（轻工技术与工程专业论文）麦汁生物酸化的酿造应用研究.pdf

摘要 摘要 麦汁生物酸化技术是以非腐败型啤酒乳酸杆菌为菌种，以啤酒厂未添加酒花的过滤 后头道麦芽汁为培养基发酵生产乳酸，调节糖化过程中糖化醪和麦芽汁的p h 值，以满 足啤酒酿造的需要，可部分或完全替代成品化学酸使用。本文优化了菌种的发酵条件， 对乳酸发酵生产工艺进行了比较和改进，并将生物酸化后麦汁进行啤酒酿造试验。为生 物酸化麦汁的进一步大生产创造条件。并成功在啤酒工厂得到实际应用。 论文采用德氏乳酸杆菌( 菌株t l 5 ) ，适宜生长温度为3 0 5 0 ，当初始p h 为6 0 时晟有利于菌的生长和产酸。经过对发酵乳杆菌产酸性能考察，发酵条件优化为：发酵 温度4 6 ，麦汁浓度1 4 ( w w ) ，环境压力o 0 5m p a 静态培养，产酸速率最快。接种 菌龄对产酸有显著影响，该菌株的发酵极限为1 - 3 。当分割比例为5 0 时，6h 基本 上能恢复到发酵前的起始酸度，当分割比例为1 0 时，2 5h 就能恢复到发酵前的起始 酸度。改进了乳酸发酵工艺，比较了分批发酵、半连续发酵和连续发酵生产工艺。用成 品磷酸乳酸和生物酸化麦汁调酸进行麦汁制备实验并进行啤酒发酵，对比两种麦汁和啤 酒指标。生物酸化麦汁调酸制取的麦汁具有更低的色度，更佳的氨基酸组成和更高的总 氨基酸含量；由此发酵成的啤酒具有更大的发酵度，经品尝，口味柔和、苦味愉悦。 关键词：麦汁，乳酸杆菌，生物酸化，优化 a b s t r a c t a b s t r a c t t h et e c h n o l o g yo fb i o l o g i c a la c i d i f i c a t i o nm e a n sm a tt h ef i r s tu i l l l o p p e dw o r ta r e r m a s h i n gf i l t r a t i o ni st l l ec u l t u r em e d i m na n di ti sp i t c h e dw i t l l 口c 幻6 口c f 刀螂w m c hi s i sn o t s p o i l a g eb a c t e r i 啪i i lt h en o n n a lm a s l l i n gp r o c e s s ，m ew o r tp hv a l u ei sa 由u s t e db yt h e a c i d i c 、v o r tt t l a ti sa d d e di nt 1 1 em a s h i n go r 、v o r tb o i l i n go rb o n l ，w i t h o u ta d d i n go t h e ra c i d st o m e e tt l l en e e do fb e e rp r o d u c t i o n i nt l l i sp a p e r ，t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fm es t r a i n sf o r b i o l o g i c a la c i d i f i c a t i o n 、e r co p t i m i z e d ，t h et e c h r l o l o g yo ff e m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r e i m p r o v e da r l dc o m p a r e d ，甜l dt h eb e e rw 弱b r e w e dw i t hb i o l o g i c a la c i d i cw o r ti nt h el a bs c a l e s t r a i nt l - 5w 嬲u s e di nt h et r i a l i t so p t i m a lg r o w t l lt e n l p e r 砷l r e 、嬲b e t w e e n3 0 t o 5 0 a n dt h ei n i t i a lp hs u i t a b l ef o r 鲈o 、t ha 1 1 da c i dp r o d u c t i o nw 嬲6 0 t h ef - e m e n t a t i o n c o n d i t i o n s 、e r eo p t i m i z e d 嬲f o l l o w s ：l a c t i ca c i dp r o d u c t i o nv e l o c i 锣o f 三乃，聊p ，2 ，“聊w a s f a s t e s tw h e nt h ef e m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ew a s4 6 ，、o r te x t r a c t i o nc o n c e n t r a t i o nw a s 10 ( w m ，r a t i oo fc 缸b o nt 0n i t r o g e n 、v 弱4 8 ，i n v i r o n m e n t a lp r e s s u r e 、v a s0 0 5m p aw i t h o u t a g i t a t i o n t h el a c t i ca c i dc o m e mw 嬲i n n u e n c e d 铲e a t l yb yp i t c m n g 血n e ，a l l dt h el i m i to f l a c t i ca c i dp r o d u c t i o nb yt l l i ss 缸面nw a s1 3 l a c t i ca c i dp r o d u c t i o n 谢t l ld i f f e r e n td i v i s i o n p r o p o n i o n 、v a ss t u d i e d i tw 硒f o 瑚l dt h a tt h ei n i t i a lc o n c e 肋a t i o no f l a c t i ca c i dw a sa c l l i e v e d a r e r6h o u r sw i m5 0 d i v i s i o np r o p o r t i o na i l da r e r2 5h o u r s 谢t h1o d i v i s i o np r o p o n i o n i m p r o v e m e mt h ef e 肌e n t a t i o nt e c h l o l o g y ，c o m p a r e db a t c h ，s e i m - c o n t i n u e da n dc o n t i n u e d f e n n e n t a t i o n t h ew o r tw a sm a s h e dw i t hd i l u t e dp h o s p h o m sa c i da i l dl a c t i ca c i db ys t r a i n t l - 5r e s p e c t i v e l ya n dt h eb e e r 、v 嬲f e n n e n t e d a f b e ra i l a l y s i so fw o r ta n d b e e r ，i tw a sf o u n d t h a tt h ec o l o ro f 、0 r tw i t l lb i o l o g i c a la c i d 、v a sl o w e r ，锄i n oa c i dc o n s t i t u t i o n 、v a sb e t t e r ，a n d t h e 锄i n 0a c i dc o n t e n ta n db e e rf e n i l e n t a t i o nd e 伊e e 、觞h i 曲e r t h eb e e r 、嬲s m o o t ha n d n i c eb i t t e m e s sa f t e r t a s t i n g k e yw o r d s ：、o r t ，三口c 幻6 叩f 淞，b i o l o g i c a la c i d i f i c a t i o n ，o p t i m i z a t i o n i i 独创性：声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 日 期：2 0 0 8 0 3 1 4 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名： 日期：2 0 0 8 0 3 1 4 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 生物酸化技术是指以从麦芽表面分离的非腐败型啤酒乳酸杆菌为菌种，以啤酒厂未 添加酒花的麦芽汁为培养基发酵生产乳酸，调节糖化过程中糖化醪和麦芽汁的p h 值以满 足啤酒酿造的需要，而无须再添加额外酸【l 】。生物酸化技术主要应用在麦汁制备阶段。 啤酒酿造过程中，糖化醪p h 值约5 7 5 9 ，高于此阶段主要酶( p 葡聚糖酶p h4 5 4 8 ， a 淀粉酶p h5 6 5 8 ，d 淀粉酶p h5 4 5 8 和羧基肽酶p h5 2 ) 发挥最佳酶解作用的p h 值 5 4 【。为降低p h 值，一般工厂都添加无机酸( 如盐酸、磷酸) 或有机酸( 如食用乳酸) 。使 用化学添加剂，消费者对此持反对意见。通常认为添加剂是啤酒中的杂质和污染物，一 种更广泛的观点认为，添加剂的使用会降低啤酒品质。公众常用“化学啤酒”来表达对 使用添加剂的不安。目前对在啤酒生产中使用添加剂和加工助剂的批评，越来越时髦。 相当多的公众和啤酒界人士指责添加剂的使用，贬低含有添加剂的啤酒。不幸的是公众 并不容易理解这些争论，导致人们认为这样的酿造是“化学加工 。若使用化学酸，盐 酸是强酸，h + 解离度大，醪液和麦汁p h 值波动较大；食用乳酸等有机酸是弱电解质， 用量大，且国产乳酸会给啤酒带来青涩味，残留杂质影响啤酒质量，进口乳酸虽然口感 好，但价格昂贵；使用生物酸化技术进行酿造则不会存在这些问题【2 p j 。 1 2 国内外研究进展 1 2 1 麦汁生物酸化在国内研究进展 早在2 0 世纪6 0 年代中期，张志强【3 ，4 】撰文介绍了生物酸化法在啤酒生产中的应用；方 心芳教授【3 4 】提出生物酸化的率性培养法；原沈阳啤酒厂芦乃达【3 4 】在1 9 6 7 1 9 6 8 年间曾带 领厂工程技术人员制作生物酸化设备，进行实验并取得成功，部分设备投入啤酒生产使 用。但由于经济条件限制和人们消费意识局限，这一技术未得到广泛应用。近年来，我 国啤酒飞速发展，产量已连续五年居世界第一，市场竞争也愈演愈烈。狠抓产品质量， 下大力气挖掘企业潜力，降低生产成本已成为我国每个啤酒生产厂家的工作重点。 我国绝大多数啤酒生产厂家，为提高产量与原料利用率，提高设备利用率与弥补某 种工艺质量上的缺陷，使用各种酶制剂、澄清剂、抗氧化剂与化学酸类物质等添加剂【4 j 。 生物酸化技术能弥补啤酒酿造过程中的许多不足之处，提高市场竞争力，已在三得利啤 酒( 上海) 有限公司等一些大型啤酒企业中得以应用。 1 2 2 麦汁生物酸化在国外研究进展 生物酸化技术应用始于德国。1 9 0 6 年，德国人o t t of r a n c k e 申请了利用德氏乳杆菌生 产酸牛奶味的啤酒专利。1 9 0 9 年，有人给出生物酸化实验方案。1 9 11 年1 0 月v l b 会议上， w i l h e l mw i n d i s h 教授做了关于“利用德氏乳杆菌人工酸化麦芽浆”的报告，并第一次讨 论了生化参数与酿造技术的影响。接着进行了大量生物酸化实验并取得良好结果。德国 啤酒税法第1 9 条的修改把生物酸化应用推至顶点。但二战后，生物酸化技术几乎被人们 江南大学工程硕士学位论文 遗忘【5 1 。之后随着经济发展，人们对健康要求的提高，2 0 世纪8 0 年代欧洲各国开始运用 乳酸菌生物酸化技术调节糖化醪p h 值以制造口味柔和、淡爽的淡色啤酒，适应市场需要。 1 3 麦汁生物酸化技术的应用 1 3 1 降低糖化醪p h 值的方法 目前，啤酒工业中降低糖化醪p h 值的方法除了改善糖化水质外，经常采用酸化技术， 主要有( 1 ) 添加酸或酸式盐；( 2 ) 添加酸麦芽；( 3 ) 添加生物酸化麦汁。主要对添加酸麦芽 和生物酸化麦汁作一简介。 a 麦芽酸化 酸麦芽指富含乳酸的麦芽，降低糖化醪p h 值，提高淀粉酶活力，促进蛋白酶解。根 据制取工艺不同，制备酸化麦芽方法有三种：( 1 ) 利用大麦表面乳酸菌，在厌氧条件下培 养1 d 使大麦成酸性；( 2 ) 向麦芽喷洒德氏乳杆菌悬液于5 0 下培养2 4 3 6h ；( 3 ) 在4 5 5 0 水中浸泡焙制的浅麦芽，待产生1 乳酸后，将其于5 0 6 0 干燥浓缩至乳酸为2 4 嘣l 酬。 酸麦芽添加量为原料3 5 ，最大可达1 0 。不仅可以促进酶解作用，而且原料利 用率提高o 9 。酸麦芽降低醪液p h0 1 5 o 2 5 时，能提高d 淀粉酶、蛋白酶、外切p 一 葡聚糖酶和磷酸酯酶活性，增加醪液缓冲能力，提高可溶性氮含量，减少丹宁溶解。酸 麦芽会提高啤酒p h 值，因此，糖化醪液酸化后需进行麦汁酸化，使其p h 值降到5 1 。 b 糖化醪和麦芽汁酸化 和麦芽酸化相比，糖化醪和麦汁的生物酸化工艺比较成熟。目前主要采用德氏乳杆 菌( 三d p ，6 r “p c 肪f ) 、食淀粉乳杆菌口删肠甜d ，姗) 、乳酸乳杆菌( p 口c 臃肠c 疗0 ，4 6 4 8 时培养，可抑制其它微生物生长。 通常，乳酸菌产酸水平0 6 0 8 ，有个别可达1 。乳酸含量0 8 的酸化麦汁， 添加量占成品麦汁量的o 5 时可使醪液p h 值下降o 1 【5 】。若麦汁酸化达到p h 值 5 1 5 2 ，不仅能降低麦汁颜色，缩短发酵时间，还能抑制氧化酶活性，改善啤酒风味。 用生物酸化调节醪液或麦汁酸度，酿造用水残余碱度要求 5 度，钙离子含量至少为5 0 m g l 【6 】o 1 3 2 生物酸化对酶活的影响 生物酸化通过降低糖化醪p h 值从而增加糖化过程中主要酶的活力。p 一葡聚糖含量 高低直接影响麦汁过滤性能，生物酸化可提高谷物中d 葡聚糖酶活力。有资料显示，大 麦第一、二道浸麦水进行生物调酸，由凝胶渗透色谱显示麦汁中p 葡聚糖分子量变小【_ 7 1 。 此外，利用生物酸化技术可用部分大麦取代麦芽酿造。b a n arm 等人1 8 j 报道，在生物 酸化基础上，用2 0 大麦代替麦芽不会改变成品啤酒质量。d e i r d r ep l o ，c 等人【9 j 比较 了利用生物酸用5 0 大麦取代麦芽与未用生物酸和全麦酿造，结果显示利用生物酸能 弥补因5 0 大麦带来酶活减少的缺陷。实验中还对不同的4 株菌产生物酸进行发酵实 验对比，结果显示不同菌株生物酸对分解淀粉、蛋白质和葡聚糖能力有区别。可知，乳 酸菌本身能分泌一定量分解淀粉、蛋白质和葡聚糖的酶类。生物酸能提供额外的水解酶。 2 第一章绪论 1 3 3 麦汁生物酸化的优缺点 生物酸化比化学酸化提高酶活更有效，特别是降低p 葡聚糖含量，提高糖化醪过滤 性能方面【_ 7 9 1 。从生物酸化的实验和应用来看，其优点明显。生物酸化技术可以增强原料 中各种酶活性，使分解过程更快更彻底，减少杂菌污染的可能，提高啤酒生物稳定性和 原料利用率，改善麦汁组成和麦汁与啤酒过滤性能，提高产品最终发酵度。麦芽醪p h 值降低，减少金属螯合键连结，增强酵母对锌的吸收，从而抑制副产物生成。麦汁p h 值降低，不仅有利于活性单宁等物质浸出，煮沸时有利于大分子蛋白质凝聚沉淀，而且 更加接近啤酒混浊物主要成分b 一球蛋白等电点，发酵液中蛋白质、多酚组成的冷凝固物 对酵母的影响较少，酵母降糖速度加快，缩短啤酒生产周期，有效提高设备利用率【l o l 。 生物酸化麦汁相对于化学酸化麦汁有更多还原物质，防止多酚氧化，赋予啤酒更好色泽 【1 2 】。此外，乳酸菌能分泌一些天然抗菌物质，抑制多种啤酒污染菌【1 2 16 1 。 当然，生物酸化技术也存在缺点，如可凝固性氮水平较高，苦味值损失大，对糖化 醪酸化中缓冲能力的增加必须再对麦汁进行酸化，麦汁煮沸过程中低的p h 值也导致更低 的酒花异构化程度和更少的d m s 前体分裂范围。然而，在麦汁煮沸过程中通过添加酸化 麦汁可把这些影响降到最低，最好是对糖化醪和麦汁酸化并用【1 ，6 ，r 7 1 。 1 3 4 麦汁生物酸化的要求 无论是麦芽酸化还是麦汁酸化，乳酸菌选择是第一位。 a 对乳酸菌的要求 乳酸菌为革兰氏阳性菌，过氧化氢酶试验呈阴性，微需氧，不产生孢子，不运动， 在显微镜暗视场中能强烈折光。所有乳酸菌中，对麦汁、发酵液与啤酒而言，很多乳酸 菌是有害的( 如厶，加咖p ，、三6 旭v 西，c 伽p f 等) ，但有些乳酸菌无害( 如厶口所) ，肠，淞与 口，穆y 7 d 删c 螂等) 。正是这些无害乳酸菌，使生物酸化技术能在实际生产中应用【4 j 。 被选用的用于麦汁酸化技术的乳酸菌菌种要满足以下各项工艺与质量方面的要求： 1 ) 能很好适应未加酒花的麦汁，生长速度快，高产l 乳酸。乳酸构型分为d 型、l 型、 d l 型。人体只能吸收l 型，过多食用d 型或d l 型乳酸可导致人体代谢功能紊乱， 目前作为食品添加剂的乳酸绝大多数是d l 型b l 引。产酸量大，最终酸含量能达到 1 o 1 5 ，利于有效添加与调整，很好防止与抑制其它杂菌的生长。 2 ) 能适应较高温度生长环境。乳酸菌适合的生长繁殖温度在4 5 5 2 ，最适生长繁殖 温度为4 7 4 9 ，低于3 0 时乳酸菌的生长与繁殖会受到较大抑制。 3 ) 不生成双乙酰、胺类物质与其它影响啤酒风味与口味的不利成份。 4 ) 菌体本身最好含有可分解淀粉、蛋白质、p 葡聚糖等的酶系，能最大限度利用麦汁 中可利用的一切物质，以达到生产目的。 5 ) 菌株应易于分离、纯化和培养。 b 对工艺流程的要求 麦汁生物酸化设备比较简单，一般由繁殖罐与混合添加罐组成，繁殖罐最好安装于 单独的房间内，以防感染生产。乳酸菌在生长、繁殖中有一定温度要求，所以繁殖罐与 江南大学工程硕士学位论文 混合添加罐还要配有加热装置、温度控制装置和保温层。各容器应具有液位显示装置， 以便准确添加新鲜麦汁与酸化处理后麦汁的准确应用。此外，生长罐个数应与糖化生产 中日糖化锅次适应，可以多设置几个生长罐也可以采用容积较大的生长罐，但需要一 个能容纳适应于日糖化生产批次的乳酸麦汁暂存罐，以便糖化生产及时取用。暂存罐也 应有加热装置，可以将罐中暂存的酸化麦汁加热煮沸，便于乳酸添加量的准确计算。图 1 1 是一套简单的麦汁生物酸化流程图。除了设备要求外，对生产工艺也有一定要求【4 】： 1 ) 培养过程中应在c 0 2 环境下进行，因为乳酸菌更适合在厌氧环境中生长繁殖，同时 由于c 0 2 存在可以抑制乳酸麦汁中最主要的杂菌假丝酵母生长与繁殖。如果c 0 2 能以一定压力从容器底部进入，还可以代替机械搅拌，加速液体对流，使乳酸菌生 长繁殖更快，新陈代谢情况更加旺盛； 2 ) 保证在每一批次的糖化生产过程中，能够取用生长罐中5 0 以上的乳酸麦汁量，因 为只有这样才能将前一糖化批次生产中，更多的新鲜无酒花成分麦汁补充到生长罐 中，以提供给乳酸菌良好的生长繁殖环境，保证旺盛的产酸过程。据研究表明，只 有当酸化麦汁中乳酸含量低于o 4 时，才能使乳酸杆菌产酸迅速，当乳酸浓度大于 0 5 时，会使乳酸杆菌的生长繁殖受到抑制作用使产酸进程变得缓慢； 3 ) 为使麦芽中各种酶更好地发挥作用，缩短糖化时间，提高设备利用率，一般可在醪 液中加入酸化麦汁总量的2 5 5 0 ，在煮沸麦汁中加入约7 5 5 0 ，充分保证了 在煮沸过程中，高分子蛋白质的充分凝聚与析出，酒花苦味更加柔和、舒适。 清洗管道 云煮沸锅 图1 1 麦汁生物酸化设备流程图 f i g 1 1f 1 0 wc h a r tb i o l o g i c a la c i d i f i c a t i o ne q u i p m e n t 1 4 麦汁生物酸化技术的应用前景 利用生物酸化技术不仅迎合了人们追求绿色食品的要求，同时能提高啤酒质量，降 低生产成本【1 9 】。单单购买化学药品就是一笔不小的开销，添加到糖化醪和麦汁中的化学 药品由于调酸性能差异，达到相同调酸结果不同化学药品需添加量差异大。有资料显示， 为降低o 1 个单位的麦汁p h 值，每l o ok g 麦芽中需添加酸或盐的量如表1 1 【2 0 1 。从使 4 第一章绪论 用不同化学药品成本比较，使用化学成品乳酸成本最高，使用硫酸钙和氯化钙次之，使 用盐酸和硫酸较小，三者成本大约比例为4 ：3 ：1 。而利用生物酸化技术相对于添加化学 酸或盐能大大地降低生产成本。在德国，生物酸化技术早已编入法律，其他许多国家也 先后采用了生物酸化技术调酸。我国近几年来也加大了对此技术的研究力度【1 7 2 。 表卜1 降低o 1 个单位的麦汁p h 值，每1 0 0 k g 麦芽中需添加酸或盐的量 7 r j a b l e1 - 1t h ed o s a g eo f a c i do rs a l te v e 叫1 0 0k gm a l ti no r d e rt od e d u c eo 1p ho f w o r t 同时，生物酸化技术以其简单易行、投资少、占地面积小、无害与见效快的优势在 啤酒行业中的应用正越来越受到人们的欢迎。总之，随着现代微生物学，尤其是应用微 生物学的发展，生物酸化技术在啤酒酿造工业中将会具有更加广阔的前景。 1 5 课题研究思路与主要内容 综上所述，生物酸化技术消除了化学酸化存在的安全隐患，适合纯酿法生产啤酒， 更有利于健康，走的是绿色食品之路。从啤酒酿造的角度看，生物酸化比化学酸化更有 利于提高酶活的作用，使糖化过程进行得更快更彻底，减少杂菌的污染，从而提高啤酒 的生物稳定性和原料的利用率，改善麦汁的组成成分和麦汁与啤酒的过滤性能，提高产 品的最终发酵度。并且，乳酸菌能分泌一些抗菌物质，可抑制多种啤酒污染菌的生长和 繁殖。总之，生物酸化技术不仅起降酸作用，而且能增加糖化过程中起主要作用酶的活 性，提供天然抗菌物质，提高啤酒质量。此外，从生产角度看还可以降低生产成本。三 得利啤酒( 上海) 有限公司在改扩建生产设备和提高生产能力的项目的同时，提出麦汁生 物酸化技术作为重点战略课题组织立项研究。将啤酒酿造过程走绿色食品之路，在提高 主产品清爽爽快特性，深化与其他产品差异化同时，节约生产成本。在国内没有成熟技 术可借鉴的情况下，研究提高麦汁生物酸化产酸速度，达到可完全替代化学成品酸在麦 汁制备工序的添加。 本论文的主要研究内容： 1 针对生产条件进行乳酸杆菌的产酸条件优化。 2 针对乳酸杆菌的生产工艺研究并应用。 3 生物酸化麦汁在实际啤酒酿造中的应用。 4 生物酸化麦汁的经济效益评价。 江南大学t 程硕l 学位论文 第二章乳酸菌发酵条件优化 2 1 引言 乳酸菌的高产特性不仅由其遗传特性决定，而且也由其所处的环境决定，因此对乳 酸菌进行发酵条件的研究很有必要。在此根据生产情况考察发酵条件对产酸的影响，通 过发酵条件优化提高乳酸菌的产酸量和产酸速率，为工业化生产提供参考以便工业生产 时能缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本。 2 2 材料与方法 2 2 1 主要材料 a 菌种及原料 乳酸菌菌种特征见表2 1 。该菌种由日本三得利酒类研究所提供，从大麦绿麦芽表 面分离得到非啤酒腐败菌的乳酸杆菌经过驯化筛选后保留在m r s 培养基中。 表2 1 乳酸菌菌种特征表 t a b l e2 - 1t h ec h a r a c t e r i s t i co fl a m y l o v o r u s 麦芽：加麦品种芽哈林顿( h a r r i n g t o n ) 。 b 培养基 液体麦汁培养基：麦汁为1 2 ( w w ) 浓度。麦汁煮沸4 0m i n 后添加c a c l2 5 0m l ， 单宁2 5m l ，卡拉胶3 0m g l 。5 0 0m l 三角瓶中装液量为3 0 0m l ，o 0 5m p a 灭菌1 5m i n 。 糖化工艺曲线见图2 1 。 1 0 0 ，、9 0 p 刨7 0 靼6 0 5 0 加 3 0 图2 1 全麦麦汁糖化工艺曲线 f i g 2 - lm 雒h i n gp r o c e s sc u r v e0 fw o r t 固体麦汁斜面培养基：液体麦汁培养基中加2 0 的琼脂，加热溶解后于o 1m p a 灭菌2 0m i n 。 菌种发酵培养基：糖化全麦芽麦汁培养基。 菌种保藏培养基： 6 第二章乳酸菌发酵条件优化 短期保藏( g l ) ：蛋白胨1 0 ：酵母提取物5 ；柠檬酸二铵2 ；葡萄糖2 0 ；牛肉膏1 0 ； 吐温8 0l ；乙酸钠5 ；k 2 h p 0 42 ；m g s 0 4 7 h 2 0o 5 8 ；m n s 0 4 4 h 2 00 2 5 ；c a c 0 31 0 ： p h 6 4 【捌。 1 年冷冻保藏：甘油：磷酸盐缓冲液：菌液= 1 ：1 ：1 其中磷酸盐缓冲液：0 1m o l ，lk 2 h p 0 4 溶液6 1 5m l ，0 1i n o 儿k h 2 p 0 4 溶液3 8 5 m l ，调p h 值为7 o 。 c 主要试剂 无水乙醇、溴钾酚绿、c a c 0 3 、磷酸、苯酚、n a o h 、n a c l 均为a r ，冰乙酸( 优级 纯) ：中国医药集团上海化学试剂公司 柠檬酸、琥珀酸：均为色谱纯，s i g 锄a 公司 2 2 2 仪器与设备 高效液相色谱：美国w a t e r s 公司 d l f u w 2 2 0 5 0 型e b c 磨： 德国b u h l e r - m i a g 公司 协定糖化仪：杭州博日科技有限公司 磁力搅拌器：上海县曹行无线电元件厂 u v 2 1 0 0 型分光光度计：上海合利仪器有限公司 烘箱：上海市实验仪器厂 5 4 1 5 d 型台式高速离心机：法国e p p e n d o r f 公司 s k 21 快速混匀器：江苏环保仪器厂制造 h h b l l 4 2 0 型电热恒温培养箱：山西省医疗器械厂 p h s 2 5 型p h 计：上海雷磁仪器厂 x s s 2 光学显微镜：上海第三分析仪器厂 g z n q v a 核酸蛋白测定仪： 英国b i o c h r o m l t d k l f 2 0 0 0b e n c h t o pf e m e n t e r ： b i o e n g i n e e r i n ga g g u j s ( 2 5 2 5 ) l 机械发酵罐：镇江东方生物工程设备技术有限责任公司 2 2 3 主要分析方法 a 有机酸的分析：h p l c 法 预处理：取5m l 培养液加1 5m l 无水乙醇，混匀后入冷冻冰箱中过夜，取上清 液于1 0 0 0 0r m i n 离心2 5m i n ，取上清液2m l 定容至1 0m l ，用o 4 5 “m 微孔滤膜过滤， 经液相色谱与标准有机酸液作比较，进行定性和定量分析。 色谱条件：色谱柱2 0 r b a s b c 1 8 ，2 5 0 4 6m m ，5 “m ；分离条件( 流动相) ：o 2m o l l k 2 h p 0 4 ，用磷酸调p h = 2 7 ；流速o 5m l m i n ，柱温3 0 ；进样量；1 0 “l ；紫外检测 器，波长2 l o 啪。 b 菌浓测定方法 待测培养液以1 0 0 0 0r m i n 离心5m i n ，弃上清液，加生理盐水离心洗涤后恢复体积， 在振荡器上使菌体打散，在可见光6 0 0 啪处测定吸光值( o d 值) 。对不同o d 值培养液 7 江南大学工程硕士学位论文 进行稀释涂布培养基菌落计数，绘制菌浓与o d 值标准曲线，通过o d 值间接反映菌浓。 c 总糖测定 采用苯酚硫酸法测定总糖含量。配制o 2 5 l 的标准葡萄糖溶液，采用表2 - 2 的配比 进行葡萄糖浓度与o d 值标准曲线的制作，结果见图2 2 。将发酵液稀释到一定浓度后测 定4 8 0 舳处的吸光度，计算发酵液中的总糖，从而确定菌株对糖的利用程度。 表2 2 标准葡萄糖溶液的配制 t a b l e2 - 2t h ec o n f e c t i o n0 fs t a j l d a r dg l u c o s es o l u t i o n 昌 荟 0 0 2o 0 4o 0 6 葡萄糖浓度( 啦m l ) 图2 2 葡萄糖标准曲线 f i g 2 2t h es t a n d a r dc u r v eo fg l u c o s e 2 2 4 产酸条件优化 从发酵温度、搅拌转速、菌龄、发酵液的不同分割比例、麦汁辅料比例和麦汁浓度 等方面对菌株t l 5 产酸性能进行考察，比较不同条件下产酸性能确定该菌株较佳产酸 条件。本章基本发酵条件为“压力对产酸影响”部分在2 5l 罐( 装液量1 0l ) 中进行， 其余在3l 罐( 装液量2l ) 中进行。根据目前企业采用即割即用型酸化工艺，在优化条 件确定前，首先对培养液酸度达到o 8 进行5 0 分割前提下进行实验；考察辅料添加 比对产酸影响前，统一用全麦麦汁；考察麦汁浓度对产酸影响前，用1 5 0 p 头道麦汁。 a 麦芽指标分析 麦芽的性质决定啤酒的性质，为考察麦汁的特性和啤酒的品质，必须了解实验中所 用主原料麦芽的特性，在此，用协定糖化法测定实验所用麦芽的常规指标。 b 接种量对发酵产酸的影响 分别对菌株t l 5 在2 0 、3 0 和5 0 不同的接种量下考察其产酸情况。 c 发酵温度对产酸的影响 菌株t l 5 最佳生长温度为3 5 4 5 ，工厂中通常高温培养进行生物酸化，比较 菌株在1 4 “r w ) 全麦芽麦汁中于4 2 、4 6 和5 0 下静态培养的产酸情况。 8 第二章乳酸茵发酵条件优化 d 搅拌对产酸的影响 因菌株t l 5 属兼性厌氧菌，为考察该菌在静态和连续搅拌情况下的生长和产酸情 况，在此比较了该菌在3l 发酵罐的最低转速1 0 0r m i i l 和静态培养下的乳酸产量。 e 麦汁浓度对产酸的影响 目前啤酒企业多采用高浓酿造技术，头道麦汁浓度较高。在此，考察了1 00 p 、1 2o p 和1 4o p 头道麦汁稀释液对产酸的影响。 f 压力对产酸的影响 对菌株t l 5 在om p a 、o 0 5m p a 和o 1m p a 的环境压力下考察其产酸情况。 g 不同分割比例下生长曲线与产酸曲线的测定 取充分活化并达到对数生长中后期的菌液进行实验，考察了菌株t l 5 在1 0 到 9 0 ，以1 0 间隔不同分割比例下的生长曲线与产酸情况。 h 菌龄对产酸的影响 微生物根据其所处在的生长曲线的不同阶段即菌龄不同会有不同的菌体活力，菌体 活力的强弱直接会影响下一代的生长发酵，因此有必要考察菌株t l 5 的菌龄对产酸的 影响。另外，当环境中的酸度过高时，菌株生长往往会受到抑制，从而产酸速度会减慢。 而实际生产中除了希望发酵液快速达到高酸度外，还要考虑取得更大的生产效率。因此， 在考虑菌龄对产酸的影响时了解菌株产酸能力大小，尽量在酸度达到最大产酸能力大小 时或之前进行分割是提高生产效率的有效方法。 2 3 结果与讨论 2 3 1 麦芽指标分析 用协定糖化法制取麦汁进行麦芽指标分析结果见表2 3 。从表中数据可知，该麦芽 指标除个别符合啤酒麦芽理化标准一等品要求外，大部分符合优等品要求。 表2 3 麦芽指标 t a b l e2 - 3a n a l y s i so f m a l t 2 3 2 接种量对发酵产酸的影响 生物酸化生产酸麦汁一般为半连续方式，即从发酵罐中分割一定比例的酸化麦汁， 9 江南大学工程硕士学位论文 接入一定量的头道麦汁进行发酵。生物酸化的“接种量是指旺盛发酵液占加入新鲜麦 汁后总发酵液的比例。表2 4 是菌株t l 5 不同接种量4 6 下培养2 4h 的各项指标。 表2 - 4 菌株t l - 5 不同接种量下各项指标 1 a b l e2 - 4t h ed a t a so fd i 仟e r e n ti n o c u l a t i o nb ys 仃a i nt l 5 对于菌株t l 5 ，接种量不同时各项指标均有差异，接种量越大，产酸量越大。但 菌浓在接种量为3 0 时最大，接种量5 0 时次之。这可能是由于接种量太大时菌体容 易死亡，所以造成了接种量5 0 时菌浓反而比接种量3 0 时小。双乙酰的量也随接种 量的增大而增大，但发酵2 4h 双乙酰达不到o 1m l ，这对麦汁及成品啤酒的影响不 会很大。考虑到实际生产的可能性，确定接种量为3 0 。 2 3 3 发酵温度对产酸的影响 德氏乳酸杆菌t l 5 在1 4o p 全麦麦汁中于4 2 、4 6 和5 0 下静态培养的产酸 情况见图2 3 。从图2 3 可知，德氏乳酸杆菌在4 6 时产酸速率相对最快。同时考虑高 温培养和产酸速率两个因素，基本可确定4 6 为菌株t l 5 的最适生长和产酸温度。 2 3 4 搅拌对产酸的影响 菌株t l 5 属兼性厌氧菌，为考察该菌在静态和连续搅拌情况下的生长和产酸情况， 首先比较了该菌在3l 发酵罐最低转速1 0 0r m i n 和静态下的乳酸产量，结果见图2 4 。 可知，菌株t l 5 在静态培养下产酸速率更快，因此该菌采取静态培养的方法。 零 删 m 程 j 计 图2 - 3 发酵温度对产酸的影响图2 - 4 搅拌对产酸的影响 f i g 2 - 3e f j 晤c to ft e m p e r a t u r eo np r o d u c i n ga c i d f i g 2 - 4e 妇f e c to fs t i r i n go np r o d u c i n ga c i d 2 3 5 麦汁浓度对产酸速率的影响 目前啤酒企业多采用高浓酿造技术，头道麦汁浓度较高。在此，1 0o p 、1 2o p 和1 4o p 头道麦汁稀释液对产酸的影响，结果见图2 5 。从图2 5 可知，麦汁浓度对产酸量几乎 没影响，由于本公司大生产的麦汁一般都是在1 40 p ，为给菌株提供一个相对稳定的发 1 0 第二章乳酸菌发酵条件优化 酵液浓度，所以，此后的实验中把1 4o p 头道麦汁进行发酵试验。 图2 5 麦汁浓度对产酸的影响图图2 6 压力对产酸的影响 f i g 2 - 5 e 行e c to fd i 髋r e n tp i a t oo np r o d u c i n ga c i d f i g 2 - 6e 伺融c to fp r e s s u r eo np r o d u c i n ga c i d 2 3 6 压力对产酸量的影响 一定的罐压有利于菌体生长，当大肠杆菌受压后，参与呼吸作用的柠檬酸脱氢酶的 活性会明显降低，因此，作者初步考察了压力对产酸的影响，结果见图2 6 。从图2 6 可知，罐内压力对该菌产酸存在明显影响，罐内压力控制在o 0 5m p a 时比罐内没有压 力和罐内压力为o 1m p a 时产酸速率都明显要快。可能适当的压力对菌株t l 5 的碳流 流向有一定的影响，促进3 磷酸甘油醛脱氢酶的合成，使碳流改道走e m p 途径。 2 3 7 不同分割比例下生长曲线与产酸曲线的测定 确定了4 6 的发酵温度和静态培养后，为确定分割比例对菌株生长和产酸的影响， 在此取充分活化并达到对数生长中后期的菌液进行实验，考察菌株t l 5 在1 0 9 0 不同分割比例下的生长曲线与产酸情况，结果见图2 7 和表2 5 。 ： 0 5 孝：鸳 0 2 n ： 024681 01 21 4 时i h j ( h ) 一9 0 p 一8 0 一7 0 一6 0 j 一5 0 一4 0 - 卜一3 0 一2 0 一1 0 图2 7 不同分割比例下的生长曲线 f i g 2 - 7g r o 、坩lc u n ，e0 fd i 胁e n td i v i s i o np r o p o n i o n 从图2 7 可知，在不同的分割比例下，菌株t l 5 达到平稳期所需时间有所不同。 分割比例越小，达到平稳期所需时间越短。9 0 分割比例时需要6h 达到平稳期，而1 0 分割比例时不到3h 即可达到平稳期。 乃加的弱惦 0 0 0 0 0 0 0 0 0 一邑删如甾辞 江南人学工程硕上学位论文 表2 5 不同分割比例下的产酸情况 t h b l e2 5 p r o d u c i n ga c i do nd i a e r e n td i v i s i o np r o p o r t i o n 分割比( )初始酸度( ) 1 2h 酸度( ) 产酸速率方程 从表2 5 可知，分割比越小，起始含菌量越高，起始酸度也高，但经1 2h 培养后达 到的酸度相差不大；从产酸量看，分割比越大，产酸量越大，但1 2h 酸度还不能满足 生产要求，故从产酸速率来看，希望在尽量短的时间内产酸速率更快。从表2 5 可知， 产酸速率和产酸量不成正相关性。分割比例较小，菌体生长较慢，产酸速率较低，随着 分割比例增加，产酸速率逐步增加，但分割比例过大时，会使菌体过度繁殖，消耗大量 营养物质，带入代谢废物，使菌体生长受到干扰提前衰老，使产酸速率降低。 比较图2 7 和表2 5 发现菌体生长和产酸有一定的对应关系，但不成线性。图2 7 显示，当分割比例为5 0 9 0 时，菌体都要近6h 达到平稳期，而表2 5 显示，分割比 例为5 0 9 0 时的产酸速率相差不明显，而5 0 分割更利于生产操作，且6h 达到的酸 度较高，故选定用5 0 的分割比例进行后续实验。 2 3 8 菌龄对产酸的影响 对2 3 7 中不同分割比例实验的发酵液继续静置培养4 8h 后测乳酸含量，不同的分割 比例组中测得的乳酸含量相当都为1 3 。在乳酸发酵过程中，细胞内不断代谢产生乳 酸，并通过转运体系将其转运到细胞外。由于乳酸的积累，胞外p h 逐步降低，虽然细胞 膜对胞外离子的半通透性和细胞质的缓冲作用可以保护细胞，维持胞内p h 的稳定，但当 胞内外p h 相差较大时，这种保护作用就会降低，造成胞内p h 的下降。由于乳酸菌细胞 内大多数涉及碳水化合物和氨基酸代谢的酶的最适p h 在近中性范围内，因此培养基的 p h 如果一直处于较低值的话，胞内p h 的降低就会影响菌体的新陈代谢，即而进一步影 响细胞的生长繁殖，从而环境酸度会达到一个相对稳定的酸值，因此，有必要了解菌株 t l 5 的菌龄对产酸的影响，确定出菌体活力最旺盛的时间再进行分割培养以保证连续生 产过程中的菌体活力。同时以此测定菌株t l 5 的产酸能力大小以指导企业生产。在考察 这两方面前都必须先确定进行实验的合适分割比，为能在尽量短的时间内确定出该菌的 产酸能力，作者分别考察了7 0 、5 0 和1 0 分割比例下的产酸情况。结果见图2 8 。 由图2 8 可知，当接种量3 0 ，发酵温度为4 6 ，麦汁浓度为1 4 ( w 、v ) ，环境 压力为0 0 5m p a ，静态培养1 2h 。在不同的分割比例下，因l o 分割比例的剩余酸度 1 2 第一章乳酸苗发酵条件优化 高，相比之下在唰样6h 内，1 0 分割比例的增酸比前两种情况都大因此选择用1 0 的分割比例柬进行产酸能力大小值的测定。 l 习1 0 的分割比例留下的发酵液过大从刚2 8 的生长曲线不能很好地确定分割时 叫因此，每小时啦样，重新测定1 0 分割比例下的生长曲线，结果见图2 1 0 。 从圈2 - 9 可知，1 0 分割比例下，3 h 葡浓达到最高值，而当菌体处于对数生长的中 后期时活力旺盛，故确定取2 5 h 作为分割时间。为在尽量短的时间内测出菌株的产酸能 力，对充分活化的菌株扩培液一直培养，取培养液的不同酸度作为起始酸度进行分割培 养，结果见图2 1 0 。 縻 10 2 0 8 1 o6 1 o3 9 幽 1 0 苗龄对产酸的影响 留2 - 9 1 0 分割比例r 的生k 曲线 f i g 9 c u w c0 f 0 d o n l o d i v i s o n 分割次数 图2 1 1 产酸能力大小的测定 f 嘻2 l oe 目酣o f d i 厅