（微生物学专业论文）黑曲霉eim6聚半乳糖醛酸酶基因的克隆和表达.pdf

福建师范大学强慧妮硕士学位论文 关键词：黑曲霉聚半乳糖醛酸酶生物信息学分析异源表达共发酵 i i i f j i a b s t r a c t a b s t r a c t p o l y g a l a e t u r o n a s eo f t h ep e c t i n a s ef a m i l yi so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tc o m p o n e n t si n d e g r a d i n gp e c t i na n dw i d e l yu s e di nm a n yf i e l d si n c l u d i n gi n d u s t r y , a g r i c u l t u r e ，e t c i n t h i ss t u d y , t h ep o l y g a l a c t u r o n a s eg e n ew a sc l o n e df r o map e c t i n - p r o d u c i n ga s p e r g i l l u s n i g e r e i m 一6s t r a i na n de x p r e s s e di np i c h i ap a s t o r i sg s1 15 b a s e do nt h e r e c o m m i n a n t s ，w el a u n c h e dt h ee f f i c i e n c ys t u d yo fp o l y g a l a c t u r o n a s et ot h ew h o l e e n z y m e s 1 1 1 ep o l y g a l a c t u r o n a s eg e n ew a sf i r s tc l o n e db a s e do nt h ee x t r a c t e da s p e r g i l l u sn i g e r e i m 一6g e n o m i cd n aa st e m p l e t a f t e ro n - l i n eb l a s tc o m p a r i s o n ，r e s u l t ss h o wt h a tp g ag e n e w a sl16 3b pi ns i z ei n t e r r u p t e db yo n ei n t r o ns i t e di n2 0 0 2 5 0 b pa n de n c o d e dap o l y g a l a c t u r o n a s e o f3 7 0a m i n oa c i d sw i t ha p p r o x i m a t em o l e c u l a rm a s so f3 8k d a f u r t h e r m o r e ，t h ep r i m a r y s t r u c t u r e ，t h eh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n s ，a n dt h es p a t i a ls t r u c t u r ea n do t h e ra s p e c t sw e r e a n a l y s i z e da n dp r e d i c t e d 1 1 1 es t u d i e ss h o w e dp o l y g a l a c t u r o n a s eh a dh i g hs i m i l a r i t yt ot h o s e r e p o r t e da n i g e rp o l y g a l a c t u r o n a s e s n ee d n as e q u e n c eo fp o l y g a l a c t u r o n a s eg e n ew a sa m p l i f i e db yu s i n go v e r l a p p c ra n dt h e c o d i n gr e g i o no fp g aw a s o b t a i n e d t h ep o l y g a l a c t u r o n a s ee d n aw a ss u b c l o n e di n t op e t 3 0 a v e c t o ra n dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t oec o l ib l 21 t h ep o l y g a l a c t u r o n a s e w a so v e r e x p r e s s e di nec o l is t r a i nb l 21a f t e ri n d u c t i o nb yi p t qb u tt h ep o l y g a l a c t u r o n a s e a c c u m u l a t e di nt h ec e l l si na ni n s o l u b l ef o r ma si n c l u s i o nb o d i e s s o ，t h ee n c o d i n gg e n eo f p o l y g a l a c t u r o n a s ew a si n s e r t e di n t ot h ep l a s m i dp p i c 3 5 ka n dw a ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di n p i c h i ap a s t o r i sg s115u n d e rt h ec o n t r o lo fm e t h a n 0 1 t h ec u l t u r i n go ft h er c o m b i n a n tp i c h i a p a s t o r i ss t r a i ny i e l d e da na d d i t i o n a lp r o t e i nb a n dw i t ha na p p r o x i m a t em o l e c u l a rm a s so f3 8k d a i ns d s - p a g e t h em a x i m u ma c t i v i t yo fr e c o m b i n a n tp o l y g a l a c t u r o n a s ew a s5 6 0 u m li nt h e c u l t u r em e d i u m t h eo p t i m u mp ha n dt e m p e r a t u r ei s4 0a n d5 0 cr e s p e c t i v e l y , w h i c ha r et h e s a m ea st h a tf r o mw i l ds t r a i n b a s e do nt h er e c o m b i n a n tp i c h i ap a s t o r i ss t r a i n ，t h ei m p r o v e m e n te f f i c i e n c yo ft h e p o l y g a l a c t u r o n a s et ot h ew h o l ep e c i n a s ee n z y m e sw a ss t u d i e d i nt h er e s e a r c ho f c o f e r m e n t a t i o nu s i n gw i t hp o l y g a l a c t u r o n a s ea n dp e c t i nl y a s ee n g i n e e r i n gs t r a i n s ，w e f o u n dt h a tw h e nt h ei n i t i a li n o c u l u mb e t w e e nt h et w ow e r ee q u a l ，t h ec o l o ro ft h e h y d r o l y s i s c i r c l e so nt h ep e c t i np l a t ew a ss i g n i f i c a n t l yd e e p e rt h a nt h a tf r o m i n d i v i d u a lr e c o m b i n a n t a n dt h ee n z y m a t i cp r o p e r t i e so fp o l y g a l a c t u r o n a s ea n dp e c t i n l y a s eh a v en o tb e e nc h a n g e d t h ew h o l er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee f f e c t f r o m i i i c o f e r m e n t a t i o no n p e c t i n d e g r a d i n gw a sg r e a t e rt h a nt h a tf r o mt h ei n d i v i d u a l k e y w o r d s ：a s p e r g i l l u sn i g e r ；p o l y g a l a c t u r o n a s eg e n e ；b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s ； h e t e r o l o g o u se x p r e s s i o n ；c o f e r m e n t a t i o n i v i 童 ，r 咚 j 中文文摘 中文文摘 果胶酶作为一种生物催化剂，与其他的化学催化剂相比有着明显的优越性， 它是指能降解果胶物质的一大类酶，有广泛的用途。作为果胶酶系中比较重要的 一种酶聚半乳糖醛酸酶，它的应用尤为广泛，它可以在果胶酯酶的预先作用 之下，较彻底的水解果胶。本实验以一株产果胶酶的黑曲霉e l m 6 为出发菌株。 根据聚半乳糖醛酸酶基因的保守性的特点，参照已知的聚半乳糖醛酸酶基因序列 设计引物，以黑曲霉e i m 6 的全基因组为模板，成功的克隆到聚半乳糖醛酸酶 基因。通过将所克隆到的聚半乳糖醛酸酶基因在线提交n c b i 数据库分析得知， 该酶基因的保守性很高，且在基因内部约2 0 0 2 5 0 b p 的位置为内含子区域，故通 过重叠延伸p c r 的方法将内含子部分去掉，得到了聚半乳糖醛酸酶的成熟肽基 因。通过生物信息学软件分析可知该聚半乳糖醛酸酶的成熟肽基因序列全长为 1 1 1 3 b p ，可以翻译成3 7 0 个氨基酸，蛋白酶的分子量为3 8 k d 。此外，还分析和 预测了该聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列，氨基酸组成，疏水作用，空间结构等方 面，研究结果得出，来自各个家族的聚半乳糖醛酸酶具有非常保守的作用位点， 而且它们大都有明显的信号肽，这是分泌蛋白所必备的。这也说明聚半乳糖醛酸 酶是一种可溶于水，且可以分泌到胞外一种酶。 实现了黑曲霉聚半乳糖醛酸酶成熟肽基因的异源表达。首先，在原核表达体 系中，构建原核高效表达载体p e t 3 0 a p g a ，并用c a c l 2 法转化原核表达宿主大 肠杆菌b l 2 1 ，然后利用i p t g 诱导聚半乳糖醛酸酶成熟肽基因的高效表达。通 过s d s p a g e 电泳对表达产物验证发现：大肠杆菌b l 21 能够成功的表达外源 的聚半乳糖醛酸酶成熟肽基因，水解圈法以及d n s 法验证和测定酶活无法检测 到表达的聚半乳糖醛酸酶的活性，表明所表达的聚半乳糖醛酸酶蛋白在宿主细胞 中以无活性的包涵体形式存在着，且该包涵体无法实现复性。原因可能是原核表 达宿主不具有对外源真核基因的翻译后修饰和折叠的功能，且不能实现信号肽功 能的正常发挥，所以外源蛋白的正常功能被破坏，且丧失了分泌的能力。随后我 们尝试在真核毕赤酵母表达体系中表达黑曲霉聚半乳糖醛酸酶成熟肽基因。将聚 半乳糖醛酸酶的成熟肽基因克隆到真核表达载体p p i c 3 5 k 上，电转化真核表达 宿主一巴斯德毕赤酵母g s l1 5 ，甲醇诱导之后分别用s d s p a g e 电泳，水解圈 法以及d n s 法测定酶活来验证表达结果。结果标明：聚半乳糖醛酸酶的成熟肽 v 福建师范大学强慧妮硕士学位论文 基因已经成功的在毕赤酵母g s l1 5 中实现了表达，并分泌出了分子量大小约为 3 8 k d 且有活性的聚半乳糖醛酸酶蛋白，酶活初步验证为5 6 0 个单位。通过对聚 半乳糖醛酸酶做初步的酶学特性分析得知，聚半乳糖醛酸酶的最适作用温度为 5 0 。c ，最适p h 为4 0 ，与野生的酶特性完全一致。同时，这些酶学性质的特点 决定了聚半乳糖醛酸酶在酶制剂工业中将会有很大的应用前景，值得继续深入的 进行研究。 目前，对于果胶酶提高酶活的方法一般采取d n a s h u f f i l i n g 技术或者原始菌 株的紫外诱变等，对于采取共发酵研究的报道很少，本实验对此进行了尝试。利 用获得的聚半乳糖醛酸酶基因重组菌株，进一步开展聚半乳糖醛酸酶对整个果胶 酶系其他组分的共发酵和增效研究。首先在初步优化的培养基中，研究二者接种 量的不同对整体酶活的影响。初步研究发现当二者的接种量相等时，各成分在甲 醇诱导的过程中，最佳的产酶时间没有改变，而且从果胶板的水解圈验证可以看 出，二者共发酵的发酵液的水解圈颜色明显比二者单独培养的发酵液的水解圈的 颜色要深。而且对二者共发酵产物，进行各自的酶学特性研究发现和单独培养时 相比也没有发生改变。结果表明果胶降解酶中的聚半乳糖醛酸酶和裂解酶两个组 分的协同作用效果要大于单独组分这说明黑曲霉聚半乳糖醛酸酶基因和裂解酶 基因工程菌株的共发酵研究有值得进一步研究下去的深远意义，具体的研究有待 继续进行。 v i 目录 目录 摘要i a b s t i a c t 中文文摘 目录 i 者论1 第一节课题背景1 第二节果胶酶2 第三节聚半乳糖醛酸酶及其克隆表达研究6 第四节课题研究内容、目的及意义1 2 第一章黑曲霉e i m - 6 聚半乳糖醛酸酶基因的克隆1 5 第一节前言1 5 第二节材料与方法。1 5 第三节结果与分析1 7 第四节小结与讨论2 3 第二章聚半乳糖醛酸酶基因的生物信息学分析2 5 第一节前言2 5 第二节材料与方法2 5 第三节结果与分析2 6 第四节小结与讨论3 5 第三章黑曲霉e l m 6 聚半乳糖醛酸酶基因的异源表达。3 7 第一节前言3 7 第二节材料与方法。3 7 第三节结果与分析4 4 第四节小结与讨论5 4 第四章黑曲霉聚半乳糖醛酸酶和裂解酶基因工程菌株的共发酵研究5 7 第一节前言5 7 第二节材料与方法5 7 第三节结果与分析6 0 v i i 福建师范大学强慧妮硕士学位论文 第四节小结与讨论6 5 第五章结论与展望6 7 附蜀乏 参考文献7 1 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果7 9 致谢8 1 个人简历8 3 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明8 5 v i i i 绪论 绪论 第一节课题背景 酶作为一种生物催化剂，与其他的化学催化剂相比有着明显的优越性，其主 要特点表现在不仅催化效率高、专一性强，而且作用条件温和。鉴于此，酶被广 泛地运用于工业，农业等各行各业的生产中【l 】。一百多年前，酶已经作为一种商 品被应用到实践中，经过这么多年的发展，在国民经济中，酶工业已经发展成为 一项非常重要的高科技产业。在工业酶制剂的生产市场中，全球已经发展出上百 个有名的酶制剂企业，其中发展较快，较成熟的要数丹麦的诺维信公司，它在全 球占有的市场份额居然达到5 0 的，而美国的杰能科公司位居其后，占有的市场 份额为2 5 左右。全球其他的酶制剂生产企业仅占有剩余的市场份额【2 1 。从整体 来看，工业上使用的酶制剂基本上划分为二大类：水解酶类和非水解酶类。和全 球其他酶制剂工业相比，中国的酶制剂工业起步较晚，但是多年来一直保持着较 高的发展速度【3 】。从世界酶制剂行业来看，我国酶制剂行业的整体发展特点是生 产规模小，技术开发力量薄弱，投入力量尚不足，产品单一，结构不合理等，要 将我国酶制剂工业的落后面貌进行完全的改观，还需要投入更大的人力，物力等 方面的技术支持。 在目前的发展中，果胶酶已经成为酶制剂工业中备受关注的一种酶，它是指 能水解果胶的一大类酶。而聚半乳糖醛酸酶又是果胶酶中尤为重要的一种，它在 造纸、饲料、食品等领域的应用效果已经被多数农业、工业等生产领域所认可【4 j 。 但在聚半乳糖醛酸酶的生产方面尚有很多问题迫切需要我们去解决：首先，酶的 产量远不能满足需要；其次，聚半乳糖醛酸酶的使用范围和酶的稳定性的问题等 等。所以开发耐热、酸、碱、高温的聚半乳糖醛酸酶是人们非常迫切的一种需要。 虽然聚半乳糖醛酸酶的研究已经达到分子水平，但是目前国内聚半乳糖醛酸酶的 生产主要还主要是靠高产菌株的筛选及发酵条件的优化来实现，同时来源于多种 微生物的聚半乳糖醛酸酶基因也已被克隆，并在多种宿主( 如大肠杆菌，酿酒酵 母等) 中尝试了表达，但产量都不高，难以满足生产需要【5 1 。 福建师范大学强慧妮硕士学位论文 2 1 果胶 第二节果胶酶 果胶是聚半乳糖醛酸的复合物质。极易溶于水，分子量大约为5 万一 3 0 万。在合适的条件下，果胶自身溶解于水并形成凝胶或者部分被甲酯化， 残留的羧基单元以游离酸的形式存在或形成铵盐、钾钠和钙盐等嘲。 ，i q , l l l t 址 一擅自 n ，t 甘串l u t i l l l r , 1 哟 l 芹t 一 中缸l , l a j , i a 皋x t l , h t l t t i l l i t | 矾 f i g 1s t r u c t u r eo fp e c t i n 果胶的分布很广泛，主要存在于植物细胞的细胞壁和细胞内层，起到支撑细 胞内部物质的作用。对于不同的蔬菜，水果等，其口感有明显的差异，主要是它 们内部果胶含量的不同以及果胶分子结构差异所致。部分水果的果皮中所含的果 胶量可以超过3 0 ，如柑橘、柠檬、柚子等水果，故它们是果胶物质的最重要的 来源。各种果胶物质的组成并不完全相同，根据组成果胶的糖的不同可以初步将 果胶分成同质多糖和杂多糖两种类型：其中同质多糖型果胶如d 半乳聚糖、l 阿拉伯聚糖和d 半乳糖醛酸聚糖等；果胶最常见的形式要数杂多糖果胶了，它 的主要组成部分包括半乳糖醛酸聚糖、半乳聚糖和阿拉伯聚糖，其中各组分的比 例各异，统一称之为果胶酸【7 1 。其次，来源不同的果胶物质，其组成成分的比例 是不固定的，对于部分甲酯化的果胶酸一般称为果胶酯酸。天然果胶中约2 0 6 0 的羧基被酯化，分子量在2 万4 万之间。果胶粗品的颜色主要一般以白色为 主，其中会略带黄色，以粉末状的形式存在。溶于水之后会形成粘稠的无味溶液， 所带电性呈现负电。果胶的应用尤为广泛，主要应用于化工行业，如造纸以及 2 绪论 食品加工领域和医药饲料等方面【8 9 1 。 2 2 果胶酶及其基因 果胶酶是一类能够降解果胶物质的一大类酶的统称。目前，国内外在 果胶酶方面的研究正在广泛深入地进行。根据最常见的分类方法可以把果 胶酶分成如下几种： 2 2 1 原果胶酶 b r i t o n 等人【1 0 】将原果胶酶定义为能够将原果胶分解为可溶于水的高聚合体 果胶的一大类酶。根据原果胶酶作用机制的差异，可以粗略的划分为两种类型： a 型原果胶酶与b 型原果胶酶。其中，a 型原果胶酶主要作用于原果胶内部的多 聚半乳糖醛酸区域，这种类型的原果胶多数存在于酵母或者酵母状真菌的发酵液 中 1 1 1 。而b 型原果胶酶主要作用部位是与原果胶外部连接的聚半乳糖醛酸链和 细胞壁组分的多糖链。有人已经从枯草芽孢杆菌等菌株中成功的分离出了这两类 不同的原果胶酶【1 2 】。a 型原果胶酶具有3 种类型：p p a s e f ，p p a s e l 和p p a s e s 。 它们具有相似的生物学特性，首先它们的分子量很相近，大约为3 0 k d a 。不同的 是p p a s e f 是酸性蛋白酶，而另外两种p p a s e - l 与p p a s e s 是碱性蛋白酶。与a 型原果胶酶的情况相似，b 型原果胶酶也有3 种类型：包括p p a s e b ，p p a s e c 和p p a s e t ，分子量分别为4 5 k d a ，3 0 k d a 和5 5 k d a 。等电点也有稍微的差异， p p a s e b 和p p a s e c 的等电点( p i ) 在9 0 左右，而p p a s e t 的等电点是8 1 ，它们 主要作用于各种柑橘皮以及其他的植物组织，释放出果胶物质【l 3 1 。 在对原果胶酶的研究中，其活力的测定也是人们比较关注的问题。原果胶酶 的活力一般是采用咔唑硫酸比色法进行测定，其中，果胶的浓度是通过半乳糖醛 酸标准曲线检测d 半乳糖醛酸的量得到的。另外，鉴于原果胶酶的作用原理， 人们还研究出了它的另一种测定方法，即根据原果胶酶能够使原果胶分解为可溶 于水的果胶，而且在反应中伴随着底物溶液黏度的下降，故可用黏度下降法即用 底物黏度下降的百分比来评价其酶活力【1 4 】。 3 福建师范大学强慧妮硕士学位论文 2 2 2 聚半乳糖醛酸酶 聚半乳糖醛酸酶是指在水环境下降解聚半乳糖醛酸链的一种果胶酶，具有非 常广泛的用途。它的不足之处在于只能作用于果胶酸，它必须要在果胶酯酶的预 先作用将原果胶降解为果胶酸之后，才能发挥对果胶的水解作用n 朝。根据其水解 作用的特点，聚半乳糖醛酸酶主要分为内切和外切聚半乳糖醛酸酶两种类型n 6 1 。 纵观目前的研究情况来看，聚半乳糖醛酸酶的酶活测定方法最常用的是d n s 法， 它是根据产物半乳糖醛酸的量变来测定的n 。 2 2 3 果胶裂解酶 果胶裂解酶是指能够在不需要果胶甲酯酶的辅助作用下降解高度酯化果胶 内部的糖苷键的一种果胶酶【1 8 】。它能够在非水环境下，通过p 消旋的方式断裂 糖苷键，然后在半乳糖醛酸的c 4 和c 5 之间形成了一个双键，最终产物为半乳糖 醛酸寡聚糖，依据其产物中存在有非还原端，故最常用盐酸法来测定裂解酶的酶 活【1 9 2 0 1 。 2 2 4 果胶酯酶 果胶酯酶能够辅助果胶去甲酯化，将果胶转变成果胶酸。能产生果胶酯酶的 生物主要有植物、植物病原菌和真菌。果胶酯酶的应用也越来越普遍，目前，关 于对果胶酯酶的生物学特性，理化特性和遗传学特性研究作了详尽的阐述报道很 多【2 1 2 2 1 。根据果胶酯酶的作用原理，人们已成功的摸索出了测定其酶活的方法， 主要以羧基的产生量作为评价酶活的指标，这种方法称为滴定法，或者采用气相、 液相色谱仪来根据甲醇的生成量来评价酶活【2 3 】 表1 果胶酯酶的酶学特性【2 4 】 旦坠! 宝! 里i 2 竺坠呈翌i 型丝曼也z ! 坐2 生翌i 型p 翌p 盟皇12 兰2 翌呈堡竺塑皇! ! 竺垒! 里! 竺! m o l e c u l a r o p t i m u m o p t i m u m o p t i m u mp h s o u r c e o f p e p l k m 要! i g 坠f 些1 21 粤p 璺虫堡p 丛垒q i ! e z ：氅i ! e r h o d o t o r u l as p e r w i n i ae h r y s a n t h e r n ib 3 4 1 a s p e r g i l l u sn i g e r 9 6 - 9 9 1 o l 4 06 05 0 4 9 - 9 0 5 05 0 - 9 0 4 55 0 4 绪论 2 3 果胶酶在工业，农业等方面的应用 2 3 1 果胶酶在食品工业方面的应用 果胶酶在食品工业方面的应用主要集中在果汁果酒的酿造方面。在果汁酿造 中，果胶酶的水解作用使果汁由浑浊变的清澈透亮，且这种方法还具有快速、简 便等特点。这种方法在苹果、猕猴桃、桑椹、草莓果汁等方面已得到成功的应用 【2 5 - 2 6 1 。由于植物细胞壁中含有大量的果胶物质，所以在原料中添加果胶酶可以 破碎植物细胞壁，辅助淀粉酶的作用，提高其发酵效率，降低发酵液粘度，这在 很大程度上有助于降低生产成本，有利于企业的规模化生产【2 7 1 。此外，果胶酶 还在许多高档天然食品添加剂中常作胶凝剂，稳定剂，增稠剂，乳化剂， 悬浮剂，增香增效剂等，还可以作为保健品使用【2 8 3 们。随着果胶酶的研究的 更加深入，果胶酶在食品方面的应用将更加广泛和普遍。 2 3 2 果胶酶在饲料工业方面的应用 果胶酶在很早的时候就已经被应用于饲料工业。果胶主要来源于水果等的皮 质部分，故传统饲料中含有大量的果胶，果胶是一种天然高分子化合物，具有良 好的胶凝化和乳化稳定作用，所以它们都不能或者很难被单胃或无胃的动物所利 用，需要果胶酶的降解作用才得以完成。其次，由于果胶物质本身结构的特殊 性决定它具有较强的持水性，可以明显的影响小分子吸附活性和表面活性，这也 就决定了它具有较强的抗营养作用，加入果胶酶就可以有效的解除果胶的这种作 用，同时，果胶酶使细胞壁得以破碎，从使营养物质释放出来，更有利于动物的 吸收3 羽。 2 3 3 果胶酶在农业方面的应用 除了上述用途之外，果胶酶还广泛的应用于木材防腐，环境保护，污 染物软化处理等农业方面【3 3 1 。人们把果胶酶和其他多种酶包括纤维素酶、 淀粉酶、半纤维素酶、脂肪酶等联合起来共同作用来去除棉花上的胶状物。 5 福建9 币范大学强慧妮硕士学位论文 这种方法的优越性就在于它取代了以往用有毒且具有腐蚀性的苏打水的方 法，而且这种方法更安全，对生态环境更有利，明显的起到了环境保护的 作用3 5 j 。随着生物技术的不断向前发展，果胶酶在农业领域将得到更广 泛的应用。 2 3 4 果胶酶在医药方面应用 果胶酶的广泛应用还表现在医药方面。果胶酶的很多降解产物可以直 接应用在内服类医药保健品上，有降低血糖，血脂，减少胆固醇，疏通血管等 作用，有的还可用于外用类药物中，对保护皮肤，防止紫外线辐射，冶疗创口等 都有一定的作用【3 6 】。在医药方面，果胶酶最典型的应用是在单细胞产品的制备 上，单细胞产品是指生物组织在果胶酶的作用下转化而形成的单细胞悬液， 它可以保护营养成分不会被破坏，还能够稳定存在而且容易被酶类消化， 它也可以作为美容类药用产品中的_ 一种活性成分，可以起到保湿，抗氧化， 抑制黑色素生成等作用【3 7 1 。其次，研究表明果胶酶的水解产物寡聚半乳糖 醛酸是植物防御反应中的诱导因子，它可以产生具有抑菌活性的抗毒素， 抑制蛋白的合成而被广泛应用于抗菌药品的生产上t 3 8 1 。 除此而外，果胶酶在其他方面也有较广泛的用途。比如在纺织业方面，特别 是在对棉、麻等织物进行煮练加工和整理修饰的工艺工程中，在比较缓和的条件 下即可去除其中的果胶物质，既能保证产品的质地，又能使织物有很好的手感【3 9 4 0 1 。总的来说，果胶酶在纺织品加工产业中业已占有了非常重要的地位。随着研 究的深入，果胶酶的应用将会越来越广泛【4 l 】。 第三节聚半乳糖醛酸酶及其克隆表达研究 3 1 聚半乳糖醛酸酶及其催化动力学研究 聚半乳糖醛酸酶属于果胶酶的一种，它在有水的环境下使聚半乳糖醛酸链水 解成简单的半乳糖醛酸，应用广泛【4 2 】。它只作用于果胶酯酶的水解产物果胶酸， 所以聚半乳糖醛酸酶必须在果胶酯酶的协助下才能彻底完成水解。在分类方面， 一般根据聚半乳糖醛酸酶的水解机理分为内切聚半乳糖醛酸酶和外切聚半乳糖 醛酸酶【4 引。但是这两种酶的分布不尽相同，研究发现，内切聚半乳糖醛酸酶广 泛分布于真菌和细菌中，在一些高等植物和寄生于植物的线虫中也发现了此种 6 绪论 酶。相对而言，外切聚半乳糖醛酸酶主要由植物产生，产生外切聚半乳糖醛酸酶 的微生物较少【4 4 1 。对于聚半乳糖醛酸酶的催化动力学研究，主要从如下几个方 面进行：酶作用的热稳定性、p h 值稳定性、米氏常数和最大反应速度以及金属 离子对酶活的影响等。研究发现，聚半乳糖醛酸酶的最适作用温度范围一般集中 在4 5 6 0 ，当温度低于最适温度的时候，酶的活性不能充分发挥，但是当提高 到最适温度的时候，酶仍可以充分的发挥作用，在高于最适温度的范周内作用， 酶很容易失去大部分活性，且酶活性不可逆。聚半乳糖醛酸酶主要是一种酸性酶， 最适作用p h 值一般集中在3 5 5 0 之间，在中性和碱性条件下，聚半乳糖醛酸酶 的构象很容易改变，导致酶活力丧失【4 5 1 。各种聚半乳糖醛酸酶的米氏常数和最 大反应速度存在明显的不同，曾有研究表明，即使来自同一株黑曲霉的两种聚半 乳糖醛酸酶的米氏常数和最大反应速度都存在很大的差别，k m 分别为 1 7 1 5 m g m i 和5 7 1 m g m i ；v m a x 分别为7 5 3 u m o l m in - 1 m g 1 和1 0 4 4 u m o l m i n 1 m g 1 。在低离子强度和高离子强度下都会导致聚半乳糖醛酸酶活力下降， 主要是因为离子强度在维持酶的构象方面起着非常重要的作用，而且不同的聚半 乳糖醛酸酶的最适离子强度相差也很明型4 6 1 。 3 2 聚半乳糖醛酸酶的分子生物学研究 许多微生物聚半乳糖醛酸酶基因业已得到克隆、测序和分子生物学方面的分 析和研究，部分聚半乳糖醛酸酶已经得到了分离和纯化，并完成了它们的生物学 特性、理化特性和遗传学特性等方面的研究f 4 7 “8 1 。聚半乳糖醛酸酶的最初来源 是植物，人们首先开展了植物聚半乳糖醛酸酶基因的分子生物学方面的研究，如 尝试实现白菜聚半乳糖醛酸酶基因的克隆和序列分析，有的还成功的实现了其在 大肠杆菌中的成功表达【4 9 1 。起初人们主要通过对产果胶酶的菌株进行改造，如 通过紫外诱变等手段试图提高果胶酶的整体酶活。但是通过紫外诱变手段改造过 的菌株，虽然整体酶活性有所提高，但是诱变之后菌株的稳定性明显下降，在连 续传种接代两到三次就需要重新进行单胞分离，这给大型工业生产方面带来很多 不便【5 0 1 。果胶酶是以酶系的形式存在和发挥作用的，所以只得酶系中的各个组 分分别研究。由于聚半乳糖醛酸酶应用的广泛性，人们很早就开始了对聚半乳糖 醛酸酶分子方面的研究，这种研究还多半集中在对其基因的克隆、测序以及分子 生物学方面的分析上【5 l5 2 1 。 目前，随着多种优良的真核表达系统的建立和完善，人们对于聚半乳糖醛酸 7 福建师范大学强慧妮硕士学位论文 酶的研究将更加深入，同时，它也将促使了分子生物学的快速发展。 3 3 聚半乳糖醛酸酶的结构特点和酶学性质 研究发现，真菌的聚半乳糖醛酸酶基因具有很高的保守性，它们都是基因家 族2 8 的成员，氨基端都有一段长度为1 6 - 2 2 个氨基酸残基的信号肽序列，而 且它们的一级结构中也有一些保守的氨基酸残基，研究发现这些保守的氨基酸残 基均是属于芳香族的，在这些芳香族残疾中，有些片断和残基在所有的家族成员 中都是保守的，推测到这些残基可能参与酶和底物的结合或与酶的活性中心有关 【5 五5 4 】。通过氨基酸序列比对还发现，在所有报道的聚半乳糖醛酸酶中，都有一 些稳定分子结构的二硫键，通过对这些半胱氨酸在整个聚半乳糖醛酸酶蛋白分子 中位置的分析可以反映不同来源的聚半乳糖醛酸酶在分类学上的位置，因为在所 有真菌的内切聚半乳糖醛酸酶中，这些半胱氨酸的位置十分保守，其中有两个二 硫键在所有的真菌聚半乳糖醛酸酶中都存在，这些二硫键的存在在整个蛋白质分 子中起着非常重要的作用，它既可以保证蛋白质三级结构的稳定性，又可以通过 折叠将有活性的氨基酸残基暴露在蛋白质的表面，利于酶活性的正常高效的发挥 瞪引。鉴于聚半乳糖醛酸酶基因序列的保守性，人们一般通过p c r 扩增或筛选基 因组文库来完成聚半乳糖醛酸酶基因的克隆【5 6 5 8 】。 聚半乳糖醛酸酶在酶学特性方面也存在一些共性。通过研究发现大多数聚半 乳糖醛酸酶的分子量为2 0 6 0 k d ，等电点为偏酸性。如常现青霉的内切聚半乳糖 醛酸酶的分子量为2 0k d ，等电点为5 6 ，外切聚半乳糖醛酸酶的分子量为7 4k d ， 等电点为4 2 。黑曲霉中1 0 个内切聚半乳糖醛酸酶，分子量大多为3 5 - - 6 0 k d ， 只有另外一种内切聚半乳糖醛酸酶的分子量为8 0k d ，等电点为3 2 6 2 【5 9 】。 表2 聚半乳糖醛酸酶的酶学特性【2 q t a b l e2b i o c h e m i c a la n dp h y s i c o c h e m i c a lp r o p e t i e so fs o m ep o l y g a l a c t u r o n a s e s t 2 4 j s p e c i f i co p t i m u m m o l e c u l a r o p t i m u m t e m p e r a t u r ep h s o u r c eo f p g a s en a t u r e p la c t i v i t y k m t e m p e r a t u r e weight(kda)phs t a b i l i t y s t a b i l i t y , 4 s l ”r g i l l u s e n d o 3 8 ( p gi1 5 6 - 3 04 0 5 5 - j a p o n l c u s e n d o 6 5 ( p 1 31 112 3 3 04 0 5 5 - m u c o r f l a v u s40 8 3 - 4 52 5 - 5 54 01 5 - 6 0 t h e r m o c o c c u se n d o 3 55 95 8 9 0o 1 35 55 o6 04 o - 6 5 8 t b a c i l l u ss p 酗m n l o p e n i c i l l i u m f r e q u e n t a n s a s p e r g i l l u s a 啪l l l q o r l y e r s 加i a e n t e r o c o l i t i c a b a c i l l u s l i c h e n i f o r m i s s c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u m s t e r e u m p u r p u r e u m s c l e r o t m 缸 b o r e a l i s s a c c h a r o m y c e s p u s t o r i a m s s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a el m l 8 b f u s a r i u m f s p 1 y c o p e r s c i s a c c h a r o m y c e s m a r x i a n u s e n d o 6 5 0 ( 3 1 ) e n d o 3 $ 0 m i i ) e x o e x o 9 8 2 3 7 5 0 绪论 o 1 2 0 7 2 4 3 4 3 2 8 - 4 3 2 o 4 6 5 0 5 i 4 55 85 41 36 07 05 07 0 1 1 0 6 3 7 9 2 5 7 l 1 6 1 8 50 0 5 9 6 14 8 7 6 36 6 e x o3 8 e n d o 4 2 ( p g 8 4 8 e n d o 4 1 5 t m 8 m 4 8 e n d o 4 2 ( p g i a ) 8 5 e n d o 4 4 ( p g l m 8 5 e n d o 4 6 ( p g i c ) 8 5 - 4 8 8 4 1 6 4 5 7 e n d o4 07 52 0 8 8 4 35 40 6 2 4 3 e x o 3 8 e n d o3 9 撇r x m n u s e n d o 4 9 6 ( p g i i ) 6 0 e n d o 4 9 6 ( p g i l l ) 6 3 0 8 o 5 5 o 5 8 4 05 0 5 04 0 - 6 0 6 91 1 o 5 0 5 0 4 0 2 5 5 0 5 o 5 o - 7 5 7 5 7 5 7 o - 1 1 0 4 0 5 05 05 02 5 5 5 5 0 4 2 4 54 5 6 91 1 0 7 o 1 1 0 2 8 7 0 4 74 5 5 55 0 4 5 - 6 0 1 0 1 6 1 0 2 1 0 7 8 9 福建师范大学强慧妮硕士学位论文 3 4 聚半乳糖醛酸酶的来源 聚半乳糖醛酸酶的来源颇为广泛，其最早在植物中发现，这可能与它所能降 解的底物直接相关，由于果胶物质主要存在于植物的细胞壁中。目前已经从白菜， 草莓，长把梨，甘蓝花粉粒，番茄，棉花，苹果，柿子，甜瓜等植物中分别克隆 到聚半乳糖醛酸酶基因，并做了生物学信息方面的分析【6 0 啦】。研究表明，许多物 种如拟南芥、玉米和烟草的花粉中也存在高水平的外切聚半乳糖醛酸酶的活性， 而且许多花粉特异基因与已报道的聚半乳糖醛酸酶基因的同源性很高，并由此可 推断花粉特异基因可能为多聚半乳糖醛酸酶的同源基因。 黪摊 膨删势爱蟹蔟疆襄择纫辩 缪列登鬻磅簇嘏名酵 基潍t 幸 c 托船f 甜i 怕l 知m i 用瞪s p 毫 “) 懒 e 啦渤，6 嚣孵搿嗍 触籍粕邺z 幸9 lm嚣。渤蝴 f 5 1 鲁5 6 3嬲f 魏糟3触4 弱粥臼涫g 痧删辨_ a y 2 鼢6 9 铀粕( 8庸瓣a；25擀押n函哇z8 棚辨塔 l 1 9 s , 7 9s 喇。 织晦饿承擀i ba | 确泓酾 略0a 加酶艄n m ，l 绷l 鳍 f g a i 妣l 刖x i # 翎轴嫩黼u w 蹲t a 嚣 d 啦i 4 彻a y 0 9 6 5 j 4p g a 一； 巧嚣善伽煳妇 琰搭4 毒砬脱秘m b 触擒酗翻瞄x 7 1 0 2 0 峋搿| 施触缈鲥 譬u 拟3 l 娩嬲舭翻缸绷 粕m - t 2 9 9 辐戌秘7 融翊翎m r m t u mu朝71了口9 t 1 趟i m sm 嚣b群辩* ll 妊ll 双弘势 a 糟赫矗啦誊阮l 涮矗箍4x 了3 2 ：2 舟舀a a ，睹目鼯l _ 瓢m l 嚣掰撼毫秘 j 移 。屯托h 措a 0 0 3 3 5 鼻c 疆j 图2g e n b a n k 数据库中的植物p g 基因【6 3 】 f i g 2p l a n tp gg e n e si ng e n b a n kd a t e 6 3 】 此外，微生物聚半乳糖醛酸酶也得到了广泛深入的研究。聚半乳糖醛酸 酶在真菌中的存在尤为普遍，如人们很早就通过真菌菌株的筛选和优化发酵 条件的方法来提高聚半乳糖醛酸酶的活性。例如通过优化黑曲霉固态发酵培 养基来实现聚半乳糖醛酸酶的高产【硎。人们还从黑曲霉发酵的果胶粗酶液中 分离纯化出内切聚半乳糖醛酸酶以及果胶裂解酶。后来人们还从樟疫霉中成 功克隆到聚半乳糖醛酸酶基因并通过测序验证，以及进行了遗