（植物学专业论文）细胞分裂素调节拟南芥花发育的研究.pdf

英文缩略表 r e v e r s et r a n s c r i p t i o n a s e n a a cs o d i u ma c e t a t e醋酸钠 o d o p t i e a ld e n s i t y 光密度 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 r n a r i b o n u c l e i ca c i d核糖核酸 r n a s e ar i b o n u c l e a s ea核糖核酸酶a r p m r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e辕吩钟 r t - p c rr e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r反转录p c r s a ms h o o ta p i c a lm e r i s t e m苗端分生组织 s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e十二烷基硫酸钠 s s cs t a n d a r ds a l i n ec i t r a t e标准柠檬酸盐溶液 s t es o d i u mc h l o r i d e ，t r i s c i ，e d t a 氯化钠、t r i s c 1 、e d t a 缓冲液 b u f f e r s u ls u l f a d i a z i n e磺胺嘧啶 t b o t o l u i d i n eb l u e o甲基苯胺蓝o t e嘶s c i ，e d t a b u f f e rt f i s c 1 e d t a 缓冲液 瞄s t r i s h y d r y x y m e t h yl a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 t w e e n - 2 0 p o l y o x y e t h e n e 2 0 s o r b i t u m 吐温一2 0 t z t r a n s z e a t i n反式玉米素 x 。g a l 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l d g a l a5 溴4 氯3 吲哚一p - d 半乳糖苷 。 e t o s i d e y e py e a s te x t r a e ta n dp e p t o n em e d i u my e p 培养基 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研 究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要 贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本 人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规 定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质 本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：垄丝阎 导师签名：熟缔 日期： 山东农业大学博士学位论文 细胞分裂素调节拟南芥花发育的研究 专业：植物学 指导教师：张宪省教授 博士研究生：李兴国 摘要 细胞分裂素在植物生长发育的许多方面具有重要作用，如促进细胞分裂、延缓叶的 衰老以及抑制顶端优势等。近年来，人们在模式植物拟南芥和水稻中相继克隆到细胞分 裂素代谢的相关基因，初步建立了细胞分裂素信号传导途径的模型，但有关细胞分裂素 调控拟南芥花序和花发育分子机理的资料仍然较少。 在拟南芥中，细胞分裂素生物合成的第一步主要由7 个a t p a d p 异戊烯基转移酶 ( a t i p t l 和a t i p t 3 a t i p t 8 ) 催化完成。本研究构建了花和花器官特征决定基因 a p e t a l a l ( a p l ) 启动子驱动a t l p t 4 的表达载体并转化野生型拟南芥，试图通过位置 特异性表达细胞分裂素合成酶基因提高植物体局部的细胞分裂素含量，探讨细胞分裂素 调节拟南芥花发育的分子机理。 表型分析的结果显示，a p i ：i p t 4 转基因植株的顶端优势被强烈抑制、花序轴伸长 被抑制、花和花器官数量增加、萼片上产生较多分枝的表皮毛。解剖学的证据显示， a p i ：i p t 4 植株的花序分生组织体积明显增大，但其组织结构未受影响，细胞体积没有 变化，暗示转基因表达细胞分裂素合成酶基因促进花序分生组织的细胞分裂。扫描电镜 的观察结果表明，a p i ：i p t 4 植株花原基的数量显著增加，花器官的分化延迟。g u s 表 达分析的结果显示，在a p i ：i p t 4 植株的花序分生组织中，c l a v a t a 3 ( c z 乃) 表达的 区域扩展，在花中的表达时间延长，而w u s c h e l ( 删s ) 表达的信号减弱，表明维持 干细胞活动的基因参与细胞分裂素对花序和花发育的调控。 r t - p c r 的结果显示，转基因植株中的a t l p t 4 的转录水平明显提高。为进一步阐明 表型产生的生理学基础，我们利用高效液相- 质谱法( l c m s ) 对内源细胞分裂素的含 量进行了测定。结果表明，在转基因植株花序中具生理活性的细胞分裂素异戊烯基腺嘌 呤( i s o p e n t e n y l a d e n i n e ，i p ) 及其直接的前体物一异戊烯基腺苷( i s o p e n t e n y l a d e n o s i n e ，i p r ) 的水平显著提高。上述结果提示，转基因植株的表型是由高水平细胞分裂素诱导产生的。 为深入理解细胞分裂素调节花序和花发育的分子机理，我们以幼花序为材料，利用 细胞分裂素调节拟南芥花发育的研究 拟南芥全基因组芯片( a f f y m e t r i xa m b i d o p s i sa t h lg e n e c h i p s ) 进行了基因表达谱分析。 结果显示，转基因植株中有4 6 0 个基因的表达水平上升，4 0 8 个基因的表达量下降。对 部分基因进行的半定量r t - p c r 验证结果与芯片的数据基本一致。其中，a 类细胞分裂 素响应调节因子a r a b i d o p s i s r e s p o n s e r e g u l a t o r ( 彳艘) 基因a r r 5 、a r r 6 、a r r 7 和a r r l 5 、n a c 基因家族成员c u p - s h a p e d n z e d d ( c ) 基因c u c 2 和c u c 3 以及l a t e r a lo r g a n b o u n d a r i e s ( l o b ) 基因家族成员l o bd o m a i np r o t e i n ( l b d ) 基因l b d 3 、l b d 3 9 和l b d 4 1 的表达水平均被显著上调。 过量表达l b d 3 ( n a i t o 等，2 0 0 7 ) 和c u c 3 ，导致植株矮化，这与a p i ：i p t 4 植株 的表型具有相似性；c u c 3 突变或过量表达反义l b d 3 则能够部分抑制a p h ：i p t 4 植株 表型( 包括顶端优势和花节间长度等) 的产生。上述结果表明l b d 3 和c u c 3 参与 a p i ：i p t 4 植株表型的形成。遗传学和r t - p c r 分析的结果显示，细胞分裂素受体的突 变体砌彪砌船几乎完全阻断a p h ：i p t 4 植株表型，抑制细胞分裂素对c u c 3 和l b d 3 表达的上调作用。遗传学分析的结果表明a r r 5 突变加强a p h ：i p t 4 植株的表型，a r r 6 突变能够部分抑制a p i ：i p t 4 植株的表型，并降低l b d 3 的转录水平，而a r r l 5 对 a p i ：i p t 4 植株的表型没有明显影响，提示a r r 5 、a r r 6 和a r r l 5 在调节拟南芥花序和 花发育方面具有不同的功能。本研究的结果表明细胞分裂素信号传导部分地通过介导 c 蚴和l b d 3 的表达，调控拟南芥花序和花的发育。 关键词：拟南芥；花序；花；细胞分裂素；细胞分裂素信号传导 2 c y t o k i n i n - 。r e g u l a t e df l o w e rd e v e l o p m e n ti na r a b i d o p s i s m a jo r ：b o t a n y s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o r p h d ：l ix i n gg u o z h a n gx i a ns h e n g a b s t r a c t 乙y t o k i n i n sa r ee s s e n t i a lr e g u l a t o r so fn u m e r o u sp l a n tg r o w t ha n d d e v e l o p m e n tp r o c e s s e s i i l 彳阳6 劬芦捃，g e n e se n c o d i n gt h ee n z y m e sr e s p o n s i b l ef o rc y t o k i n i nm e t a b o l i c a c t i v i t ys u c h 嬲b i o s ) ，1 1 t h e s i sa n dd e g r a d a t i o nh a v eb e e nc h a r a c t e r i z e d ，a n dt h e c y t o k i n i ns i g n a l i n g t r a n s d u c t i o nw a si m p l i c a t e di nc o n t r o lo fs h o o tm e r i s t e mi n i t i a t i o n ，s t e m c e l lp o p u l a t i o i l ， 印1 c 甜d 0 嘶n a n c ea n df e r t i l i t y h o w e v e r ，l i t t l ea r ek n o w n a b o u tt h em e e h a n i s m so fc v t o k i n i n r e g u l a t i o ni ni n f l o r e s c e n c ea n df l o w e rd e v e l o p m e n t t h ef i r s ts t e po ft h eb u l ko fc y t o k i n i nb i o s y n t h e s i si s c a t a l y z e db ys e v e na t p a d p 1 s o p e n t e n y l t r a n s f e r a s e s ( a t i p t la n da t i p t 3 一a t l p t 8 ) i na r a b i d o p s i s h e r e w et r i e dt 0 i n c r e a s et h ec y t o k i n i nl e v e li na r a b i d o p s i sf l o r a lt i s s u e sb yt r a n s g e n i ce x p r e s s i o no f a t l p t 4 u n d e rt h ec o n t r o lo ft h ep r o m o t e ro fa p e t a l a 1 ( a p l ) t h a ti sk n o w nt ob ee x p r e s s e d s p e c i f i c a l l yi nf l o w e rp r i m o r d i aa n dp e r i a n t hi n a r a b i d o p s i s t o t a l l y ，4 5i n d e p e n d e n t 彳p ，j ? 伊心l i n e so b t a i n e ds h o w e dt h es i m i l a rp h e n o t y p i c a la l t e r a t i o n sw i t hr e s p e c tt 0t h e 1 n n o r e s c e n c ea n df l o w e rd e v e l o p m e n t i na p i ：i p t 4 p l a n t s ，t h ea p i c a ld o m i n a l l c ea 1 1 ds t e m e l o n g a t i o no fp r i m a r yi n f l o r e s c e n c ew e r es i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e d ，w h i c hr e s u l t e d i 1 1t h e f o r m a t i o no fs y m p o d i a lb r a n c h i n ga r c h i t e c t u r e b o t ht h ef l o w e ra n df l o r a l o r g a nn u m b e r n o w e v w e r ei n c r e a s e do b v i o u s l yi nt r a n s g e n i cp l a n t s i na d d i t i o n ，m a n yb r a n c h e d t r i c h 0 i n e s f o r m e do nt h ea b a x i a ls u r f a c eo f s e p a l s a se x p e c t e d ，n oo b v i o u sm o r p h o l o g i c a lc h a n g e sw e r e o b s e r v e n d u r i n gt h ev e g e t a t i v ed e v e l o p m e n t i nt h e l o n g i t u d i n a ls e c t i o n so fp r i m a r v i n f l o r e s c e n c ea p e x ，t h ec e l ln u m b e ra n ds i z eo fi n f l o r e s c e n c em e r i s t e m 、c r ei n c r e a s e d i n t r a n s g e n i cp l a n t s ，w h e r e a st h em e d s t e m a t i cc e l ls i z ew a sn o ta l t e r e d ，i n d i c a t i n ge l e v a t e dc e l l d i v i s i o nr a t eo c c u r r e di nt h et r a n s g e n i ci n f l o r e s c e n c em e r i s t e m s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y a n a l y s e si n d i c a t e dt h a tt h et r a n s g e n i ep r i m a r yi n f l o r e s c e n c em e r i s t e mw a s l a r g e ri nd i 锄e t e r t h a nw i l d - t y p eo n e t h e r ew e r em o r ef l o w e rp r i m o r d i af o r m e da tp e r i p h e r yo fi n f l o r e s c e n c e m e r i s t e mo f a p i ：i p t 4p l a n t si nc o m p a r i s o nw i t ht h a to fw i l dt y p ep l a n t s ，h o w e v e r , t h ef l o r a l o r g a ni n i t i a t i o nw a sd e l a y e d f u r t h e r m o r e ，g u ss t a i n i n ga s s a yr e v e a l e dt h a tc l av at a 3 ( c z r 3 ) a n dw u s c h e l ( w u s ) ，t w og e n e sr e s p o n s i b l ef o rs t e mc e l lh o m e o s t a s i sm a i n t e n 捌瞳c e w e r ei m p l i c a t e di nc y t o k i n i n - r e g u l a t e di n f l o r e s c e n c ea n df l o w e r d e v e l o p m e n t 3 细胞分裂素调节拟南芥花发育的研究 t ou n c o v e rt h ep h y s i o l o g i c a lb a s i sf o rm o d u l a t i n gf l o w e rd e v e l o p m e n ti na p i ：i p t 4p l a n t s ， w ea n a l y z e dt h e e n d o g e n o u sc y t o k i n i nl e v e l s i n t h ey o u n gi n f l o r e s c e n c e sf r o mt h e h o m o z y g o t i cp l a n t s o ft w o i n d e p e n d e n tl i n e s 、i t l l t h e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m a s s s p e c t r o m e t r y ( l c m s ) m e t h o d c o m p a r e d w i t h w i l d - t y p es a m p l e s ，t h el e v e l so f i s o p e n t e n y l a d e n i n e ( i p ) a n di t sp r e c u r s o r , i s o p e n t e n y l a d e n o s i n e ( i p r ) ，w e r ea l le l e v a t e d s i g n i f i c a n t l y , w h i c hi sc o n s i s t e n t 、析mt h ei n c r e a s eo ft r a n s c r i p tl e v e lo fa t l p t 4d e t e c t e di n t r a n s g e n i c l i n e s b yr t - p c ra n a l y s i s t h e s er e s u l t ss u p p o r to u rh y p o t h e s i st h a tt h e p h e n o t y p i c a la l t e r a t i o n so fa p h ：i p t 4p l a n t ss h o u l db ec a u s e db ye n h a n c e de n d o g e n o u s c y t o k i n i nc o n c e n t r a t i o ni ni n f l o r e s c e n c et i s s u e s t oe x p l o r et h ec y t o k i n i n - r e s p o n s i v eg e n e si nf l o r a lt i s s u e s ，w ec a r r i e do u tt h ea n a l y s i sf o r t h eg e n o m e w i d e e x p r e s s i o np r o f i l i n g i n y o u n gi n f l o r e s c e n c e su s i n gt h ea f f y m e t r i x a r a b i d o p s i sa t h 1g e n e c h i p s ( g e n ec o m p a n yl i m i t e d ) t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a t4 6 0g e n e e x p r e s s i o nl e v e l sw e r eu p r e g u l a t e da n d4 0 8g e n e sd o w n - r e g u l a t e di nf l o r a lt i s s u e so f t r a n s g e n i cp l a n t s a m o n gt h e m ，w ea r ei n t e r e s t e di nt h o s ei n v o l v e di nc y t o k i n i ns i g n a l i n ga n d f l o w e rm o r p h o g e n e s i si n c l u d i n gt h et y p e - aa r r s ( a r r 5 ，a r r 6 , a r r 7 , a n da 艘1 5 ) ，t w o c u p s h a p e dc o t y l e d o ng e n e s ( c u c 2a n dc u c s ) ，t h r e el o bd o m a i np r o t e i ng e n e s ( l b d 3 ，l b d 3 9a n dl b d 4 1 ) e i t h e rl b d 3 ( n a i t oe ta 1 ，2 0 0 7 ) o rc u c 3o v e r e x p r e s s i o nl e dt os t e me l o n g a t i o nr e d u c t i o n w h i c hi ss i m i l a rt ot h a to f a p i ：i p t 4p l a n t s i nc o n t r a s t , c u e 3m u t a t i o no ro v e r e x p r e s s i o no f a n t i - s e r l $ el b d 3r e p r e s s e ds o n i ca s p e c t so fa p i ：i p t 4p h e n o t y p e si n c l u d i n gs h o o ta p i c a l d o m i n a n c ea n di n t e m o d el e n g t hb e t w e e nf l o w e r s t h e s er e s u l t sr e v e a l e dt h a tb o t hc u c 3a n d l b d 3c o n t r i b u t e dt ot h ed e v e l o p m e n t a lc h a n g e so f a p i ：i p t 4p l a n t s g e n e t i ca n dm o l e c u l a r a n a l y s e sd e m o n s t r a t e dt h a tc o m b i n a t i o no fc y t o k i n i nr e c e p t o rm u t a n t i o na h k 2a n da h k 3 b l o c k e da l m o s tt h ep h e n o t y p e so f a p h ：i p t 4p l a n t s ，a n di m p a i r e dt h eu p r e g u l a t i o no fc u c 3 a n dl b d 3i nr e s p o n s et oc y t o k i n i n s f u r t h e r m o r e , w ee x a m i n e dt h ef u n c t i o n so f a r r 5 ，a r r 6 a n da r r l 5i na p i ：i p t 4i n f l o r e s c e n c e s 。强er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tm u t a t i o ni na r r 6m a y p a r t i a l l yi n h i b i t e dt h ed e v e l o p m e n t a la l t e r a t i o n so fa p i ：i p t 4p l a n t s ，a n da t t e n u a t e dl b d 3 e x p r e s s i o nl e v e l t h u s ，t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tp r o p e rd e v e l o p m e n to fi n f l o r e s c e n c ea n d f l o w e rm i g h tb ep a r t i a l l yc o n t r o l l e db yc y t o k i n i ns i g n a l i n g m e d i a t e dc u c 3a n dl b d 3 f u n c t i o n si nt h ei n f l o r e s c e n c ea n df l o w e rm e r i s t e m k e y w o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ；i n f l o r e s c e n c e ；f l o w e r ；c y t o k i n i n ；c y t o k i n i ns i g n a l i n g 4 山东农业大学博士学位论文 1 刖置 1 1 细胞分裂素的新陈代谢、转运和信号传导 1 1 1 细胞分裂素的结构 2 0 世纪5 0 年代，m i l l e r 等从鲱鱼精子d n a 高压灭菌后的水解产物中分离到一种能 够促进植物细胞分裂的物质，化学成分为6 糠基氨基嘌呤，将其命名为激动素( k i n e t i n ) ( m i l l e re ta 1 ，1 9 5 5 ；m i l l e re ta 1 ，1 9 5 6 ) 。随后，人们从未成熟的玉米胚乳中首次分离获 得天然的细胞分裂素一玉米素( l e t h a m ，1 9 7 3 ) 。目前已知在植物体内存在多种形式的细 胞分裂素( m o ka n dm o k ，2 0 0 1 ) 。 天然的游离态细胞分裂素主要是n 6 位侧链取代的一系列腺嘌呤衍生物( m o ka n d m o k ，2 0 0 1 ) 。根据侧链的结构，细胞分裂素分为类异戊二烯形式细胞分裂素和芳香族形 式细胞分裂素。类异戊二烯形式细胞分裂素包括含n 6 异戊烯基侧链的异戊烯基腺嘌呤 类和含n 6 位羟基化异戊烯基侧链的玉米素类细胞分裂素，而芳香族形式细胞分裂素含 量极微。在植物体内，细胞分裂素主要有异戊烯基腺嘌呤( i s o p e n t e n y l a d e n i n e ，i p ) 、反 式玉米素( t r a n s z e a t i n , t z ) 以及它们的核苷、核苷酸形式( 图1 1 ) 。反式玉米素的侧链 饱和后转变为二氢玉米素( d i h y d r o z e a t i n ，d h z ) 。苄基腺嘌呤( b a ) 属于天然的芳香族 类细胞分裂素。细胞分裂素的种类及其含量因植物种类、组织类型以及发育阶段不同而 出现差异。例如，在拟南芥中，反式玉米素和异戊烯基腺嘌呤类细胞分裂素是最常见的 形式；然而，在玉米和水稻中，细胞分裂素的主要形式为顺式玉米素类( k a k i m o t o ，2 0 0 1 ； v e a c he ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 在人工合成的细胞分裂素中，激动素( k i n e t i n ) 属于芳香族类细胞分裂素；苯基脲 类化合物如二苯脲、c p p u 、除草剂t h i d i a z u r o n ( t i ) z ) 等虽不具备细胞分裂素的结构 形式，但具有与细胞分裂素相似的生理功能以及较强的生理活性( m o ka n dm o k , 2 0 0 1 ) 。 1 1 2 细胞分裂素的生物合成 目前已知细胞分裂素的生物合成有2 种途径即t r n a 的降解和从头合成。由于某些 t r n a ( 例如丝氨酸) 中临近反密码子处含有异戊烯基化的腺苷酸残基，因此，降解后 的t r n a 也可能是细胞分裂素的来源之一( k i e b e r , 2 0 0 2 ) 。t r n a 降解后释放出的顺式玉 米素随即在玉米素异构酶的作用下转变为生理活性形式一反式玉米素( v r e m a ne ta 1 ， 1 9 7 2 ；m o ka n dm o k ，2 0 0 1 ) 。考虑到植物体内存在大量的细胞分裂素，而t r n a 的转换效 率很低，经该途径形成的细胞分裂素只占总量的极少部分，因此，t r n a 降解途径仅是 细胞分裂素调节拟南芥花发育的研究 t l o c l l l 气 _ 6 瓤e 啪哆搬娃哇n 睁斟l 譬耋| 吐霉( b a ) q 曩上器。 稚雠畦 k i n e t i n h d i h y d r o z c a t i n 瓢 、c 糍 z e a t i nr i b o s i d e ( - l s o p m t y l ) a d e n i n e z m t i nr i b o t i d e 位 图1 1 细胞分裂素的分子结构( k i e b e r , 2 0 0 2 ) f i g 1 - 1m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f c y t o k i n i n s ( k i e b e r , 2 0 0 2 ) 细胞分裂素生物合成的次要途径。 细胞分裂素的从头合成途径最早在发网菌( d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m ) ( 一种黏菌) 中发现。发网菌的异戊烯基转移酶能够催化二甲基丙烯焦磷酸( d m a p p ) 和腺苷酸 ( a m p ) 的结合，但不能使d m a p p 与a t p 、a d p 或c a m p 结合( t a y a , 1 9 7 8 ) 。实验 表明其最初的反应产物为异戊烯基腺苷酸( i p m p ) ，继而，异戊烯基腺苷酸转变为异戊 烯基腺嘌呤( i p ) 。因此，异戊烯基侧链结合到腺苷酸( a m p ) 上的过程是细胞分裂素 生物合成的第一步，同时也是限速步骤( t a y a ，1 9 7 8 ) 。第一个在分子水平上被鉴定分析 的细胞分裂素合成酶基因来自冠瘿碱型根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) ( a k i y o s h ie ta 1 ，1 9 8 4 ；b a r r ye ta 1 ，1 9 8 4 ) 。当冠瘿碱型根癌农杆菌侵染植物时。其t i 质 粒的t - d n a 被整合到植物染色体上，t - d n a 携带的基因能够在植物细胞中表达，导致 生长素和细胞分裂素的过量产生，从而使植物体的相应部位形成冠瘿瘤。冠瘿碱型根癌 6 占 投 山东农业大学博士学位论文 农杆菌，n 质粒的t - d n a 序列中的t m r 基因( 又名勿，基因) 在大肠杆菌中的表达产物 催化二甲基丙烯焦磷酸和腺苷酸结合，形成异戊烯基腺苷酸( i p m p ) ，这表明祝基因 参与冠瘿碱型根癌农杆菌的细胞分裂素的生物合成。与发网菌相同的是，冠瘿碱型根癌 农杆菌的异戊烯基转移酶i p t 不以a t p 或a d p 作为反应底物，而是具有d m a p p ：a m p 异戊烯基转移酶活性( m o r r i se ta 1 ，1 9 9 3 ) 。胭脂碱型根癌农杆菌株系的细胞分裂素合成 则依赖于t z x ( t r a n s z e a t i ns e c r e t i o n ) 基因的表达。该基因位于t i 质粒的t - d n a 序列外 侧( m o r r i s e ta 1 ，1 9 9 3 ) 。t z s 催化的反应产物为异戊烯基化的腺苷酸( a m p ) ，而非异戊 烯基化的a t p 或a d p ( m o r r i s e ta 1 1 9 9 3 ) 。t m r t z s 的同源基因在其它致瘤细菌如假单胞 菌( p s e u d o m o n a ss p p ) ( p o w e l la n dm o r r i s ，1 9 8 6 ；a k i y o s h i ，1 9 8 9 ) 、欧文菌( e r w i n i a h e r b i c o l a ) ( l i c h t e re ta 1 ，1 9 9 5 ) 中也有发现。植物病原性细菌如r h o d o c o c c u s f a s c i a n s 中 的t m r t z s 同源基因能够引起叶的变形、叶片绿色斑点和叶瘤的形成等( c r e s p ie ta 1 ，1 9 9 2 ； g o e t h a l se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。上述t m r t z s 同源基因均参与细胞分裂素的生物合成。此外，具有 固氮作用的蓝藻( 蓝细菌) 门植物葛仙米( n o s t o c ) 中也有t m r t z s 的同源基因存在 ( k a k i m o t o ，2 0 0 3 ) 。 有两个研究小组分别在烟草的细胞分裂素自养型细胞培养物以及未成熟的玉米籽 粒的组织粗提物中检测到了d m a p p ：a m p 异戊烯基转移酶活性( c h e na n dm e l i t z ，1 9 7 9 ； b l a c k w e l la n dh o r g a n , 1 9 9 4 ) ，提示在细胞分裂素合成酶的作用特点方面某些植物与原核 生物以及黏菌可能是相同的。然而这两种植物的细胞分裂素合成酶目前仍未被分离、纯 化，相应的基因也没有得到克隆。 近年来，在拟南芥细胞分裂素合成酶的研究方面进展迅速。k a k i m o t o ( 2 0 0 1 ) 和t a k e i 等( 2 0 0 1 ) 基于序列比对的结果，分别从拟南芥中克隆到9 个异戊烯基转移酶基因 ( 么艘”彳胛矽) ，它们组成一个小的基因家族。系统树分析表明，与a t i p t 2 和a t l p t 9 相比，其它7 个成员即a t i p t l 以及a t l p t 3 a t l p t 8 等的氨基酸序列与细菌的i p t 具有更 高的同源性。这7 个a t l p t 基因在大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 的表达均能导致异戊烯 基腺嘌呤和反式玉米素的合成，进一步证实它们编码细胞分裂素合成酶( t a k e ie ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。在不含细胞分裂素的培养基上，过量表达a t l p t 4 的拟南芥愈伤组织表现为细胞 分裂迅速、促进不定苗的再生，但根的产生受到抑制，表明该愈伤组织中具有较高的细 胞分裂素水平，同时显示a t i p t 4 具有合成细胞分裂素的功o 皂( k a k i m o t o ，2 0 0 1o 对a t l p t 4 原核表达产物的粗提物的分析似乎说明a t l p t 4 具有d m a p p ：a m p 异戊烯基转移酶活 性。然而这只是一种假象，因为在大肠杆菌中，某些因子的作用极易使a m p 转化为a t p 7 细胞分裂素调节拟南芥花发育的研究 和a d p 。纯化的a t l p t 4 只能促进腺苷三磷酸( a t p ) 和腺苷二磷酸( a d p ) 而非腺苷 酸( 舢订p ) 的异戊烯基化，分别形成初级反应产物异戊烯基腺苷三磷酸( i p r t p ) 和异 戊烯基腺苷二磷酸( i p r d p ) ，进一步证实a t i p t 4 具有d m a p p ：a t p a d p 异戊烯基转移 酶活性( k a k i m o t o ，2 0 0 1 ) ，这与原核生物细胞分裂素合成的特点明显不同。尽管a t i p t l 催化d m a p p 和a m p 的结合，然而，酶的动力学分析表明，当以d m a p p 和a m p 为底 物时，a t i p t l 的米氏常数( k m 值) 较之农杆菌t m r 和t z s 产物的k m 值要高出许多倍 ( b l a c k w e l la n dh o r g a n ，1 9 9 3 ；m o r r i s 酏a 1 ，1 9 9 3 ；t a k e ie ta 1 ，2 0 0 1 ) 。在植物细胞中，a t p 的浓度比a m p 的高许多一a t p a m p 比值约为1 0 0 ( h a r d i e e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。事实上，a t l p t l 更偏向于利用d m a p p 和a t p a d p 作为反应底物，也属于d m a p p ：a t p a d p 异戊烯基 转移酶( k a k i m o t o ，2 0 0 1 ) 。上述结果提示，在高等植物中，细胞分裂素生物合成的第一 步和限速步骤为a t p 和a d p 的异戊烯基化作用，而原核生物和黏菌则为a m p 的异戊 ft ，喇 秭扣 + a r l p 柏p 棚时 h b o p 图l - 2 细胞分裂素的生物合成途径( k a k i m o t o ，2 0 0 3 ) f i g 1 - 2a m o d e lf o re y t o k i n i nb i o s y n t h e s i si np l a n t s ( k a k i m o t o ，2 0 0 3 ) 烯基化作用。在内源羟化酶的作用下，异戊烯基腺苷三磷酸和异戊烯基腺苷二磷酸的 8 山东农业大学博士学位论文 n 6 位侧链发生羟基化作用而转变为相应的反式玉米素形式( k a k i m o t o ，2 0 0 3 ：图1 2 ) 。 通过脱磷酸化、糖苷键裂解等一系列的结构变化最终形成自由碱基的形式一异戊烯基腺 嘌呤( i p ) 和反式玉米素( t z ) ，两种被认为是具有较强生理活性的细胞分裂素( m o ka n d m o k ，2 0 0 1 ；y a m a d a , 2 0 0 1 ；k a k i m o t o ，2 0 0 3 ) 。i p 形式的细胞分裂素也可在细胞色素单加 氧酶c y p 7 3 5 a 1 和c y p 7 3 5 a 2 的作用下经羟化后形成反式玉米素( t a k e ie ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 在过量表达农杆菌枷基因的拟南芥植株中，z m p 生成的效率较i p m p 合成效率高6 6 倍。 据此，a s t o t ( 2 0 0 0 ) 提出，羟基化的异戊烯基侧链也可以直接结合到a t p 、a d p 或a m p 上从而形成反式玉米素，即存在不依赖于i p m p 的反式玉米素合成途径( 图1 - 2 ；a s t o t ， 2 0 0 0 ) 。在拟南芥中也存在非i p m p 依赖途径，尽管i p m p 依赖途径在细胞分裂素生物合 成中起主要作用( a s t o t , 2 0 0 0 ) 。 在高等植物中，除反式玉米素外，尚存在顺式玉米素( c i s z e a t i n ) 。这两种结构形 式在玉米素异构酶的作用下可以互相转变。顺式玉米素也可不依赖于反式玉米素而直接 形成( k a s a h a r ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。尽管大多数由玉米素引起的生物学效应被认为是反式玉米 素作用的结果，然而最近的研究提示顺式玉米素可能也具有生物学活性( m a r t i ne ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。 拟南芥功能获得型突变体p g a 2 2 呈现典型的细胞分裂素反应如根部变短、下胚轴加 粗、子叶浓绿等。突变体植株中的异戊烯基腺苷酸i p m p 和异戊烯基腺苷i p r 的含量显 著提高，提示p g a 2 2