（分析化学专业论文）谷类拉曼指纹图谱研究及化学计量学的应用.pdf

摘要 摘要 谷类作为中国人的传统饮食，在我国的膳食中一直占有重要的地位。近年 来，粮食安全事件在某些行业频频发生，质量难以达到国际标准，加之国际市 场竞争激烈，粮食质量安全问题越来越受到社会各界人士的高度重视。 谷类指纹图谱技术是在中药指纹图谱研究工作的基础上提出的一种实用、 科学、先进的谷类质量保证及检验体系。而拉曼光谱法作为一种快速、无损的 检测技术，在谷类研究领域显现出独特的优势。 本文选择常见谷类( 大米、玉米、高粱、小米等) 为研究对象，利用拉曼 光谱法系统地对谷类拉曼指纹图谱的建立进行了研究，优化实验条件，建立了 以上四种谷类的拉曼指纹图谱，指出其拉曼特征频率并对其进行了初步指认。 通过比较分析表明，大米和高粱的拉曼特征峰均来自淀粉的贡献，玉米的拉曼 特征峰来自类胡萝i - 素的贡献，而小米因荧光太强致使部分拉曼峰被掩盖。同 时，根据每种谷物的拉曼光谱特征，可以区分不同种类的谷物，1 0 0 - - 1 6 0 0 c m 1 范围的拉曼光谱可作为区分不同谷物的光谱特征区。 在拉曼光谱数据处理方面，建立了一套适用、准确、可靠的预处理方法。 在拉曼光谱中，由于荧光的存在，基线漂移情况严重，阻碍对其进一步的解析。 将多项式拟合的方法进行适当改进，实现了对基线漂移的校正，有效降低甚至 基本消除了荧光所造成的影响。在此基础上，利用化学计量学方法中的主成分 分析法( p c a ) 实现了对不同种类的谷物、不同产地的粳米、不同产地的籼米、 不同品种的大米的分类，同时借助欧氏距离聚类分析法对所采集的籼米的拉曼 光谱数据进行了研究。结果表明，p c a 投影法与欧氏距离聚类分析两种方法在 分类结果上基本是一致的。 同时，应用拉曼光谱技术对涂有石蜡的“有毒 大米进行了初探，结果表 明，在1 0 0 0 1 2 0 0 c m _ ：1 范围内，“有毒大米在1 0 6 2 、1 1 3 2 、1 1 7 1c m d 处出现三 个明显的特征峰。此法为涂石蜡大米的定性鉴别开辟了一种新的思路。 关键词：拉曼指纹图谱，质量控制，谷类，p c a 投影，欧氏距离聚类分析，模 式识别，“有毒”大米 a b s t r a c t a b s t r a c t a so n eo ft h et r a d i t i o n a lf o o d s ，g r a i n sh a v ep l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei no u rd a i l y l i f e h o w e v e r ，t h es e c u r i t yi n c i d e n t so fg r a i n sq u a l i t yo c c u rf r e q u e n t l yi nm a n ya r e a s a n dt o g e t h e rw i t ht h ef i e r c ec o m p e t i t i o ni nt h ei n t e r n a t i o n a lg r a i n sm a r k e t ，t h e s e c u r i t yi s s u eo ff o o dq u a l i t yh a sb e c o m eah e a t e dt o p i ca n da r o u s e dm u c ha t t e n t i o n o fm o r ea n dm o r ep e o p l e b a s e do nt h ef i n g e r p r i n tr e s e a r c ho fc h i n e s et r a d i t i o n a l m e d i c i n e ，g r a i n f i n g e r p r i n tt e c h n o l o g yh a sb e e nd e v e l o p e dt ob eap r a c t i c a l ，s c i e n t i f i ca n da d v a n c e d s y s t e mt od e t e c tt h eq u a l i t yo fg r a i n s a sar a p i d ，n o n d e s t r u c t i v et e s t i n gt e c h n o l o g y ， r a m a n s p e c t r o s c o p yh a sb e e nw e l lu s e di nt h er e s e a r c hf i e l do fg r a i n s t h ep a p e rt o o kt h ec o m m o ng r a i n s ( r i c e ，m a i z e ，s o r g h u m ，m i l l e t ，e t c ) a st h e r e s e a r c ho b je c t s ，u s i n gr a m a ns p e c t r am e t h o d st oe s t a b l i s hf i n g e r p r i n ts y s t e m a t i c a l l y t h er a m a nf i n g e r p r i n to ft h ef o u rk i n d so fg r a i n sw e r ee s t a b l i s h e db ya d ju s t i n gm a n y p a r a m e t e r sa n do p t i m i z i n gt h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s a n dt h ec h a r a c t e r i s t i c so f t h e i r f r e q u e n c y w e r e p o i n t e do u tf i n a l l y t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tr a m a n c h a r a c t e r i s t i cp e a k so ff i c ea n ds o r g h u mw e r ef r o mt h ec o n t r i b u t i o no fs t a r c h ，r a m a n p e a k so fc o r n w e r e f r o mt h ec o n t r i b u t i o no fc a r o t e n o i d ，a n dp a r to fr a m a n c h a r a c t e r i s t i cp e a k so fm i l l e tw e r ec o n c e a l e db e c a u s eo fs t r o n gf l u o r e s c e n c e a c c o r d i n gt ot h er a m a nc h a r a c t e r i s t i cp e a k s ，e a c hg r a i nc a nb ed i s t i n g u i s h e di nt h e 1 0 0 1 6 0 0 c m - 1 i nt h ed a t ap r o c e s s i n gp a r t ，i no r d e rt oe l i m i n a t et h ei n f l u e n c eo fd r i f t e db a s e l i n e ， am o d i f i e d p o l y n o m i a lf i t t i n g m e t h o d w a s d e v e l o p e d ，w h i c h w a sa b l et o a u t o m a t i c a l l yc o r r e c tt h eb a s e l i n ed r i f tf r o ma c q u i r e dd a t a ，p a r t i c u l a r l y f o rt h e f l u o r e s c e n c es u b t r a c t i o nf r o mr a m a ns p e c t r u m s i m u l a t e dd a t aw i t hd i f f e r e n t f u n c t i o nt y p eb a s e l i n ep r o v e dt h ee f f i c i e n c yo ft h i sm e t h o d b a s e do nt h i s ，p c a p r o j e c t i o na n de u c l i d e a nd i s t a n c ec l u s t e ra n a l y s i sw e r ea p p l i e dt od e a lw i t ht h ed a t a a n dm a n yr e s u l t sh a v eb e e no b t a i n e db yu s i n gt h ec h e m i s t r yp a t t e r nr e c o g n i t i o nt o c o n t r o lt h eq u a l i t yo fg r a i n s i i a b s t r a c t m o r e o v e r , t h er a m a ns p e c t r ao fp a r a f f i n c o a t e dr i c ew e r et e s t e ds i m p l yi nt h i s r e s e a r c h ，a n dt h ed i f f e r e n c e so fr a m a ns p e c t r o s c o p yw e r ef o u n db yc o m p a r i s o nw i t h t h ed a t ao fn o r m a lr i c e t h i sm e t h o dh a so p e n e du pan e wt r a i no ft h o u g h tf o r q u a l i t a t i v ei d e n t i f i c a t i o no fp a r a f f i n c o a t e dr i c e k e y w o r d s ：r a m a nf i n g e r p r i n t ，q u a l i t yc o n t r o l ，g r a i n ，p c ap r o j e c t i o n ，e u c l i d e a n d i s t a n c ec l u s t e ra n a l y s i s ，p a t t e mr e c o g n i t i o n ，p a r a f f i n c o a t e dr i c e i i i 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本：学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：程亟雨 西7 年弓月扣 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：程迳雨 如d 7 年弓月f 6 日 第1 章引言 1 1拉曼光谱概述 第1 章引言 拉曼光谱又称拉曼效应，早在1 9 2 3 年，德国物理学家s m e k a l l 根据量子力 学的计算结果首先从理论上预言了光的非弹性散射【l 】。直到1 9 2 8 年，印度物理 学家( c v r a m a n ) 发现了光的非弹性散射效应。拉曼光谱正是以此为基础而发展 起来，其信号来源于分子的振动和转动【2 ，3 】。上世纪三十年代，著名物理学家吴 大酞等在国内开始原子分子拉曼光谱的研究，并发表了一系列拉曼光谱研究论 文1 4 ，5 j 。1 9 3 4 年，普拉坎克比较详尽地评述了拉曼效应，总结并指出了r a m a n 所发现的是一种全新的现象，对振动拉曼效应进行了较系统的总结【6 l 。4 0 6 0 年 代，原始的拉曼光谱以汞弧灯为光源，由于它强度不太高和单色性差，限制了 拉曼光谱的发展1 7 j ，中国的拉曼光谱研究工作甚少，拉曼光谱的发展已处于停 滞阶段。6 0 年代之后，随着激光光源的问世和计算机技术的进步，使拉曼光谱 获得新生并得到了突飞猛进地发展。同时，结合生化、显微、电磁分析技术， 拉曼光谱检测灵敏度和精度都得到显著提高【8 ，9 】。 拉曼光谱技术对检测样品的形状没有特殊的要求，可以用于气体、固体和 液体的微量分析，并且不需要对样品进行特殊的处理或制备。拉曼光谱是一种 快速无损检测技术，同时它检测速度快可以适用于不同的工作环境，特别是近 年来便携式拉曼光谱仪的飞速发展使得拉曼光谱技术可以应用于野外作业 i t 0 , 1 1 。正是由于拉曼光谱技术具有上述众多的优点，拉曼光谱分析技术迅速成 为了研究分子结构的重要手段，利用分子的拉曼光谱可以得到有关分子结构的 信息【l2 1 ，拉曼光谱技术已经日渐成为进行分子振动和分子结构鉴定的有利工具， 被广泛应用于诸多领域f 1 3 】。 1 1 1拉曼光谱原理 拉曼散射是光散射的一种，单色光束的光子与分子相互作用时可发生弹性 碰撞和非弹性碰撞。在弹性碰撞过程中，光子与分子之间没有能量交换，光子 只改变运动方向而不改变频率，这种散射过程称为瑞利( r a y l e i g h ) 散射，瑞利散 l 第1 章引言 射是散射光中较强的光，其频率与入射光的频率相同。其强度约为入射光强的 1 0 。3 倍。而在非弹性碰撞的过程中，光子与分子之间发生了能量交换，光子不 仅改变运动方向，同时光的频率也发生了明显的变化，这种散射过程称为拉曼 ( r a m a n ) 散射，其强度约为入射光的1 0 一1 旷倍，这部分散射光对称地分布在 瑞利线两侧；其中频率较低的谱线称为斯托克斯线( s t o k e s ) ，频率较高的谱线 称为反斯托克斯线( a n t i s t o k e s ) ，见图1 1 。对同一种物质分子而言，随着入射 光频率的改变，拉曼线的频率也随之改变，但拉曼位移v 始终保持不变，因 此拉曼位移与入射光频率无关，而仅与物质分子的振动和转动能级有关。不同 物质分子有不同的振动和转动能级，因而有不同的拉曼位移1 1 4 。6 1 。根据波尔兹 曼定律，在室温下，分子绝大多数处于振动能级基态，所以s t o k e s 线的强度远 远强于a n t i s t o k e s 线。拉曼光谱仪一般记录的都只是s t o k e s 线【i7 1 。 1 1 2 拉曼光谱技术发展 图1 i 光散射示意图 斯托克斯 拉曼散射 近年来，随着激光技术的兴起，拉曼光谱得以快速发展。传统拉曼光谱仪 信号弱，灵敏度低，使得其应用范围受到限制。因此，为了提高激光拉曼光谱 的信号强度，人们先后进行了大量卓有成效的研究工作，并不断提出了新的激 光拉曼分析技术及方法，从而使拉曼光谱具有更广阔的应用前景【1 8 1 。 1 1 2 1 傅立叶变换拉曼光谱技术 2 第1 章引言 傅立叶变换拉曼光谱( f t - r a m a n ) 是上世纪9 0 年代发展起来的新技术， 侧重于有机样品分析，采用1 0 6 4 n m 的近红外区激光激发以抑制电子吸收，这 样既阻止了样品的光分解又抑制了荧光的产生，有效地消除荧光干扰，从而大 大拓宽了r a m a n 光谱的应用范围。从此，f t - r a m a n 在化学、医学和生物学样 品的非破坏性结构分析方面显示出了巨大的生命力。近来，化学工作者们对 f t - r a m a n 光谱仍在不断探索与研究【1 9 j 。 1 1 2 2 表面增强拉曼光谱技术 1 9 7 4 年，f l e i s c h m a n n 等人【2 0 】发现吸附在粗糙化的a g 电极表面的砒啶分子 具有巨大的拉曼散射现象，被称为表面增强拉曼散射( s u r f a c e e n h a n c er a m a n s c a t t e r i n g ，简称s e r s ) 。当一些分子被吸附到某些粗糙的金属，如金、银或铜 的表面时，它们的拉曼谱线强度可放大1 0 6 倍【1 5 】。s e r s 技术是一种新的表面测 试技术，可以在分子水平上研究材料分子的结构信息。 由于s e r s 具有极高的灵敏度和高荧光碎灭的优越特性，能够检测到吸附 在金属表面单层或亚单层的分子，又能给出表面分子的结构信息，在研究分子 的表面特性和分子与基底表面相互作用过程中，有着极其广泛的应用【2 l 】。 1 1 2 3 共振拉曼光谱 当一个化合物被入射光激发，激光线的频率与待测分子的某个电子吸收峰 接近或重合时，由于电子跃迁和分子振动的耦合，这一分子的某个或几个特征 拉曼谱带强度陡然增加，这个效应被称为共振拉曼光谱( r e s o n a n c er a m a n s p e c t r a ，简称r r s ) t 2 2 1 。共振拉曼散射的强度较普通拉曼谱带的强度增大1 0 4 1 0 6 倍，甚至可以出现正常拉曼效应中观察不到的泛频及组合振动频率的谱峰【2 3 1 。 与常规拉曼光谱相比，共振拉曼光谱灵敏度高，可用于低浓度和微量样品检测， 特别适用于生物大分子样品检测。用共振拉曼偏振测量技术，还可得到有关分 子对称性的信息【l5 1 。r r s 在低浓度样品的检测和络合物结构表征中，发挥着重 要作用1 2 引。 1 1 2 4 共焦显微拉曼光谱 共焦显微拉曼光谱成功地把拉曼谱仪和显微镜耦合，保留了显微镜的目镜， 使观察样品更容易，并且在光路中引进了共焦显微镜，从而消除来自样品的离 焦区域的杂散光，形成空间滤波，保证了探测器到达的散光是激光采样焦点薄 3 第1 章引言 层微区的信号，精确获得所照样品微区的有关化学成分、晶体结构、分子相互 作用以及分子取向等各种拉曼光谱信息，它的空间分辨率好于l i m a ，纵向分辨 率达2 1 上m 1 2 5 1 。尤其适用于宝石中细小包裹体的测量，使得可以准确了解包裹体 的成分、结构、对称性。 1 1 3 拉曼光谱应用领域 近年来，拉曼光谱技术由于具有信息丰富，制样简单，所需样品量少，并 且在测量中具有无损样品和水的干扰小等独特的优点，己被广泛应用于各个领 域之中，如石油化工、食品鉴定、医药学、文物考古、宝石鉴定、公安与法学 样品鉴定等i z 6 。 1 1 3 1 拉曼光谱在化学中的应用 拉曼光谱与红外光谱互为补充，可以测定物质的空间构型，还可以用作结 构鉴定的手段，也可以鉴别特殊的结构特征或特征基团。拉曼谱线数目的多少、 拉曼位移的大小、拉曼峰形状及拉曼强度是鉴定化学键、官能团的重要依据。 在无机化学方面，拉曼光谱可以提供有关配位化合物的组成，结构和稳定性等 信息。在有机化学方面，利用高分辨拉曼光谱，还可以作为分子异构体判断的 依据。在分析化学方面，拉曼光谱分析技术可以定性( 不同的物质具有不同的特 征光谱) 和定量( 物质对光谱的吸光度的特点) 分析各种物质结构信息【2 7 1 。 1 1 3 2 拉曼光谱在考古研究中的应用 拉曼光谱应用于考古学中材料的鉴定和研究是近几年发展较迅速的领域。 拉曼光谱作为分子水平的测试手段，可以无损无接触、现场检测大型不规则样 品，这样的优点使得它在考古学领域占有一席之地【2 8 1 。拉曼光谱就像指纹技术， 可以通过将所测量样品的拉曼光谱与数据库中的谱线相比较来确定样品成份 2 9 1 。目前，国内外有很多关于拉曼技术应用于考古分析的报道，如分析青铜器、 古颜料、古人类骨骼、壁画及宝石等1 3 m 3 7 1 。e d w a r d s 3 8 1 收集出版了在艺术品、文 物和考古中应用拉曼光谱的研究成果，对考古学家和历史学家进行文物的鉴别 研究提供了基础数据。v a n d e n a b e e l e 等 3 9 1 用显微拉曼研究了2 6 种天然有机粘合 剂和颜料的光谱，将其作为指纹识别未知粘合剂和油漆的数据资料，该资料在 对中世纪彩色稿本中的粘合剂和颜料的鉴别中得到了验证。已经有许多文物材 4 第1 章引言 料的拉曼光谱数据库，如矿物质i 舭1 1 、现代合成颜料等，对新发现的文物可以 直接进行测量分析。 1 1 3 3 拉曼光谱在食品科学中的应用 拉曼光谱技术近年来在食品科学领域的应用主要包括食品质量检测( 果蔬 农药残留的检测、伪劣食品鉴定) 及食品加工监控等方面。拉曼光谱用于检测食 品质量的研究不仅能够判别食品的真伪程度、掺杂情况，而且，还能预测食品 的质量。甚至可以检测出食品中可能存在的微量有毒物质以及食品的变质状况。 此外，将拉曼光谱应用于食品加工生产线，有望实现实时监控【4 3 】。 1 2 谷类分析的研究现状 谷类作为中国人的传统饮食，在我国的膳食中一直占有重要的地位。谷类 主要是指禾本科植物的种子，它包括稻米、玉米、小麦等及其他杂粮，如玉米、 小米、黑米、荞麦、燕麦、薏仁米、高粱等。谷类所含的营养素主要是碳水化 合物，其次是蛋白质，谷类中脂肪含量一般都不高，约2 。谷类还是我国居民膳 食中维生素的重要来源，如泛酸、尼克酸、硫胺素和核黄素等。在小米和玉米中， 还含有少量胡萝b 素和维生素e 。由于谷类食品是我国居民多种营养物质的主 要来源，因此膳食中谷类食品不可缺m 】。近年来，人们对食品质量、安全性的要 求越来越高，对谷类的研究也越来越多，而谷类的种植、储藏、销售、加工和 食用等每个环节也都需要对成分含量进行监测和控制。 稻谷是世界上最重要的谷物粮食作物之一，大米是世界上一半以上人口的 主食。按照中国g b1 3 5 4 8 6 分类依据，大米分为粳米、籼米和糯米三类 4 5 1 。粳 米米粒一般呈椭圆形，如东北大米、江苏大米等，根据粳稻的收获季节分为早 粳米和晚粳米两种：籼米米粒一般呈长椭圆形或细长形，如海南大米等，根据 籼稻的收获季节，分为早籼米和晚籼米两种；糯米呈乳白色，不透明，也有呈 半透明，粘性大，分为籼糯米和粳糯米两种。 由于谷类对人类生活的巨大影响，国外早在十九世纪就开始对其成分进行 分析。原始检测方法包括重量分析法、体积分析法等。传统的化学方法存在太 随意、耗时等问题。当今随着谷类、食品、饮料等行业飞速发展，对原材料品 质、中间产品质量及最终成分检测的要求越来越迫切。为了满足工业上的需求， 5 第1 章引言 人们开发了许多种方法。其中，近红外光谱测试技术以快速、准确、操作简单 等优点得以广泛应用， 汪旭升等1 4 6 】人利用近红外光谱法分析棉籽粉中的油分，并初步论证了其可 行性，得到较好的预测结果。刘建学等 4 7 1 人利用近红外光谱法快速检测大米蛋 白质含量，大米蛋白质含量的模型预测值与化学测定值之间的相关系数达到 0 9 4 ，进而解决了传统的蛋白质化学测定方法检测时间较长的问题。 自9 0 年代初以来，拉曼光谱作为谷类鉴别及质量控制的更为快速、有效的 方法，也已经开始突破性地应用于具有8 5 年历史的国际谷物化学研究中【4 引。但 目前，国内外应用拉曼光谱研究谷类分析的报道相对于其它类型的光谱在这方 面的研究还比较少。 p h i l l i p s 等1 4 8 j 研究者采用f t r a m a n 光谱仪，功率约1 0 0 m w 、波长为1 0 6 4 n m 的光激发样品，收集到了纯蜡质玉米淀粉、纯小麦淀粉及其一系列不同取代度 的马来酰化淀粉的特征性的拉曼光谱。谱带分析表明9 0 0 c m - 1 处的拉曼谱带主 要是由c c 键的伸缩振动引起的，而在2 8 0 0 3 0 0 0 c m 。1 范围内的拉曼光谱主要 是由c h 键伸缩振动引起的。 1 3 化学计量学方法简介 化学计量学( c h e m o m e t r i c s ) 作为一门新兴的交叉学科，运用数学、统计学、 计算机科学以及其他相关学科的理论和方法，优化化学量测过程，并通过解析 化学量测数据以最大限度地获取化学及相关信息。各种化学计量学方法，如主 成分分析技术( p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s ，p c a ) 、模式识别技术( p a t t e r n r e c o g n i t i o n ，p r ) 等，已逐渐应用于食品化学、农业化学、医药化学等领域中 的信息处理1 4 圳。 1 3 1主成分分析 主成分分析是化学计量学中一种常用的数学方法，利用特征分析的数学方 法对数据矩阵求取特征值和特征矢量，其目的是将数据降维，以消除众多信息 共存中相互重叠的信息部分，将原始变量线性组合成一组新的变量，即一组主成 分，仅用部分主成分就可表达原有变量的主要信息。利用这一特性，可实现拉 6 第1 章引言 曼光谱线性降维投影显示，从二维或三维图中直观地观察到原始数据的主要特 性和聚类情况【5 0 1 。 1 3 2 模式识别 化学模式识别是化学计量学研究中的一个十分重要的内容，它是一种多元 分析方法，主要用于样品的分类判别1 5 。它从化学测量的数据出发，借助数学方 法和计算机技术，从而揭示出事物内部规律和隐含特征。模式识别分为有监督 的分类( s u p e r v i s e dc l a s s i f i c a t i o n ) 和无监督的分类( u n s u p e r v i s e dc l a s s i f i c a t i o n ) 两种。有监督分类需要有训练集，通过训练集建立模型，可以识别未知样 品。常见的包括线性判别、逐步判别分析、神经网络和s i m c a 法等。无监督 的分类包括最小生成树和聚类分析等【5 0 1 。 1 4 本论文所研究的内容及意义 随着人民生活水平的提高，人们对谷类质量需求观念更新，更加关注谷类 质量安全。但是近年来，食品质量事故却屡屡发生。谷类质量难以达到国际标 准，某些营养成份极度缺乏，甚至有毒食品现象普遍存在，这一系列的问题， 使谷类质量安全问题越来越成为全社会关注的焦点。因此，研究谷类质量控制 具有重要的意义。 本论文以拉曼光谱法为主要手段，优化实验条件，建立常见谷物( 大米、 玉米、小米、高粱) 拉曼指纹图谱，并结合文献对其拉曼特征频率进行初步的 解析和指认。同时针对拉曼光谱受荧光干扰强的特点，在数据处理中引入化学 计量学技术，与拉曼光谱分析手段相结合，建立合适的数据预处理方法，解决 谷类拉曼散射强度弱、出峰不明显、荧光背景强等问题。在此基础上，对不同 种类的谷物、不同产地的粳米、不同产地的籼米及不同的米类进行定性分析， 为谷类质量控制提供一些新的行之有效的方法。同时利用化学计量学模式识别 中的p c a 投影法和欧氏距离聚类分析法对所获取光谱数据进行分类与识别，进 行谷类质量控制的研究与探讨，丰富谷类分析方法的内容并拓宽了化学计量学 的研究领域。与此同时，应用拉曼光谱技术对涂有石蜡的“有毒 大米进行初 探，试图为谷类的掺假鉴别提供一种新思路。 7 第2 章谷类拉曼( r a m a n ) 指纹图谱建立 第2 章谷类拉曼( r a m a n ) 指纹图谱建立 2 1引言 谷类因种类、产地、生长条件的不同，其营养及其成分含量有很大的差别。 由于谷类粉末没有固定的晶形，所以无法进行晶体x 射线衍射结构分析；而对 多种溶剂的难溶解性，使其难于进行核磁共振谱( n m r ) 和液相色谱( h p l c ) 的 分析；不易气化的特点又限制了对其进行气质联用( g c m s ) 的分析。传统的 谷类鉴别方法，主要是依靠人的视觉、嗅觉、味觉、触觉等来进行，并以此判 定质量等级，其中，注重观察其外观与色泽在对谷类作感官鉴别时有着尤其重 要的意义。但这种方法并不能获取样品的化学信息，并且带有很强的主观性， 有一定的测定误差。谷类的主要成分为淀粉，不同种类的谷物主要成分含量和 结构各异，因而通过研究谷类的成分和化学结构差异来区分不同种类的谷物， 是化学工业的迫切要求。拉曼光谱法作为一种快速、无损、简便的技术正好满 足了这一需要。本章选用大米、玉米、小米、高粱四种典型的谷物，对其拉曼 指纹图谱进行了详细的研究，并对各拉曼特征峰作出相应的指认，同时探讨影 响实验条件的各种因素。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器与设备 英国r e n i s h a w 公司生产的显微共焦激光拉曼光谱仪( l a s e rc o n f o c a lm i c r o r a m a ns p e c t r o s c o p y ) r e n i s h a wr m 1 0 0 0 型显微共焦激光拉曼光谱仪，心+ 激发 器( 5 1 4 5 n m ) ，i k a a l lb a s i c 分析用研磨机，不锈钢筛( 1 0 0 目) 。 2 2 2 样品及预处理 8 第2 章谷类拉曼( r a m a n ) 指纹图谱建立 表2 1 各种谷类来源一览表 预处理方法： ( 1 ) 将上述所有谷物原粒样品，冲洗自然晾干，不经打碎直接存放入1 0 m l 样 品瓶中，分别编号保存。 ( 2 ) 另取所有粮食样品，用i k aa 1lb a s i c 分析用研磨机粉碎后分别过1 0 0 目 筛，得到颗粒度基本相同的不同粮食粉末样品，分别编号存放于样品管中，然 后将样品管封闭，备用。 2 2 3 实验方法 用单晶硅片校正( 在5 2 0 c m j 处出峰) 后，将样品直接置于5 0 倍短焦镜头 下进行拉曼检测。激发波长5 1 4 n m ，激光功率为2 0 m w ，分辨率为1 5 c m - 1 ，扫 描范围为1 0 0 m 6 0 0 c m ，扫描时间为2 0 s ，累加2 次，测试条件为室温，相对 湿度0 。 2 3 结果与讨论 2 3 1 实验条件探讨 2 3 1 1 外界光干扰 本实验首先考察外界光对拉曼光谱的影响。因为拉曼光谱是散射光谱，散 射光比透射光弱很多，拉曼散射又只是散射光中波长改变的一小部分，因此其 9 第2 章谷类拉曼( r a m a n ) 指纹图谱建立 强度是非常小的，极易受到干扰。本实验以大米为例，就最常见的两种外界光 自然光( 日光) 、日光灯对其进行了考察，见图2 1 。 7 5 0 0 6 0 0 0 j 零4 1 5 0 0 h p 一 翌 33 0 0 0 二 i - - 4 1 5 0 0 0 1 0 03 0 05 0 07 0 09 0 0 1 1 0 01 3 0 01 5 0 0 r a m a ns h i ：f t 蕊- 1 图2 1 外界光对拉曼检测的影响 由图2 1 可见，在5 1 4 n m 激光的激发下大米本身存在一定的荧光背景。当 外界自然光影响时，5 1 4 n m 激光拉曼光谱发生了略微变化，背景有所抬高，同时 出现很多小的干扰峰；当室内日光灯存在时，在l1 2 1 c m 。1 处出现了明显尖锐向 上的干扰脉冲峰，其信号强度特别大，存在较大的干扰。 因此，在测定样品时，由于环境光不论是自然光还是室内日光灯都会对 5 1 4 r i m 激光激发产生的拉曼光谱存在一定的影响。而且拉曼光谱仪能够检测微 弱光，因而环境光会随着光路进入光谱检测系统，对拉曼光谱产生一定的干扰， 所以在进行样品测定时须在暗室或暗罩遮护中进行，以隔离环境光的影响。 2 3 1 2 荧光噪声干扰 伴随拉曼光谱出现的荧光背景是一种难以克服的噪声来源，荧光会导致基 线的偏离和信噪比下降，微量物质所产生的荧光也可以导致显著的拉曼信号降 低，在某些情况下样品物质的拉曼散射信号会被荧光背景所覆盖，将无法分辨 拉曼信号，从而破坏了所要测量的光谱。所以在拉曼光谱测量过程中，能否消 除或降低拉曼光谱荧光背景与其他噪声干扰，提高信噪比，是实验成功的关键。 1 0 第2 章谷类拉曼( r a m a n ) 指纹图谱建立 降低荧光背景可采用改变激发波长、纯化试样、长时间辐照试样、适当增 加扫描次数等方法。使用更长的波长例如7 8 5 n m 或1 0 6 4 n m 的激发光可使荧 光显著减弱，但受仪器限制，改变激发波长是不可行的，这就要求必须考虑测 量前长时间辐照的方法。将样品用激光照射一定时间，固态物质的荧光也可得 以减弱，这个过程被称为光致漂白，是通过降解高吸收物质来实现的。光致漂 白作用在液体中并不明显，可能是由于液体样品流动性，或荧光物质不是痕量， 但作用在固体样品中比较明显。 噪声也是影响光谱信号的一个因素，会给光谱带来不确定信号。有时一些 样品的拉曼散射特别弱，所得到的拉曼光谱信号与噪声几乎相等，无法可靠地 识别出拉曼谱带的峰值，这时需要增加扫描次数，常采用信号平均法，把多次 扫描得到的光谱信号累加起来，累加n 次后，信号强度增加n 倍，噪声是随机 的，它的强度只增加n “2 倍。本实验同样以大米为例，考察曝光时间和扫描次 数的影响。 1 6 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 8 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 1 0 01 1 0 01 6 0 0 2 1 0 02 6 0 0 3 1 0 0 r a m a ns h it c m - 1 图2 2 曝光时间对拉曼光谱的影响 第2 章谷类拉曼( r a m a n ) 指纹图谱建立 2 0 0 0 0 0 1 6 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 8 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 1 0 06 0 01 1 0 01 6 0 02 1 0 02 6 0 0 3 1 0 0 r a j a hs h i f t c n - 1 图2 3 扫描次数对拉曼光谱的影响 由图2 2 和图2 3 可见，曝光时间不同，采集的拉曼光谱形状相似，但峰强 有明显变化，改变扫描次数结果亦如此。为了考察这种变化趋势，借助不同条 件下的信噪比来进行讨论。固定扫描次数，分别设定曝光时间为1 0 、1 5 、2 0 、 6 0 、1 2 0 s ，每个条件下的信噪比如表2 2 所示；固定曝光时间，分别设定扫描 次数为1 、2 、5 、8 次，每个条件下的信噪比如表2 3 所示。 表2 2 不同曝光时间下的信噪比 由表2 2 和表2 3 可见，扫描次数一定时，曝光时间越长，信噪比有所提高， 拉曼峰更明显，信号更平稳。曝光时间一定时，扫描次数越多，信噪比也有所 提高，拉曼峰也更明显，信号也更平稳。然而，根据实际情况，当曝光时间为 6 0 s ，扫描5 次时，测量一个样品就需用时约1 5 m i n ，用时过久。因此，为了更 1 2 第2 章谷类拉曼( r a m a n ) 指纹图谱建立 快更好的获得图谱，整个实验条件选定曝光时间为2 0 s ，描次数为2 次，此时， 测量一个样品用时约2 m i n 。 2 3 2 方法学考察 2 3 2 1 单一米粒( 不同位置) 重现性考察 取一粒大米，随机选取5 个不同的位置，按照2 2 3 的实验方法分别对其进 行对焦取谱，如图2 4 所示。 7 5 0 0 6 0 0 0 4 5 0 0 3 0 0 0 1 5 0 0 0 1 0 03 0 05 0 07 0 09 0 01 1 0 01 3 0 01 5 0 0 r a m a ns h i f t c m - 1 图2 4 单一米粒( 不同位置) 原始拉曼光谱 把上述光谱分别进行平滑、基线校正后，计算相关系数见表2 4 ，当相关系 数为1 时，表示两个变量之间为完全相关或称正相关；当相关系数为一1 时，表 示两个变量之间为全负相关或称负相关；当相关系数为0 时，表示两个变量之 间没有相关。一般情况下，相关系数的变化范围在+ 1 1 之间。通过表2 4 发现， 相关系数均在0 9 8 以上。结果表明，本实验方法对测定同一颗大米拉曼光谱重 现性良好，从而排除由人为对焦因素对实验所造成的影响。 1 3 第2 章谷类拉曼( r a m a n ) 指纹图谱建立 2 3 2 2 同批次大米( 不同颗粒) 重现性考察 对同一批次大米，随机选取5 颗，按照2 2 3 的实验方法分别对其进行对焦 取谱，如图2 5 所示。 8 0 0 0 0 0 o o 0 0 0 1 1 0 01 3 0 0 1 5 0 0 图2 5 同批次大米( 不同颗粒) 原始拉曼光谱 把上述光谱分别进行平滑、基线校正后，计算相关系数见表2 5 ，均在o 9 9 以上。结果表明，本实验方法对测定同批次大米拉曼光谱重现性良好。 1 4 第2 章谷类拉曼( r a m a n ) 指纹图谱建立 2 3 3 常见谷类的拉曼光谱及图谱解析 实验中选取大米、玉米、小米、高粱4 种比较典型的谷类作为研究对象， 对其拉曼光谱展开系统的研究。 2 3 3 1 大米的拉曼光谱研究 大米的拉曼光谱如图2 6 所示。其拉曼光谱主要包含了直链淀粉、支链淀粉 的贡献。拉曼光谱峰的具体归属见表2 6 。淀粉是构成大米的主要成分，它的拉 曼谱线很明显的表现在图2 6 中。除淀粉外，大米还含蛋白质、脂肪、维生素 ( b 1 、a 、e ) 及纤维素、钙、磷、铁等物质。这些营养成分大多藏于米粒的胚 芽和外膜中。 枷如棚姗栅 挪彻姗i 咖l i f t 0l 枷嘲l 棚i 姗i 咖 鼬_ h 涮i 图2 6 大米的拉曼光谱图 1 5 第2 章谷类拉曼( r a m a n ) 指纹图谱建立 如图2 6 所示，大米的拉曼特征峰为4 0 5 、4 3 9 、4 7 6 、5 2 5 、5 7 4 、6 4 1 、7 1 2 、 7 6 0 、8 5 6 、9 3 6 、1 0 0 2 、1 0 4 9 、1 0 8 0 、l1 2 5 、1 2 0 4 、1 2 5 3 、1 3 3 5 、1 3 9 1 、1 4 5 7 、 1 5 5 l c m - 1 。在1 5 0 0 c m - 1 以下，c h 弯曲振动在1 4 5 8 c m 1 的谱带十分明确。c h 2 变形，c o h 弯曲和c c 伸缩振动的混合出现在1 4 4 0 , - - - 1 3 2 0 c m 1 之间。 1 2 0 0 1 0 0 0c m - 1 属于c o h 伸缩振动和一o h 变形。许多复杂的拉曼谱带低于6 0 0 c m ，它们由环的骨架和扭转振动模式组成【5 引。 2 3 3 2 玉米的拉曼光谱研究 玉米的拉曼光谱见图2 7 ，其拉曼谱峰的具体归属见表2 6 。 玉米含有碳水化合物、蛋白质、脂肪、胡萝卜素、谷固醇，而且还含有核 黄素、维生素等营养物质。玉米的胡萝卜素、维生素b 2 、脂肪含量位居谷类 之首。在所有主食中，玉米的营养价值和保健作用是最高的【5 3 】，具有调中开胃、 益肺宁心、清湿热、利肝胆、延缓衰老等功能。 柚如枷姗蛳加柚姗l 咖1 1 1 1 1珊 l 姗i , i w - l m咖 r m 釉曲h i 图2 7 玉米的拉曼光谱 如图2 7 所示，玉米种子的特征拉曼峰为3 5 8 、4 3 7 、4 7 6 、5 7 5 、8 6 4 、9 3 9 、 1 0 0 3 、1 0 7 8 、l1 5 5 、1 1 9 2 、1 2 6 2 、1 3 3 7 、1 3 8 8 、1 4 5 8 、1 5 2 0c m - 1 。其中，在1 0 0 3 、 1 1 5 5 和1 5 2 0c m - 1 三处的谱带较强，研究表明这三处的强谱线属于类胡萝卜素的 1 6 枷 雠 舢 棚 撕 姗 脚 。 ，vh，兰h 第2 章谷类拉曼( r a m a n ) 指纹图谱建立 特征峰。除此之外，玉米种子的拉曼光谱还包含了淀粉的贡献1 5 4 j 。 2 3 3 3 小米的拉曼光谱研究 小米的拉曼光谱见图2 8 ，其拉曼谱峰的具体归属见表2 6 。 小米含有丰富的营养成分，含蛋白质，脂肪，膳食纤维，胡萝b 素，维生 素b l ，维生素b 2 ，维生素e ，微量元素铁等，其中色氨酸含量为谷类之首， 色氨酸有调节睡眠的作用。 枷姗枷姗硼咖姗娜姗n i 瑚l 姗i 栅l 娜i n r - - s 盥i _ , - 1 图2 8 小米的拉曼光谱 如图2 8 所示，由于小米荧光太强，造成大部分基团的特征拉曼峰被掩盖。 整条谱带中，仅在l1 5 5 、1 5 2 1 c m - 1 处出现两个明显的拉曼峰，与玉米的拉曼光 谱类似，这两个峰是类胡萝b 素的特征峰。 2 3 3 4 高梁的拉曼光谱研究 高粱的拉曼光谱见图2 9 ，其拉曼谱峰的具体归属见表2 6 。 高粱含粗脂肪、粗蛋白、粗纤维、淀粉等。高粱是中国的铁秆庄稼，有5 0 0 0 多年历史，也是世界四大谷物的“老四”，高粱米含有的热量是谷物中最高的， 它能使人体在不同的气温条件下保持体温，维持机体的基本代谢。 1 7 第2 章谷类拉曼( r a m a n ) 指纹图谱建立 劫 姗 和 如 细 艟蛳期肿 西l 期脚 蛳 l 蜘i 姗 i 轴“l 图2 9 高粱的拉曼光谱 如图2 9 所示，高粱的特征拉曼峰为4 7 6 、9 3 8 、1 0 0 1 、1 1 2 4 、1 1 5 5 、1 2 6 2 、 1 3 0 7 、1 3 3 8 、1 4 4 6 、1 5 2