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南京理工大学硕士学位论文白腐真菌诱变育种及对染料降解脱色的研究 摘要 实验对黄孢原毛平革菌在浅层静培养条件下对染料脱色性能进行了研究，确定了 黄孢原毛平革茵对孔雀石绿脱色的基本参数，包括培养时间、缓冲液的选择、溶解氧 的浓度和冷藏时间的影响。实验讨论了黄孢原毛平革菌重复脱色的可行性，进料浓度 及孢子浓度对重复脱色的影响，以及葡萄糖在重复脱色过程中的作用。实验还表明， 对黄孢原毛平革菌进行诱导驯化后再处理难降解染料番红花红，可使6 d 的脱色率从 3 6 提高到8 9 。通过紫外线照射和亚硝酸盐两种诱变手段对黄孢原毛平革菌进行了 诱变育种实验，进而考察了诱变后筛选出的优势菌对高浓度染料、番红花红的降解情 况，并以此对比评价了两种诱变方法的诱变效果。实验还初步讨论了诱变菌的培养条 件，包括培养时间、温度和p h 。实验结果表明，诱变菌的产酶时间从5 d 缩短为3 d ， 但是菌种诱变前后适宜的处理温度和p h 值基本不变。 关键词：黄孢原毛平革菌染料重复脱色驯化紫外诱变亚硝酸盐诱变 南京理工大学硕士学位论文白腐真菌诱变育种及对染料降解脱色的研究 a b s t r a c t t h es t u d yo nc a p a b i l i t yo fd e c o l o r i z a t i o no fp h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u mt od y e u n d e rc o n d f f i o no ft h es h a l l o ws t a t i cc u l t u r ew a sc a r r i e do u t t h eb a s i cp a r a m e t e r so f d e c o l o r i z a t i o nt om a l a c h i t eg r e e nu s i n gp h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u mw e r ec o n f i n e d ， i n c l u d i n gt h et i m eo fc u l t i v a t i o n 、b u f f e rs o l u t i o n s 、o x y g e nc o n c e n t r a t i o na n dt h ec o o l s t o r a g et i m eo fm y c e l i a lp e l l e t s i nr e p e a t e d b a t c hm o d e ，t h ef e a s i b i l i t yo fd e c o l o r i z a t i o n a c t i v i t yo fp h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u ma n dt h ee f f e c to ft h ea m o u n to fp e l l e t sa n dd y e c o n c e n t r a f i o nw e r ei n v e s t i g a t e d t h ee f f e c to fg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nw a sa l s ot e s t e d i n r e p e a t e d b a t c hm o d e a f t e rd o m e s t i c a t i o n ，t h ep e r c e n to fd e c o l o r i z a t i o nt os a f r a n i n et i n c r e a s e df r o m3 6 t o 8 9 i ns i x d a y s m u t a t i o nb r e e d i n g o fp h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u mb yu v 二l i g h t a n dn i t r i t ew a s i n v e s t i g a t e d a n d t h e c a p a b i l i t y o f d e c o l o r i z a t i o nt os a f r a n i n eta n dd y eo fh i g hc o n c e n t r a t i o na f t e ri n d u c e dm u t a t i o nw a s t e s t e d t h eb a s i cp a r a m e t e r so fd e c o l o r i z a t i o nu s i n gh i g h l ye f f i c i e n td e g r a d a t i o nb a c t e r i a w e r ec o n f i n e d ，i n c l u d i n gt h et i m eo fc u l t i v a t i o n 、t e m p e r a t u r ea n dp h t h ee x p e r i m e n t s s h o w e dt h a tt h et i m eo fe n z y m ep r o d u c t i o nr e d u c e df r o m5d a y st o3d a y s ，b u tt h er a n g eo f t e m p e r a t u r ea n dp hw e r ea l m o s tn o tc h a n g e da f t e rp h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u mw a s i n d u c e d k e y w o r d s ：p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u md y er e p e a t e d - b a t h d e c o l o r i z a t i o n d o m e s t i c a t i o nu vi n d u c e dm u t a t i o nn i t r i t ei n d u c e dm u t a t i o n 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名：三啡。f 年p7 一日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：兰姬 盯年舌月夕曰 南京理工大学硕士学位论文白腐真菌诱变育种及对染料降解脱色的研究 1 引言 白腐真菌是生物界中一类奇特的丝状真菌，它们对各种异生物质的独特降解能力 和降解机制，多年来一直受到世界各国科学界及工业界的高度重视，它们及其相关技 术在环境保护领域正显示强大的作用潜力，在生物补救方面具有广阔的应用前景。 2 0 世纪8 0 年代初，( ( s c i e n c e ) ) 首次报道白腐真菌的降解作用，t i e n 和g l e n n 两研究 小组几乎同时从黄孢原毛平革菌的培养液种发现了木质过氧化物酶，便引起了环境界 的广泛关注，随后对白腐真菌生物学特性、降解规律、生化原理、酶学、分子生物学、 工业化生产及环境工程实际应用等方面进行了大量研究。据大量相关文献报道“， 对白腐菌的研究遍及全球，主要包括英、美、法、德、瑞士、瑞典及日本等国，我国 也进行了大量研究。 1 1 自腐真菌的特点及其应用 1 1 1 自腐真菌的微生物学特征及分类 白腐真菌腐生在树木或木材上，因引起木质白色腐烂而得此名。白腐真菌菌丝体 一般为多核，少有隔膜，通常担子菌的两性结合是以锁状联合方式形成新的双核细胞， 而白腐菌虽属担子菌纲却无锁状联合。多核的分生孢子常为异核，存在同宗配合异宗 配合两类交配系统“1 ，多数多孔菌、伞菌都属于此类型。中国真菌志便记载了4 6 属1 3 7 种嘲。 目前，已研究的白腐菌有：黄孢原毛平革菌( p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m ) 、 彩绒革盖菌( c o l i o l u sv e r s i c o l o r ) 、变色栓菌( t r a m e t e sv e r s i c o l o r ) 、射脉菌( p h l e b i a r a d i a t a ) 、风尾菇( p l e u r o t u sp u l m o n a r i u s ) 、朱红密孔菌( b y c n o p o r u sc i n n a b a r i n u s ) 等。其中研究得最多、也最重要的是黄孢原毛平革菌“1 及其所产生的木素过氧化物酶 和锰过氧化物酶，该菌广泛分布于北美各地，在我国尚未发现。 1 1 2 白腐真菌的培养条件 ( 1 ) 培养温度：大多数白腐真菌的培养温度为3 0 3 7 c 。少数白腐真菌最佳的培养 温度为3 7 。c ( 如黄孢原毛平革菌) ，并且经过短期5 0 。c 高温预处理后仍然能够恢复其生 物活性。 ( 2 ) 培养p h 值：所有的白腐真菌适宜的培养p h 值为4 5 5 o 之间。 ( 3 ) 营养物质：可以作为白腐真菌的碳源及氮源的物质是十分广泛的，营养成分可 以通过采用纯化学药剂配制，但许多生物废料也可以作为白腐真菌的培养物质。碳源 中除了能够利用葡萄糖、甘油等作为其常规的碳源外，白腐真菌还可以利用碎木屑( 如 白杨、松树木屑) 、树叶( 如水杉树叶) 、麦鼓、麦桔、玉米棒和废糖蜜等( 主要含木质 素、纤维素和多糖物质) 物质作为其代谢的碳源。相比而言，利用生物废料作为白腐 真菌的培养基质可以达到废物利用、降低成本的多重目的。许多研究认为黄孢原毛平 革菌等白腐真菌只有在氮源限制性培养条件下才能产生较高活性的过氧化物酶，另一 南京理工大学硕士学位论文白腐真菌诱变育种及对染料降解脱色的研究 些实验结果表明富氮条件下白腐真菌对污染物同样具有很高的降解活性，并且有时富 氮成为其必需的条件，锰过氧化酶m n p 依赖于m n 化合物而产生，因此为促进m n p 的活性 通常向培养体系中投力【i m n s o 。等药剂。 1 1 3 白腐真菌的应用研究进展 白腐真菌是整个生态系统的一部分，是具有特殊功能的生物类群，更深入的揭示 其生物学规律是更好驾驭它的前提。在环境意识增强，绿色运动方兴未艾的今天，环 境问题已与能源利用、经济发展、人类生存等主题紧密相连，环境保护已是全球的重 要基本策略之一。在这种大背景下，白腐菌无疑是自然界生态系统中极其宝贵的生物 资源之一，是环境科学研究的模式对象及环境治理的有力工具。与世界各国对白腐菌 研究及利用的积极与活跃相比，我国的状况则显得苍白与迟缓。结合我国环境治理的 严峻形势，开发白腐菌及其技术有积极的现实意义。 到目前为止，白腐菌的应用研究总的来说体现在以下两大方面：一是利用其或者 其所产的过氧化物酶系应用于工业上预处理某些原料以降低工业能耗，且实现清洁生 产；二是利用其对底物的非专一性降解污染物而应用于环境污染治理。 1 1 _ 3 1 白腐菌在工业上的应用“1 白腐菌现用于生物制浆后可使k a p p a 指数从1 1 6 降到7 9 ，k a s h i n o 利用白腐菌 i z u 一1 5 4 对阔叶木和针叶木生物机械制浆进行了研究，发现粗磨的山毛榉机械浆经真 菌处理7 d 后，可使后续磨浆能量消耗降低l 3 l 2 ；此外，白腐菌还可应用于饲料 工业上，利用其处理饲料可提高动物对饲料的消化率，从而突破了秸秆仅用于反刍动 物饲料的禁地；在食品工业如啤酒的生产中，可使用漆酶等进行沉淀和絮凝的脱除， 使酒类得到澄清，且已有很多实验尝试使用秸秆进行酒精发酵或有机酸发酵。 1 1 3 2 自腐真菌污染治理上的应用 在大气污染治理方面，美国的b u m p u s 研究利用自腐菌对煤进行解聚和增溶，避 免了直接用煤所引起的大气污染；t i e n 则致力于该菌对煤和石油的脱硫工作，并已经 取得另外肯定性成果。在固体污染治理方面，各国许多公司、研究机构利用白腐菌虽 对污染物堆积地及受农药侵蚀的土壤进行生物修复研究。y a t e e n 0 1 等根据不同的土壤 及其受石油烃污染的程度，白腐真菌所显示出较强的降解能力，在1 2 个月内，使土 壤中的总石油烃由3 2 9 k g 下降到7 9 k g ，降解率高达8 0 ，且随接种浓度的增加而提 高。美国洛根的i n t e c ho n e e i g h t yc o r p 用于对n 汀、d d t 等引起的土壤污染进行治 理，以实现生物修复。在水污染治理方面，白腐菌凭着非特异性的降解性能，能有效 降解废水生化处理过程中难降解的多氯联苯“”、多环芳烃、d d t 、酚类、染料、农药 等含有芳香结构的污染物“”1 。白腐菌对有机物的降解主要还是靠其胞外的非专一 性氧化作用来实现，可以去除废水中的c o d 、b o d 、色度和有毒物质“”。 南京理工大学硕士学位论文白腐真菌诱变育种及对染料降解脱色的研究 1 2 白腐真菌处理染料废水 l - 2 1 染料废水的处理现状 随着染料和印染工业的迅猛发展，染料的种类和数量不断增加，用于染料生产和 应用的染料废水的成分也随着工艺和技术的变化越来越复杂。 目前，世界染料年产量约为8 1 0 5 9 1 0 5 t ，我国年产量已经达到1 5 1 0 5 t ， 位居时间前列”“，其中约有1 0 1 5 的染料随废水排入环境，因而每年于1 0 万吨染料 被排入江湖、大海和地面水中，对环境影响很大。 目前，生产用的染料绝大部分为人工合成的化学染料，它们是芳香族化合物，结 构复杂、难降解、具有潜在毒性；而染料废水则由于染料的特殊性质不仅有机含量高， 生化性差，c o d 高，b o d c o d 低，而且色度高，成分复杂，有毒性。“，因此，这 种废水如果直接排放，则对环境造成严重污染，并可能通过食物链直接或间接影响人 们的身体健康。 随着环境法制力度的加强，有关染料废水的有效处理及其对环境、人体影响研究 则成为许多环保工作者的重要课题。目前，对染料废水的处理有物理化学法和生物处 理法。其中，物理化学法主要有吸附法、混凝法、化学氧化法、湿式空气氧化法等， 而生物法有表面加速曝气法等好氧或厌氧处理法。”。虽然这些方法通过长期的应用和 实验证明对染料废水的处理的确具有一定的效果，但它们各有利弊，均不能称为最佳 方法，如物理法的费用太高，且存在二次污染：化学法的c o d 去除率低等；与之相比， 生物法则是经济有效、可被广泛接受的环保处理方法，不仅价廉，而且无二次污染， 符合可持续性发展的需要。但传统的生物处理法由于染料的可生化性差，不能被生物 完全降解，且生成的中间产物结构复杂，往往具有毒性或致癌性，从而使其处理染料 废水效果不佳。白腐菌处理染料废水技术是近几年来新兴的有效处理方法。它能通过 白腐菌所分泌的特殊的降解酶系或其他机制将各种人工合成的染料彻底降解为c 0 2 和h 2 0 ，对脱色具有良好的效果。据研究还发现，它对其他许多结构不同、高毒性、 危险的、难降解的有机化合物也有一定作用，近几年来备受国内外专家的关注。 1 2 2 自腐真菌降解染料废水的进展 1 9 8 3 年g l e n n 和g o l d 首先证明，p c h r y s o s p o r i u m 对一些聚合染料有脱色作用 。1 9 8 8 年b u m p u s 和b r o c k 揭示，p c h r y s o s p o r i u m 能生物降解结晶紫这种三苯甲 烷碱性染料，真菌及细胞外液体对染料具有去甲基化反应能力“1 。1 9 9 0 年c r i p p s 等 首次报导p c h r y s o s p o r i u m 还能降解偶氮染料( 包括磺酸化偶氮染料) 和杂环染料锄1 。 何德文等”用白腐真菌降解酸性染料废水，其含量由初始的4 8 7 3 9 m g l 降至 3 7 2 6 i i i g l ，降解率达到9 2 以上，降解c o d 变化规律呈波浪趋势。赵春芳等。”用白 腐菌降解偶氮金属络合染料，其包括菌丝吸附和酶促降解反应两个过程，菌丝的生长 量及酶活性的高低与处理染料废水的效果呈正比。经驯化的p a n u sc o n c h a t u s 对溶剂 南京理工大学顾士学位论文白腐真菌诱变育种及对染料降解脱色的研究 染料作用7 2 h ，脱色率达9 0 以。n i g a m 等“用三种农业废弃物麦秆、木屑和玉米捣 碎物吸附单一和混合染料，麦秆和玉米捣碎物能在室温下从5 0 0 m g l 染料中去除 7 0 7 5 以上，吸附后的残渣是自腐真菌的良好底物。p o i n t i n g 等1 用亚热带担子菌 加上白腐真菌p c h r y s o s p o r i u m 降解含氮三苯甲烷和杂环聚合染料，两株亚热带担子 菌能在0 2 5 m m o l l c d “、c u 2 + 和z n 2 + 条件下降解，而自腐真菌p c h r y s o s p o r i u m 只 能在0 1r n m o l l 以下降解。z h a n g 等1 用白腐真菌在三种设计的反应器中降解含氮染 料橙i i ，连续流固定床生物反应器、间歇加料流化床生物反应器、连续流流化床生物 反应器在长期运行中表现出高效、稳定的降解效果，间歇加料流化床生物反应器效果 最佳( 1 0 0 0 m g l 橙i i1 d 中色度去除率达9 7 ) 。j a n s h e k a r 等o ”在浸没搅拌反应器中培 养p c h r y s o s p o r i u m 产生木素过氧化物酶，影响因素有接种体、小球体大小、特殊有 机物如聚丙烯乙二醇或聚乙烯乙二醇、培养条件和组成等，培养菌足以降解r e m a z o l 蓝染料，但没有显示木素过氧化物酶活性。p a l m a 等。“采用脉冲白腐真菌固定床和厌 氧菌组成的连续脱色系统，能有效处理p o l y a n t h r a q u i n o n ed y ep o l yr - 4 7 8 ，降解率 7 0 ，稳定运行超过l o o d 。 1 2 3 白腐真菌对染料脱色降解的光谱性 在染色废水中，染料被认为“不能用一般的生物降解方法去除”。然而，研究揭 示：白腐真菌则可能成为一种例外。 实验表明，白腐真菌对染料有极其广谱的降解脱色能力。从染料的化学结构大 类可分：偶氮染料、杂环染料、三苯甲烷染料及噻嗪染料等。从染料的种类看，又包 括：碱性亚甲蓝、橙i i 、金莲橙0 、刚果红、天青蓝、酸性品红、直接黄、直接蓝、 结晶紫、孔雀石绿、亮蓝、甲酚蓝、番红花红、比布里希猩红、直接冻黄g 、四嚷等。 这些染料与尸c h r y s o s p o r i u m 的共培养都发生程度不同的脱色与降解“2 3 。”“1 。 随着研究所选用的染料底物的拓宽，将鉴定有更多的染料可被真菌所降解脱色。 1 2 4 白腐真菌降解染料废水的机理 白腐真菌降解染料的活动只发生在次生代谢阶段，其降解能力取决于木质素降解 系统，该系统只有在一些主要营养物( g n 氮、碳、硫) 限制时才能形成。产生木质素降 解系统的这种营养限制称为木质素降解条件。 白腐菌在对营养限制作应答反应时形成如下一套酶系统1 ： ( 1 ) 产生h 2 0 2 的氧化酶。 细胞内葡萄糖氧化酶和细胞# f z , - - 醛氧化酶，它们在分子氧参与下氧化相应底物 而形成h 2 0 厂激活过氧化物酶，启动酶的催化循环。 ( 2 ) 需氧的过氧化物酶。 木质素过氧化物酶( l i p ) 和锰过氧化物酶( m l l p ) ，它们均在细胞内合成，然后分 泌到细胞外，以h 2 0 2 为最初氧化底物可催化降解酚类、胺类及染料等。 南京理工大学硕士学位论文 白腐真菌诱变育种及对染料降解脱色的研究 ( 3 ) 其他参与反应的还有漆酶、还原酶、甲基化酶、蛋白酶等。 自腐真菌降解染料的酶系，即木质素降解体系，在降解过程中起关键作用的是诱 导产生过氧化物酶，主要为l i p 和m n p 。 对于大部分染料，l i p 降解染料的机理主要为直接氧化。直接氧化的第一步是过 氧化物酶( 含f e l i i 离子) 由h 2 0 2 激发形成失去两个电子的氧化型中间体l i pi ( 含f e v 离子) ，l i pi 和染料分子反应，将其转变成自由基，自身得到个电子变成n pi if 含 f e n 离子) ，l i pi i 再和黎芦醇( q 反应，得到一个电子还原成原酶，完成一个催化循 环。直接氧化可导致c _ 一c 键断裂、芳环开环、苄基醇化、去甲基化、羟基化、二聚 化等。黎芦醇是黄孢原毛平革菌的一种次生代谢产物，已经证实黎芦醇为合成l i p 的 诱导物。研究发现黎芦醇对降解染料具有很大的促进作用”“。 m n p 的作用机理与l i p 类似，也生成两个酶中间体m n pi 和m n p i i ，见图 1 2 1 ”1 。在合成m n p 过程中，m n 2 + 的作用至关重要。b o n n a r m e 等人。7 1 研究了m n 2 + 对m i l p 合成的调节作用，发现培养基中不加m n 2 + 几乎不会合成m n p ；m n 2 + 的浓度在 0 4 0r a g l 之间时，浓度越高越有利于m n p 的合成。 m 7 叮啪 图1 2 1m n p 降解染料的机理 以上可以看出，l i p 以黎芦醇为中间电子递体，m i l p 以m n 2 + 为中间电子递体。 由于过氧化物酶只提供电子的转移而不是直接与化合物结合，使该菌的使用具有广泛 性而且不易受化合物毒性的影响。 何德文等m 1 也发表了相类似的看法，见图1 2 2 所示。到目前为止，对于碳氮浓 度与木质素过氧化物酶活性的关联性以及脱色作用与其他酶的关联性的研究都还不 太充分。 5 南京理工大学硕士学位论文白腐真菌诱变育种及对染料降解脱色的研究 缸古物 图1 2 2 自腐真菌降解有机物的细胞外过程 从总体上看，白腐真菌的降解机制是：依赖一个主要由细胞产生分泌的细胞外降 解体系，需氧并靠自身形成的h 2 0 2 激活，由酶触发启动一系列自由基链反应，实现 对底物无特异性的氧化降解。 1 2 5 白腐真菌处理染料废水的难点 诸多研究结果表明，白腐真菌对多种染料具有很好的脱色效果。但是，对于细菌 系统而言，真菌技术的发展时间短，还有不少问题需要解决，而且白腐真菌本身的一 些特性也造成了实际应用中的诸多困难。无论是从技术角度，还是从经济角度来看， 都必须引起足够的重视，只有圆满地解决了这些问题，才能真正实现工业化和商业。 ( 1 ) 相对于细菌而言，白腐真菌的生长周期比较长，通常从接种到酶活最大需 要5 6 d ，这对于将白腐真菌用于废水处理尤其是染料废水处理，实现工业化是十分 不利的，将会造成工程调试启动周期加长、运行费用增加等问题。 ( 2 ) 白腐真菌起脱色作用的主要为胞外酶，实验室小规模试验可能会收到良好 的效果，但是，在实际废水处理过程中，由于流量波动比较大，这样就有可能造成所 需的酶大量流失，废水处理系统的效率下降很快，稳定性差。 ( 3 ) 为提高效率，反应体系常采用的通气及搅动措施所产生的机械剪切力，会 引起分泌降解酶系统的严重失活，最终导致生物降解能力的下降、降解活动的停止、 反应机器的关闭等一系列事件的发生。 ( 4 ) 白腐真菌对染料的脱色效果比较好，而对c o d 的去除能力则较差，一般在 5 0 6 0 之间，因此，必须考虑和其他方法联合使用，才能使废水最终达标排放。 1 3 生物的诱交育种 微生物菌种选育是建立在遗传和变异基础上的。一个菌种生物合成的产量和质量 由遗传结构和功能所决定，而功能由遗传结构所控制，改变遗传结构，就影响功能， 功能的改变使生物合成产物的化学结构、合成能力和活性也随之改变。微生物的诱变 育种，是以人工诱变手段诱发微生物基因改变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从 一6 南京理工大学硕士学位论文白腐真菌诱变育种及对染料降解脱色的研究 多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的突变株，并找出发挥这个变株最佳培 养基和培养条件，使其在最适的环境条件下合成有效产物。即经由改变和操纵微生物 的基因，进而选育出适合工业化生产的菌种的一种综合技术。 1 3 1 诱变育种的进展“” 对工业微生物菌种“”进行有目的的改良，是在有关微生物遗传学知识被人们了解 并掌握之后才成为可能的，这种改良涉及多学科领域。 1 9 2 7 年，发现了x 射线诱发突变。1 9 4 5 年后，各种具有诱变能力的辐射和化学 诱变剂的发现，为这种改良提供了非常有用的工具。通过对诱变作用和d n a 修复机 制的深入了解，可以设计出使所需要的突变特性得以充分表达的筛选条件。 2 0 世纪4 0 年代初，b e a d l e 和t a t u m 采用x 射线和紫外线等辐射因子来诱发红色 面包霉等，获得了各种代谢障碍的变株，使遗传学从细胞水平发展到分子水平，促进 了工业微生物育种技术的发展。 1 9 2 9 年英国的f l e m i l g 发现了抗生素生产中的青霉素产生菌特异青霉( p e n i c i l l i u m n o t a t u m ) 。 杂交育种的最主要目的在于把不同菌株的优良经济性状集中于重组体中，克服长 期用诱变剂处理造成的诱变剂“疲劳效应”的缺陷，同时杂交还是增加产品新品种的 手段之一。 代谢控制“”育种以2 0 世纪5 0 年代末谷氨酸发酵取得成功使发酵工业进入第三转 折期一代谢控制发酵时期，并在其后的年代里得到飞跃的发展。 近年来，基因工程“”在工业微生物菌种选育逐年的应用得到了迅猛发展。世界上 以基因工程方法创造的各种工程菌不计其数，实现了人为的菌种选育，切可以按照 人们事先设计和控制的方法进行育种，是一种最新的最先进的育种技术。 工业微生物育种到目前为止，仍是以使用物理诱变、化学诱变或两者复合诱变的 诱变育种作为最主要的方法，原生质体融合方法较为简便，己为工业微生物育种工作 者所通用。体外基因重组方法虽为先进的定向育种，但目前应用此法选育菌种尚在积 极研究之中。 1 3 2 诱变育种的特点 从自然界分离所得的野生菌种，不论在产量上或质量上，均难适合工业和生产要 求。菌种通过诱变育种不仅可以提高有效产物的产量，改善生物学特性和创造新品种。 而且对于研究有效产物代谢途径、遗传图谱绘制等方面都有一定的用途。 ( 1 ) 提高有效产物的产量 包括提高野生菌种和改造菌种的代谢产物或中间产物的产量。目前在发酵工业生 产上所使用的菌种，几乎都是经过诱变育种获得的变种。对于新分离野生菌种，由于 发酵水平极低，必须通过多次诱变育种才能不断提高其发酵水平。对生产中已经应用 南京理工大学硕士学位论文白腐真菌诱变育种及对染料降解脱色的研究 的菌种也要通过人工诱变提高产量，使之适应大规模工业化生产的需要。目前生产上 使用的主要抗生素生产菌，其原始亲株发酵单位很低，经过诱变育种，不断提高发酵 水平，产量增加上千倍，效果十分显著。 ( 2 ) 改善菌种特性、提高产品质量 通过诱变育种，除了获得高产突变株之外，还可以选育到一些具有良好性状的变 株，包括改善产品质量、提高有效组分比例、简化工艺、缩短周期以及适合工业化发 酵工艺要求的变株。通过诱变育种带来产品质量提高的典型例子是青霉素。青霉素的 原始产生菌是黄青霉w i so 1 7 6 ，它深层发酵过程中产生黄色素，在提炼过程中很难 除去，影响产品质量，后经过诱变育种，获得一株无色突变株d l 3 d 1 0 ，改进了青霉 素的产品质量，也简化了提炼工艺，降低了成本。 ( 3 ) 简化工艺条件 通过诱变改善菌种特性，选育出更适合于工业化发酵的突变株。例如，选育孢子 生长能力强、孢子丰满的突变株，以减少种子工艺难度；泡沫少的突变株，既可节省 消泡剂，也可增加罐投料量，提高罐的利用率；发酵液黏性小的突变株，有利于改善 发酵过程溶氧，增强发酵液的过滤性能；抗噬菌体变株，免受噬菌体侵染而倒罐；要 求空气量低的变株；无油的突变株；发酵低热突变株等等。这些突变株可以简化工艺， 降低成本，提高发酵工艺的效率。 ( 4 ) 开发新品种 通过诱变育种，可以获得各种突变株，其中不难分离到改变产物结构的、去除多 余的代谢产物，改变原有代谢途径，合成新的代谢产物的新品种。例如，诱变柔红霉 素产生菌，筛选出能产生抗癌的阿霉素突变株：青霉素产生菌经诱变，曾分离到能显 著提高青霉素x 有效组分的变株。1 9 7 4 年，我国四环素产生菌一金色链霉素，经过 诱变，获得能合成去甲基金霉素的变株。诱变新霉素产生菌一费氏链霉素，分离出脱 氧链霉素胺的营养缺陷型，进而选出用链霉胺代替脱氧链霉胺，最后获得几种抗生素。 3 0 多年来，国内工业微生物育种工作中，包括抗生素、酶制剂、氨基酸等产生 菌，通过诱变育种都取得卓越的成效，有不少的成功例子，如碱性脂肪酶高产变株 f s l 8 8 4 的选育和灰黄霉素耐前体变株d 一7 5 6 的选育。 1 _ 3 3 诱变育种的步骤和方法 诱变是采用某些诱变剂以人工的方法使遗传物质结构改变，从而破坏细胞的自控 系统，引起细胞物质代谢障碍，使其产生人们所需要的产品，这就是变异。这种变异 对微生物本身来说是使其代谢向着异常方向发展，必然引起菌体基本代谢失调，此时 菌体虽然具有生活能力，但细胞的某些功能却显著地降低了。 诱变育种的一般步骤“4 1 如下，整个流程主要包括诱变和筛选两个部分： 8 南京理工大学硕士学位论文 白腐真菌诱变育种及对染料降解脱色的研究 出发菌株( 沙土管或冷冻管) l 菌株纯化 4 一出发菌株性能测定 制备单孢子悬液 j 一悬浮液活菌计数 诱变剂处理 l 一处理液活菌计数并计算其存活率 中间培养平板涂布 l一形态变异观察并计算其突变率 突变株分离 i 一初筛( 性能粗测) 斜面传代 4 一复筛 放大试验 生产性能实验菌种用于生产，同时进行保藏 诱变育种工作包括诱变突变、突变株的筛选和高产变株最佳环境条件的调整。诱 发突变包括出发菌株、诱变剂及其剂量的选择、影响诱变效果的因素，突变株的筛选 包括筛选条件( 培养基和培养条件) 及选择一个简便、快速、有效的筛选方法，环境 条件调整是突变株的最佳培养条件改变。以上是决定诱变育种成败的三个方面。 诱变育种“。在工业发酵菌种史上创造了辉煌的业绩，它具有方法简单、投资少、 收获大等优点，但它最大缺点是缺乏定向性。对此，除了深入开展诱变机制研究外， 在诱变育种过程中应注意出发菌株、诱变剂及诱变剂量的选择、诱变处理方式方法的 应用，以及结合有效的筛选方法等来弥补不足，以提高诱变育种的效率。 诱变育种的步骤考核方法包括：出发菌株的选择、单孢子( 或单细胞) 菌悬液的 制备，诱变剂及诱变剂量的选择，诱变的处理方法以及纯化分离。 1 3 4 生物育种的诱变剂 凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物 质，称为诱变剂( m u t a g e n ) 。诱变剂1 是自19 2 7 年用x 射线诱发果蝇遗传性状变异 而引起科学工作者注意的。在第二次世界大战中，又发现化学物质氮芥也能导致细菌 性状变异，其效应与x 射线相类似。它们包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂 三大类。 ( 1 ) 物理诱变剂 南京理工大学硕十学位论文白腐真菌诱变育种及对染料降解脱色的研究 物理诱变剂是通常使用物理辐射中的各种射线，包括紫外线、x 射线、r 射线、 快中子、a 射线、射线、微波、超声波、电磁波、激光射线和宇宙线等。其中对 微生物诱变效果较好、应用较广泛的是紫外线、x 射线、r 射线和快中子。物理诱变 剂对微生物的诱变作用主要是由高能辐射导致生物系统损伤，继而发生遗传变异的一 系列复杂的连锁反应过程。其作用过程通常可以分为物理、物理一化学、化学和生物 学等几个阶段。 当用射线处理生物细胞时，细胞首先接受辐射能量，再穿过细胞壁、膜，与d n a 接触，产生一系列的化学反应，从而使生物遗传物质一d n a 发生一系列变化。 ( 2 ) 化学诱变剂 化学诱变剂是一类能对d n a 起作用、改变其结构、并引起遗传变异的化学物质。 化学诱变剂种类很多，从简单的无机化合物到复杂的有机化合物都能引起诱变效应。 这些物质有的是天然的，有的是人工合成的，主要包括四大类：碱基类似物、烷化剂、 移码突变剂以及其他种类等。化学诱变剂的作用机制都是与d n a 起化学作用，诱变效 应和它们的理化特性有很大的关系，例如这些化合物的稳定性以及影响其稳定性的条 件，如温度、光照、p h 的影响、化合物的半衰期以及与溶剂或增溶剂是否起反应等 等。各化学诱变剂介绍如下： 碱基类似物：碱基类似物是一类和天然的嘧啶嘌呤等四种碱基分子结构相似的 物质，是一种既能诱发正向突变，也能诱发回复突变的诱变剂。用于诱发突变的碱基 类似物有5 一溴尿嘧啶( 5 一b u ) 、5 一氟尿嘧啶( 5 一f u ) 、5 一溴脱氧尿嘧苷( b u d r ) 、 5 一碘尿嘧啶( 5 一i u ) 等，它们是胸腺嘧啶的结构类似物；2 一氨基嘌呤( a p ) 、6 一 巯基嘌呤( 6 一m p ) 是腺嘌呤的结构类似物。最常用的碱基类似物是5 一b u 和a p ， 当将这类物质加入到细菌培养基中，在繁殖过程种可以掺入到细菌d n a 分子中，不 影响d n a 的复制。它们的诱变作用是取代核酸分子中碱基的位置，再通过d n a 的 复制，引起突变，因此，也叫掺入诱变剂。显然这一类诱变剂要求微生物细胞必须处 在代谢的旺盛期，才能获得最佳的诱变效果。 烷化剂：烷化剂“”是诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂，这类诱变剂具有一 个或多个活性烷基，它们易取代d n a 分子中活泼的氢原子，直接与一个或多个碱基 起烷化反应，从而改变d n a 分子结构，引起突变。各烷化剂对微生物诱变效应是有 差异的，这主要决定于功能基团作用及数目。据研究报道，甲基烷化剂( 甲基磺酸盐) 的反应速度比乙基烷化剂( 乙基磺酸盐) 要快，毒性大，死亡率高，诱变效应较差。 但如果诱变剂量控制在较小死亡率的情况下，诱变效应还是可以的。综合衡量，乙基 功能基诱变效应比甲基功能基要强，双功能基和多功能基烷化剂比单功能基反应速度 快，如硫芥、氮芥等。总之烷化剂功能基越多，对微生物毒性越多，诱变作用越强； 但由于死亡率高，存活率低，总的突变率也相应降低，所以诱变效应也就较差。 南京理工大学硕士学位论文白腐真菌诱变育种及对染料降解脱色的研究 移码诱变剂：移码诱变剂与d n a 相互结合引起碱基增添或缺失而造成突变。移 码诱变基对噬菌体有较强的诱变作用，尤其是对噬菌体t 2 t 4 ；诱发细菌、放线菌 的质粒脱落比其他诱变基效果更为显著。 化合诱变剂往往具有专一性，它们对基因的某部位发生作用，对其余部位则无影 响。突变大多为基因突变，并且主要是碱基的改变，其中尤以转换为多数。各种具有 诱变作用的化学物质和碱基接触起化学反应，通过d n a 的复制使碱基发生改变而起 到诱变作用的。 ( 3 ) 生物诱变剂1 除了物理和化学诱变剂外，其他因素也可导致染色体结构变异。早在2 0 世纪8 0 年代初，就有人提出生物诱变剂的存在。某些病毒可引起宿主细胞染色体畸变如s v 4 0 病毒、r o u s 肉瘤病毒、带状疱疹病毒均可诱发染色体结构变异和染色体数目的改变。 1 3 5 突变株的分离与筛选 微生物通过诱变因子处理，群体中产生各种类型突变株，其中有正突变型、负突 变型和稳定型，需要经过分离筛选，逐个的挑选出来。对每代筛选出来的好菌株都要 结合调整培养基和培养条件再次筛选。经过连续数代诱变选育，才有可能选育出一个 优良的菌种。 突变是随机不定向的，但是筛选是定向的。筛选的条件决定选育的方向，因为突 变体优良性能总是在一定的培养条件下才能表现出来。在一个适于突变株繁殖的特定 条件下可以筛选到具有新性状的菌株，其他原养型菌株则逐步被淘汰。所以，培养基 和培养条件是决定菌种某些特性保留或淘汰的“筛子”。 为了加快选育进度，缩短每代的周期，提高筛选效率，需要建立一个简便、快速 和准确的检测方法。常规法虽然精确度较高，但相当繁琐，不适合大量菌株的测试任 务，是限制筛选量的最大问题，优良菌株出现的概率也因此受到影响。筛选要根据主 次，分为初筛和复筛。初筛以多为主，即大量挑选诱变处理后平板分离的菌落，尽量 扩大筛选范围。复筛以质和精为主，即把经过初筛获得的少量较优良的菌株进一步筛 选。这种复筛要反复进行几次，并结合自然分离最后才能选育出优良菌种。 菌体诱变处理后，分离在琼脂平板上，由一个突变的单细胞或孢子发育为菌落而 形成一个变异菌株。突变类型很多，归纳起来由两大类，第一类为形态突变株，包括 菌落形态、菌丝形态、分生孢子形态。另一类是生化突变株，包括抗性突变型、营养 缺陷型、条件致死突变型、产量突变型、糖分解突变型等。以上突变株都混合在诱变 处理后的微生物群体中，根据筛选目的，从群体中一个一个的分离筛选出来。 1 4 论文的主要研究内容 对于白腐真菌降解有机污染物，特别是对染料废水的脱色降解，国内外的学者已 经做了一些工作，并且取得了令人鼓舞的成果。但是，到目前为止，国内外真正将白 南京理工大学硕士学位论文白腐真菌诱变育种及对染料降解脱色的研究 腐真菌应用于实际工程，大规模的处理实际染料废水的实例还不多，并且还存在种种 问题。白腐真菌应用于实际工程时遇到的最大障碍生长控制与如何长时间保持胞 外酶浓度，依然没有完全解决。因此，今后的研究重点应该放在生物诱导育种和实用 的反应器设计上。研究白腐真菌的诱变育种及其培育适宜条件来改善白腐真菌的性 能，缩短其产酶时间从而较少其降解染料的启动时间。并且实现最优控制，在消耗较 低的情况下，使污染物去除率达到最高，毒性消减到最低。同时，结合反应器结构的 设计，推进配套实用设备的设计和发展。 本论文以黄孢原毛平革菌( 以下简称p c 菌) 为对象做必要的基础研究，一方 面验证前人的研究结果，掌握p c 菌的基本特性，另一方面为后续研究奠定一定的 基础。 本课题旨在研究p c 菌在降解模式染料过程中，某些因素对于脱色效果的影响， 并且初步进行染料脱色机理的探讨。在此基础上，探讨p c 菌重复脱色能力，并且 诱导驯化p c 菌，使其能够处理难降解的染料。另外，本课题还将通过诱变手段， 对p c 菌进行诱变育种“1 - ”1 ，改变其生理特性，增强p c 菌对高浓度、难降解染料 番红花红的脱色能力。 论文要解决的问题具体分三部分讨论： 第一部分重点讨论p c 菌对模式染料脱色的基本参数优化，具体包括培养时间、 缓冲溶液、溶解氧的浓度和冷藏时间的讨论。 第二部分重点讨论对p c 菌的驯化诱导作用，包括p c 菌重复脱色能力及其驯 化诱导后对染料脱色的影响。 第三部分重点讨论p c 菌的诱变育种。通过选择适当的诱变剂和确定适当的诱 变剂计量，对白腐真菌进行诱变育种，筛选出有利于降解染料废水的优势菌种。在此 基础上，对诱变、筛选得到的优势菌的培养条件进行讨论、优化。 论文研究的主要目标为染料的脱色率，因此重点测定的是不同体系在处理周期内 样品吸光度的变化情况，通过分光光度计的铡定，可以定量表示脱色效果。 总之，本课题的目的是为了进一步深入研究白腐真菌降解染料的能力，通过对 p c 菌驯化诱导来缩短其降解染料的时间，应用两种诱变手段对p c 菌进行诱变， 从而增强菌种对高浓度染料、难处理染料的脱色能力，以及得出诱变菌种的适宜培养 条件，从而为其将来应用于实际工程做好准备工作。 南京理工大学硕士学位论文白腐真菌诱变育种及对染料降解脱色的研究 2 实验材料和基本实验方法 2 1 实验菌种 实验所用菌种为黄孢原毛平革菌( p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m ) ，以下简称p c 菌，购自江苏省农业科学研究院。 2 2 培养基 2 2 1 固体培养基 用于p c 菌的接种和扩大培养，其成分“”和主要制备过程如下： l o o g 新鲜土豆，洗净去皮称重，切成大拇指大小，置于烧杯中，加入5 0 0 m l 水，电炉加热煮沸，在8 0 c 保温并搅拌半小时，使土豆内含物浸出( 或冷却) ，再烧 开，单层纱布过滤，纱布中央垫层棉布。 葡萄糖1 0 9 ，k h 2 p 0 4 1 5 9 ，琼脂l o g ，i d 【g s 0 4 0 7 5 9 ，加入土豆汁中溶解。 一般p h 值不用调节，自然达到4 5 左右。 在1 5 磅( 1 2 1 ) 下灭菌半小时。 2 2 2 液体限氮培养基 国内外对白腐真菌所做的大量研究表明，在限制氮源的情况下，能够激发白腐真 菌的胞外酶降解系统，对诸如染料废水等所含有的难降解有机物进行有效的生物降 解，从而达到脱色的目的。从文献材料中可发现，液体限氮培养基有很多，实验中对 p c 菌采用了k i c k 液体限氮培养基陆1 ，这是相对使用比较广泛的培养基。浅层静培 养实验中所使用的液体限氮培养基具体成分如下： 每升液体培养基中含0 2 9 k h 2 p 0 4 ，0 0 5g m g s 0 4 7 i - i z 0 ，0 o lg c a c l 2 ，1 0 9 葡萄 糖，l m gv b ，l m l 无机溶液，1 2 m m o l 酒石酸铵，以2 0 m m o l l 丁二酸钠为缓冲液， 0 4 m m o l l 苯甲醇代替黎芦醇作为为l i p 的激活剂，其中无机溶液组分