sd 锄o n s 臼僦e d 也a tt l l e 舳0 1 删 p r o m o t e r 丘a 鲫e n t w 勰a c t i v et 0 缸v em ee x p r e s s i o no fm eg u s g e 芏】呤 1 沁yw o r d s ：鼬口p 如阳厶口三；b e t a c y a n i n ；鲫d d ；舳hp r o m o t e r ；c l o n i l l g ； f h = 【l c t i o n a l 孤a l y s i s ；g u s i v 山东师范大学硕士学位论文 英文缩写符号及中英对照表 英文缩写中文全称英文全称 啜p 三磷酸腺苷 缸i a l o s i m 倒批m s p h a t e c 缸江v花椰菜花叶病毒c 砌i n o w e r 皿日s a i c 啊r u s c d n a互补d n a c 伽叩l 曲翮1 ：t a | yd n a d e p c焦碳酸二乙脂 d i e 吐l y lp 弘0 c a r l ) a 绝 砌h 2 0 重蒸水 d i s d u e d l a n td e i o n i z e dw a t e r m 盯： p 脱氧核苷三磷酸d e o x y m 伽c l e 媚i d c 缸讪o s p l l a t e e b 溴化乙锭e t h y l 朗e d i 舡n i n ob i 删d e e d t a 乙二胺四乙酸 e 吐l y l e n e d i a m 如e t e 电陋a c e 6 ca c i d g u s b 葡萄糖醛酸苷酶b g l u a l 枷i d a s e k a n卡那霉素 妇咙m l y c i n 晒 千碱基虹l o b a 鼬 m s m s 培养基 h 伯捌；h i g ea n ds k 0 0 9 ( m & s ) l e 池m n a a 萘乙酸 l p h 吐l a l e n ea c c t i c i d n 一 新霉素磷酸转移酶 n e o m y c i i lp h o s p h ( 糨f l e r a - p ：a g e聚丙烯酰胺凝胶电泳 p 奶倍c r y l a m i d eg e l se l e c t r o p l l o 托s i s p c r 聚合酶链式反应 p o l 笋n e r a s ec h a 主n 嫩c t i o n p i 无机磷酸 p h 0 刚砌i d r a c e 快速扩增c d n a 末端 r a p i da i i 甲1 i 丘c a 缸d no fc d n ae n d s r i f利福平 r i 缸印i c i n r n 越e a 、 核糖核酸酶a r i b o n u c l e a 辩a r t - p c r反转录p c r r - e v e 璐e 觇璐c 咖协d v ep c r 邛l m 转分 r e 、，0 l v 既删怄p i 盯i n i m u 把 s d s 十二烷基磺酸钠s o r d i 啪d o d e c y l e 蚰钕e 嗜热d n a 聚合酶 n l e 肋o sa q 蛐d n a p o 助m 娜e 二d 4 转移d n a t 】囝n s f ；暂d n a t i i s 三轻甲基氨基甲烷 喇s h y 出呶删n e 蛆1 y l 锄血1 0 m e 也锄e x - 酉u c 5 溴代一4 氯3 吲哚b d 葡5 - b r o l n o 4 c h l o m - 3 - i 球l o i y l - b - d 一酉u a l r o n i d e 糖苷酸 4 7 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名： f 乏阂 导师签字：zz 力 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：弘闽 签字日期：2 0 09 年f 月6 日 导师签字：z 参乡 yi ， 签字日期：2 0 0 譬年f 月6 日 山东师范大学硕士学位论文 1 文献综述 土壤盐渍化是世界范围内限制作物产量的重要问题。特别是在发展中国家， 由于灌溉和生态系统的失衡，盐碱土地日益扩大。提高植物尤其是作物的耐盐性 是开发和利用盐渍土地最有效的方法之一，也是目前和将来农业发展的重大课题 之一。 盐地碱蓬( s 撇e 妇阳砌l ) 属藜科，一年生草本，一般生于海滨、湖边、荒漠 等处的盐碱荒地上，在含盐量高达3 的潮间带也能稀疏丛生，是一种典型的盐 碱地指示植物。盐地碱蓬幼苗俗称黄须菜，富含氨基酸和胡萝卜素等，可作为蔬 菜食用；种子榨出的油富含人体生长发育所必需的脂肪酸亚油酸和亚麻酸，具有 抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗氧化和降低体内脂肪等医药保健功划l j ：另外，盐 地碱蓬还能消除裸露盐碱荒滩，防止水土流失，对保持和重建盐地生态有重要作 用。 盐地碱蓬在滨海的潮间带或者部分涝洼积水地带在整个生长期植株地上部 分皆为紫红色，而在地势较高或者距离海边较远的地方植株则呈现绿色( 图1 1 ) 。 作为一种真盐生植物，盐地碱蓬的耐盐机理已得到了比较广泛的研究【2 刮。但是， 盐地碱蓬红色素生物合成的分子机理及生物学意义等至今尚未见报道。深入研究 盐地碱蓬红色素积累的机理，对于揭示盐生植物的光合作用、生态进化、耐盐适 应等生理过程具有重要意义。 图1 1 生长在潮间带( a ) 和地势较高处( b ) 的盐地碱蓬幼苗7 】 f i g 1 1s e e ( u i n g so f 砌口p 砌s a 厶口p l a l l t s 轳o w ni ni n t e r t i d a lz o n e ( a ) a l l d o nh i g l l l a n d ( b ) o ft h e y e u o wr i v e rd e l t 扎c h 血a 【7 】 王长泉等( 2 0 0 6 ) 已鉴定潮间带盐地碱蓬积累的红色素为甜菜红素【7 1 。 1 1 甜菜素的基本性质 甜菜素是一种水溶性含氮色素，不溶于无水的有机溶剂，因最早发现于甜菜 根中而得名，是吡啶衍生物，包括甜菜红素( b e t a c y a n i n ) 和甜菜黄素( b e t a x a n t h i n ) 两种形式，其结构通式如图1 2 所示。到目前为止，人们发现石竹目1 3 科的植 山东师范入学顾l ：学位论文 物中除粟米草科和石竹科积累花色素外，其他各科如仙人掌科、藜科和苋科植物 等都积累甜菜素，还有部分高等真菌中也积累甜菜烈啦! 3 j 。至今在原核生物和动 物细胞中仍未发现甜菜素。甜菜素一般存在于植物的花、果实和部分无性繁殖器 官中。令人感兴趣的是甜菜素和花色素相互排斥，从没有发现在一种植物中同时 存在这两种色素，所以甜菜素被用来作为一种重要的化学分类指标。甜菜素的基 本生色团为甜菜醛氨酸( b e t a l a m i ca c i d ，图1 2 右) 。甜菜红素的可见光最大吸 收波长因溶剂不同在5 3 5 5 3 8n m 之i 日j 波动，甜菜黄素的可见光最火吸收波长在 4 6 5n m 附近，因此甜菜素的含量通常用5 3 8 姗和4 6 5m 吸光度来计算。 h h 图1 2 甜菜红素( 左) 和甜菜黄素( 中) 通式及其基本生色团甜菜醛氨酸( 右) f 8 1 f i g 1 2b e t a c y a n i n ( 1 e 哟，b e t a x a n t h i n ( m i d d l e ) a n db e t a l a m i ca c i d ( r i g h t ) 【8 l 1 2 甜菜素的生物合成 1 2 1 甜菜素的合成途径 甜菜素合成主要步骤总结如图1 3 ，酪氨酸在酪氨酸酶的羟化作用卜形成多 巴( 3 ，4 二羟基苯丙氨酸) ，多巴在酪氨酸酶的氧化作用下形成多巴醌，然后自发 形成环状多巴；另一合成支路是多巴在4 ，5 多巴双加氧酶的作用下形成丌环多巴 ( 4 ，5 一s e c o d o p a ) ，继而自发反应生成甜菜素的基本生色团甜菜醛氨酸l j 4 j ； 甜菜醛氨酸和环状多巴自发缩合形成甜菜红素，甜菜红素在u d p 一葡糖基转移酶 的作用下在c 5 或者c 6 位连接上糖基，形成甜菜红色素苷，在液泡中积累。甜 菜醛氨酸和氨基酸或者胺自发结合则形成甜菜黄素i i 引。 1 2 2 甜菜素的合成酶及其编码基因 从甜菜素合成的过程可以看出，合成的丌始阶段和最后阶段是酶促反应，合 成的中间关键环节则是自发反应。因此对甜菜素合成途径中研究比较多的酶是酪 氨酸酶、葡糖基转移酶和多巴双加氧酶。 山东师范大学硕士学位论文 t 硼 蠢期日诎翻_ 舒b 嗤 趣跏啪妇 缸强轴訇函稿峨 b 一0 菇函耐k a 趣一陋囊k 越时蹦羽_ 麓 戤参。噶h 翻叼函期删函蜮 s _ 零曩喇曩 姐 图1 3 甜菜素合成的基本途径【8 1 f 谵1 3b i o s y n n 坞6 cs c h e m eo f b e t a c y a i l i i la 1 1 db e t a x a n 也j n 【8 1 1 2 2 1 酪氨酸酶 酪氨酸酶( e c1 1 4 1 8 1 ) 又称酚氧化酶、多酚氧化酶、儿茶酚氧化酶，是 结构复杂的多亚基的含铜氧化还原酶，广泛存在于哺乳动物、植物和微生物体内 【l5 1 。酪氨酸酶作为一种重要的生物资源，有着广泛的用途，在生物体内具有许 多重要的生理功能。例如，它在植物中类黄酮、紫胶、软酸、酚类、生物碱、木 质素、l _ d o p a 及动物体中黑色素等的生物合成中起着重要的作用【1 6 】。 酪氨酸酶被认为是甜菜素合成过程的第一个关键酶，是含铜的蛋白，含有两 个c u 结合位点，分子量一般在4 0 7 0k d 之间【1 7 l 。酪氨酸酶本身具有单酚氧化酶 ( e c1 1 4 1 8 1 ) 和双酚氧化酶( e c1 1 0 3 1 ) 的双重活性，分别以酪氨酸和d 0 p a 为底物，分离提纯过程烦琐而且很容易失活。目前，有关酪氨酸酶结构域的研究 3 毒 山东师范大学硕士学位论文 报道不一。s t e i l l e r ( 1 9 9 9 ) 从大花马齿苋( p 6 呦肠c 口g m 刀删厂口h 0 0 k ) 纯化而 得酪氨酸酶，并证明该酶以单体形式存在，其分子量为5 3k d 【埽l 。然而，l u k 雒 a m u e l l e r 等( 1 9 9 6 ) 的研究证明，伞形毒菌中酪氨酸酶是以异二聚体形式存在 的，单体分子量分别为3 0 如和2 7k d ，并且通过p a g e 电泳技术表明该酶可能 存在同功酶【1 9 】。通过对不同生物来源的酪氨酸酶序列进行分析发现，所有的酪 氨酸酶具有一个保守域，即c u - 结合域【2 叩。 g a n i i i a - h e 玎e r o 等最新研究发现，酪氨酸酶的单酚活性还可以以酪氨酸甜菜 黄素和多巴胺甜菜黄素作为作用底物【2 2 】。 在合成甜菜素的高等植物美洲商陆皿，肠c c 口彳肌仃泐刀口) 中分离出了两 个编码酪氨酸酶的c d n a 序列。这两个序列在核苷酸水平和氨基酸水平分别具 有9 6 和8 3 的同源性，由这两个序列编码的蛋白分别定名为p a p l 和p a p 2 ， 这两个蛋白都具有富含组氨酸的铜结构域。在每个序列的c 端还含有一个组氨 酸富集区，但是还不清楚在酪氨酸氧化酶中这一区域是否具有催化功能。其中编 码酪氨酸酶p a p l 基因全长2 0 9 9b p ，开放阅读框为1 7 5 8b p ，无内含子，编码5 8 6 个氨基酸【2 4 1 。 1 2 2 2 葡糖基转移酶 v 0 醇等于1 9 9 9 年从番杏科彩虹菊( d d 加砌即，l 咖淞6 出删白册话) 中克隆出来 的5 o 葡糖基转移酶基因是第一个从高等植物中克隆出的参与甜菜素合成的关 键酶的基因，该基因和从茄科的烟草和西红柿中获得的葡糖基转移酶基因序列以 及其他公开发表的葡糖基转移酶基因序列具有很高的同源性。彩虹菊5 0 葡糖 基转移酶除了以甜菜红素配基为底物外，还能以具有邻二羟基芳香环的类黄酮类 为底物，只不过优先在b 环的4 羟基位发生糖苷化( 类黄酮的结构见图1 5 ) 【2 5 】。 2 0 0 2 年v o 垂等从同一植物中克隆出了6 o 葡糖基转移酶基因，有趣的是其 序列和5 o 葡糖基转移酶基因序列明显不同，而和花色素葡糖基转移酶基因序 列有较高相似性。 虽然5 o 一葡糖基转移酶和6 o 葡糖基转移酶有相似的作用底物，但是其蛋 白质氨基酸序列只有1 9 是相同的，这也说明这两种酶在糖基转移过程中是相互 独立起作用的【2 6 】。h a 璐等用点突变技术发现彩虹菊5 o 葡糖基转移酶的两个高 度保守的氨基酸序列g 1 u 3 7 8 和h i s 2 2 被取代后酶的活性会完全丧失，由此建立 了5 o 一葡糖基转移酶三维结构模型来解释其催化作用【2 7 1 。 近年研究表明，甜菜红素合成过程中的糖基化还可发生在环状多巴水平上。 目前已从紫茉莉( 施磁6 f 胁弘 妒口) 等中检测到c y c l o d 叩a - 5 - o g 1 y c o s y l 仃姐s f e 弱e 活性，并且酶活与甜菜红素积累的量呈正相关性，该酶虽未能成功的分离纯化， 但已从紫茉莉和鸡冠花( c 台幻5 记c r 括细勉) 中克隆出了该酶的候选基因【2 引，结果 4 表明二者有6 2 的氨基酸序列相似。 1 2 2 3 多巴双加氧酶 多巴双加氧酶催化多巴形成开环多巴( 4 ，5 s e c o d o p a ) ，继而自发反应生成 甜菜素的基本生色团甜菜醛氨酸。多巴双加氧酶基因最早从毒蝇伞( 4 朋口刀泐 肌淞砌) 中克隆出来，是甜菜素合成途径中第一个被克隆出的功能酶的基因。 该基因如幽由6 个1 4 2 1 9 b p 的外显子和5 个短的，4 9 9 9 b p 的内含子组成，在 转录水平被调控，和已发表的类似酶的基因序列相似性很低【2 9 】。s o u 也锄印迹 分析表明在毒蝇伞中如剃是单拷贝。该基因编码2 2 8 个氨基酸残基组成的多肽 链，当以d 0 p a 为底物时，酶切芳香环的4 ，5 或2 ，3 c - c 键，生成甜菜醛氨酸或 d ：l u s c a f l a 啊n 。 高等植物中多巴双加氧酶的进化是与毒蝇伞完全不同的系统发生途径。2 0 0 4 年c m s t i i l e t 等在马齿苋科植物太阳花( 胁肠g 加，l 幽饧，口，又称半支莲、松 叶牡丹) 克隆出了高等植物的4 ，5 一多巴双加氧酶基因( d ) ，其c d n a 序列 全长1 2 4 9b p ，开放阅读框编码2 7 1 个氨基酸的肽链，分子量约2 9 9k d a 。s o u t h e m 印迹分析表明在太阳花中d 曙也是单拷贝。n o 劬锄印迹分析表明d 0 p a 双加 氧酶合成在鼬忱水平上受到调控，并且这个基因只在有颜色的花瓣中表达。 对推断的氨基酸序列分析表明太阳花中的多巴双加氧酶是可溶性蛋白，只有 一个明显的疏水区。而且发现其类似物不仅存在于甜菜素类植物中，还存在于其 他被子植物和苔藓类植物体中，只是催化部位附近的序列稍有变化【3 0 】。在合成 甜菜素的植物中，催化部位的保守序列是h - p ( s a ) ( n ，d ) - x t - p ，与底物的识别 有关。与毒蝇伞不同，只能酶切d o p a 芳香环的4 ，5 c c 键，生成甜菜醛氨酸。 多巴双加氧酶基因还从甜菜等其他高等植物中克隆出来，但至今未成功提取 到有活性的酶液。这可能是由于存在抑制剂，缺少辅助因子，或者没有合适的反 应条件，也可能是酶的浓度较低或者酶不稳定等因素。 1 3 甜菜红素合成的遗传模型 t r e z z 越( 1 9 9 0 ) 以大花马齿苋( 只d ，纵勉磁g 阳捍哦加地)为模式植物对参与 月g 花蕊中甜菜红素合成的基因进行了研究，并提出了三基因模型p l 】： 基因c ：与甜菜醛氨酸的合成有关，可能编码4 ，5 多巴双加氧酶，基因c 只 在有色的表型中能够表达。 基因r ：基因r 属于不完全显性基因，它有三个等位基因。基因r 可能编 码调节因子调节酪氨酸酶的氧化作用，调控d o p a 向c y c l o d o p a 的转化；另外， 基因r 可能与c y c l o d o p a 的糖基化有关。 基因i ：基因i 抑制甜菜素的合成。它抑制甜菜醛氨酸与氨基酸的缩合形成 甜菜黄素。认为发色团甜菜醛氨酸存在于细胞质中，而色素却积累液泡内，发色 5 山东师范犬学硕士学位论文 团通过特定的转运蛋白进入液泡，然后与液泡内的氨基酸发生缩合反应，从而积 累色素。基因i 可能是通过编码一种蛋白来抑制转运蛋白的作用，阻止甜菜醛氨 酸的转运。基因i 至少存在两个等位基因，并且与基因r 存在遗传连锁。 1 4 甜菜素与花色素的比较 1 4 1 甜菜素与花色素理化性质的比较 甜菜素色泽和花色素相似，因此曾被称误为是甜菜花色素，但因二者化学结 构截然不同( 图1 4 ) ，很易区分：( 1 ) 花色素在2 7 0 眦波长下有吸收峰，甜菜 素没有或不明显：( 2 ) 花色素易用甲醇提取而难用水提取，甜菜素则相反；( 3 ) 在弱酸性水溶液中电泳，花色素趋向阴极而甜菜素趋向阳极【3 列。 h o r 图1 4 花色素的基本结构3 2 】 f i g 1 4t h es 饥 l c t u o fa n m o c y 缸i 舾【3 2 】 1 4 2 甜菜素与花色素合成途径的比较 和甜菜素的合成相比，花色素合成的研究不仅广泛而且非常深入。花色素是 类黄酮类色素，由莽草酸酯( s 1 1 i 】血a t e ) 和乙酸一丙二酸酯( a c e t a t e m a l o n a t e ) 两条生物合成途径的产物进一步衍生而来，两条途径生成的3 分子丙二酸单酰 c o a 和1 分子对香豆酰c o a 在查尔酮合成酶( c h s ) 的催化下形成第一个黄酮 类化合物一查尔酮，它可以自发缓慢异构化形成无色的黄烷酮，也可以在查尔 酮黄烷酮异构酶( c h i ) 的催化下加速完成；继而在黄烷酮羟化酶( f 3 h ) 的催 化下形成香橙素( d 胍) ，还可以在f 37 h 的催化下形成双氢槲皮素( d h q ) ，或 者在f 37 5 h 的催化下形成双氢杨梅皮素( d ) ，这些无色的双氢黄酮醇在双 氢黄酮醇还原酶( d f r ) 的催化下还原成无色花色素；无色花色素在花色素合成酶 ( a n s ) 作用下经过1 2 步的转化形成有色花色素，然后在u d p 葡糖基转移酶 ( u g t ) 的催化下完成糖基化，形成花色素苷( 础1 t h o c y 狐n ) ，在液泡中积累( 图 1 5 ) 。 花色素合成过程中的关键结构基因在不同植物体中得到克隆，主要包括查尔 酮合成酶基因( c 娜) 、查尔酮黄烷酮异构酶基因( c 肼) 、双氢黄酮醇还原酶基 因( 肼尺) 、花青素合成酶基因( 彳朋) 、u d p 葡糖基转移酶基因( 丁) 。利用突 变体在拟南芥、矮牵牛、玉米等几种模式植物体内克隆出控制花青素生物合成的 6 山东师范大学硕士学位论文 6 皿聊批z f 忌砂、m 扮z 妇，肋4 d ，聊】，脚，明p 六类共十几种调节 基因【3 3 。3 引。 甜菜素和花色素颜色相似，吸收光谱也很接近，所以曾被认为是甜菜花色素， 但是从合成过程来看两者是来源和结构完全不同的物质。植物在长期进化过程中 甜菜素合成途径和花色素合成途径分离的机理还不清楚，但从花色素和甜菜素合 成的前体物质来看，二者也存在某种联系。由图1 5 可知，花色素合成的前体物 质之一对香豆酰c o a 是由苯丙氨酸在苯丙氨酸裂解酶( p a l ) 作用下生成 的，而甜菜素合成的前体物质是酪氨酸，是苯丙氨酸4 位被羟基取代后的产物( 图 1 3 ) 。从这个角度来看，二者的前体物质之间还有一定的同源性。至于是什么原 因导致了不同植物采取了两种截然不同的色素合成策略，而且两种合成途径在同 一植物体中相互排斥，这一直是科学家们试图破解的迷。 h h p h y 啪彻妇e 圳出o c y - l i i n 图1 5 花色素的合成途径简图【3 3 】 f i g 1 5b i o s y n n l e t i cs c h e m eo fa n t l l o c y 锄甜3 3 1 1 5 影响甜菜红素合成的因子 甜菜红素的合成受到许多化学因子和物理因素的综合作用调控，主要有以下 7 山东师范大学硕士学位论文 几方面： 光照：对盐生植物盐地碱蓬而言，种子萌发阶段，黑暗有利于甜菜红素的积 累，而光照促进甜菜红素的降解。在光照条件下，伴随着盐地碱蓬甜菜红素含量 的下降，酪氨酸酶羟化活性和氧化活性都随时间延长而降低。而且，酪氨酸酶活 性只在黑暗条件下培养得到的明显积累甜菜红素的幼苗中检测到，而在光照条件 下培养得到的幼苗中则检测不到。这说明光照和黑暗调节盐地碱蓬甜菜红素合成 和降解是通过调控酪氨酸酶活性实现的【3 9 】。w a n g 等进一步研究表明在蓝光下酪 氨酸酶的活性下降与蓝光受体c i m 蛋白的降解有关【矧。在合成甜菜红素的美 洲商陆细胞分裂过程中，甜菜红素的合成也是通过调节酪氨酸酶的活性实现的 【4 1 ，4 2 1 。而在太阳花中，甜菜素的合成则是由甜菜素合成的另一个关键酶一多巴双 加氧酶实现调控的。在太阳花白色花瓣中不含有甜菜素，但是也检测到了酪氨酸 酶的活性，这说明太阳花中甜菜素合成的关键调节酶不是酪氨酸酶。把毒蝇伞多 巴双加氧酶基因转入到太阳花的白色花瓣中能够启动甜菜素的合成，也证明了多 巴双加氧酶是调控太阳花甜菜素合成的关键酣4 3 1 ，但是，多巴双加氧酶基因及 酶活性是否受光调节有待进一步研究。 生长调节物质：甜菜红素的合成受培养基中生长调节物质，特别是2 ，4 d 与 6 一b a 比值的影响。有人认为甜菜红素的合成受细胞分裂素的诱导，其作用机制 可能是：细胞分裂素可能参与调控植物对酪氨酸的利用，诱导合成或激活酪氨酸 酶畔】；但有人持反对意见，认为细胞分裂素与甜菜红素的前体水平及酶活之间 不存在相关性【4 5 】。 温度：短时间的高温处理亦能促进4 肌口，口玎砌淞砒d 肠，幼苗甜菜红素的合成， 可能使由于温度改变了细胞膜，而细胞分裂素的诱导作用也是通过膜起作用的 【4 6 】 o 各种营养元素：如k + ；n 0 3 一；n h 4 + ；p 0 4 r ；蔗糖等【似5 1 1 。 氧化胁迫：s 印u l v e 札j i n l c n e z 等将外源烟草野火病菌绷如朋o ，l 船 习，一玎即力和根癌土壤杆菌施c f p r 觑扰m 朋乞励c 切z j ) 注射到甜菜的叶片中以 及用h 2 0 2 处理叶片，可以明显诱导甜菜红素的积累，同时，也诱导了葡糖基转 移酶的表达【5 2 1 ，这说明，氧化胁迫对甜菜红素的积累与合成甜菜红素关键酶 血盼姨水平的增加有关。 1 6 甜菜素的生物学功能 1 6 1 甜菜素的抗氧化功能 从结构上看，甜菜素都含有芳香环，含有丰富的不饱和双键，具有清除氧自 由基的潜力【5 3 ，5 4 1 。甜菜红素的合成可能与活性氧( r o s ) 的清除有关。机械损伤、 细菌侵染和氧化胁迫能够诱导u d p 葡糖基转移酶的表达【27 】；而只有用高盐( o 5 山东师范大学硕士学位论文 1 0 l l n a c l ) 处理甜菜、大花马齿苋的愈伤组织及完整植株，酪氨酸酶才表现出 较高的酶活，不用n a c l 处理时，只有最大酶活的4 。v o 醇等( 1 9 9 9 ) 用高强度 紫外线处理兼性c a m 植物冰叶日中花发现，甜菜红素在叶子表皮细胞的液泡中 快速积累【2 5 1 ，说明甜菜素可以作为紫外线的过滤器保护植物免受或者降低紫外 线损伤。 s e 曲l v e 缸j i n l 6 n 铭等( 2 0 0 4 ) 将外源h 2 0 2 注射到甜菜的叶片中很快诱导了甜 菜红素的合成，降低了逆境所导致的植物体内过氧化胁迫。 这表明：在氧化胁迫条件下，r o s 通过某种信号转导途径，诱导甜菜红素 合成相关酶的表达，或释放酶的活化形式，亦或提高酶活，而合成甜菜红素过程 本身可能就是清除活性氧自由基的过程，也可能是甜菜红素作为一种非酶促抗氧 化剂参与r o s 水平的调节，从而减少胁迫条件引起的伤害。 从发现的甜菜素合成途径的植物如仙人掌( 仙人掌科) 、冰叶日中花( 番杏 科，盐生植物) 、甜菜( 黎科) 、盐地碱蓬( 黎科，盐生植物) 等多是旱生或者盐 生植物这一现象来分析，甜菜素合成途径可能与植物适应更恶劣的逆境( 如极端 干旱、盐分胁迫) 有关，不过这种推断需要更多的实验从进化、适应、生理以及 分子生物学的角度来证实。 1 6 2 甜菜素的其它功能 盐分胁迫可以诱导盐角草( 腼加d 朋缸唧口锨) 植株内甜菜素积累，由此认 为甜菜素参与渗透调节等生理过程瞬5 1 。仙人掌科植物刺梨( 印甜，z 砌卿) 中脯氨 酸和甜菜醛氨酸结合生成梨果甜菜黄素( 1 1 1 d i c a x a n t h i n ) ，这也说明甜菜素直接或 者通过甜菜黄素的合成和降解而改变氨基酸的浓度来间接参与渗透调节，以增强 旱生的仙人掌科植物对干旱逆境的适应能力【5 引。 s 印d l v e d a - j i n l 6 i l e z 等( 2 0 0 4 ) 将外源烟草野火病菌( a 倒如m 册甜$ 树托弘p ) 根癌 土壤杆菌m 6 口翻州材扰加咒弓向c 话埘注射到甜菜( 阮细w 庭胁) 的叶片中可以明 显诱导甜菜红素的积累【5 2 】。由此可见，甜菜素作为植物保护性反应而合成的一 种次生代谢物质，可以提高植物抗病菌的能力。 植物因含有不同比例的甜菜红素和甜菜黄素而呈现不同的花色，可以吸引昆 虫授粉，呈现的不同果实颜色也可以吸引鸟类和动物取食而将种子带到更远的地 方，这对物种的繁殖和传播具有重要意义【5 9 1 。 1 7 本论文目的和意义 本文拟以真盐生植物盐地碱蓬为试材对合成其甜菜红素的关键酶之一 4 ，5 - 多巴双加氧酶的基因和启动子进行克隆，研究影响其表达的环境因子，并对 甜菜红素合成的生理机制和生物学意义进行初步研究，为进一步研究甜菜红素在 盐生植物进化和生态适应等方面的作用机理奠定基础。 9 山东师范大学硕士学位论文 2 材料和方法 2 1 实验材料 2 1 1 植物材料 2 1 1 1 盐地碱蓬( 鼬口砒s 口豇4l ) ：将盐地碱蓬种子( 采自黄河三角洲) 播种 于装有干净细沙的塑料盆中，置于培养箱中黑暗培养。用1 2m s 营养液( p h5 8 ) 浇灌培养。相对湿度6 0 8 0 ( 自对晚上) ，温度：2 5 1 5 ( 白天晚上) 。取 黑暗培养三天的幼苗子叶提取总r n a ，进行基因克隆。 2 1 1 2 拟南芥( 彳阳6 触猡豇髓口西妇口) 哥伦比亚生态型：播种于土：蛭石：珍珠岩 ( 4 ：3 ：1 ) 的混合土中，用h 0 9 1 a n d 营养液每三天浇一次，温度：2 0 2 2 ，相 对湿度6 啦7 0 ，光照1 6 小时，黑暗8 小时，光照强度1 1 0u m o l i n 2 s 。 2 1 1 3 烟草( 朋c 口妇以口纽施c “肌) “n c 8 9 ，无菌苗。 2 1 2 菌种 大肠杆菌( 西幽硎砌记c 0 z f ) 菌株：d h 5 a 根癌农杆菌( 彳g 加施c 招，f “，lm 埘乞庙c 玉明s ) 菌株：g v 3 1 0 l