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以非磁化及磁化离子交换树脂为载体的果胶酶固定化研究 陈姗姗 摘要果胶酶是催化果胶物质分解的一类酶的总称。果胶普遍存在于各种水 果中，是水果细胞中层和初生壁的主要成分，果汁中的果胶对其粘度和浊度有较 大影响。在果汁加工中，加入果胶酶进行酶解工艺，可以提高出汁率，加速果汁 过滤，促进澄清。因此，果胶酶成为水果加工中应用最重要的酶。 由于果胶酶的价格相对较高，因此，果胶酶的回收和重复利用对水果加工业 是非常有利的。为了达到这个目的，常常将果胶酶固定到载体上。果胶酶固定化 技术是实现酶重复连续使用和稳定性改善的有效手段。 许多有机物和无机物都可以用来固定酶，离子交换树脂是工业上使用最广的 载体材料之一，它价格低廉，机械强度好，理化性能稳定，作为固定化载体有着 广阔的应用前景。近年来磁性高分子微球在生物医学、细胞学及生物工程等领域 的应用受到越来越广泛的关注。与其它载体相比，磁性载体更利于分离和回收。 本文以非磁化和磁化离子交换树脂为载体对果胶酶进行固定化研究，确定了 两种载体固定化果胶酶的最适条件，用扫描电镜对固定化酶进行了表征，并研究 了非磁化和磁化固定化果胶酶的酶学性质。主要试验结果如下： ( 1 ) 通过以广泛应用于工业上的十种吸附树脂和离子交换树脂为载体，进行果胶 酶固定化筛选试验，确定固定化的最佳载体为d 3 8 0 大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交 换树脂。 ( 2 ) 对以d 3 8 0 树脂为载体的果胶酶固定化方法及条件进行了研究和优化。最终 确立了最佳固定化参数为：固定化温度3 6 4 0 ，加酶量0 7 5 m l 1 0 9 树脂，固定 化时间6 h ，固定化d h 值5 5 ，戊二醛交联浓度0 1 ，戊二醛交联温度3 。c 4 ， 戊二醛交联时间4 h ，在此条件下，固定化酶活回收率达到8 1 6 7 。 ( 3 ) 对以d 3 8 0 树脂为载体的固定化果胶酶的酶学性质进行了研究，并与游离果 胶酶进行了比较，研究发现：经固定化后，果胶酶的最适温度较游离果胶酶有所 提高，游离酶的最适温度为5 0 c ，而固定化酶的最适温度为6 0 。c ，其热稳定性明 显高于游离酶；固定化果胶酶的最适p h 为4 0 ，游离果胶酶的最适p h 为3 5 ，固 定化酶较游离酶有较宽的p h 稳定范围。研究还得知：固定化酶有较好的重复使用 性，在使用1 0 次后，还能保留较高的酶活力，达5 0 ；在4 c 下，其贮藏稳定性 较游离酶有明显提高。 ( 4 ) 对以磁化d 3 8 0 树脂为载体的果胶酶固定化方法及条件进行了研究和优化。 最终确立了最佳固定化参数：固定化温度2 7 3 0 ，加酶量0 5 o 6 5 m u l _ 0 9 树 脂，固定化时间6 h ，固定化p h 值5 5 ，戊二醛交联浓度o 0 1 ，戊二醛交联温度 1 0 c ，戊二醛交联时间2 h ，在此条件下，固定化酶活回收率达到1 3 7 5 。 ( 5 ) 对以磁化d 3 8 0 树脂为载体的固定化果胶酶的酶学性质进行了研究，并与游 离果胶酶进行了比较，研究发现：磁性固定化酶的最适温度为7 0 c ，游离酶的最 适温度为5 0 ，在3 0 6 0 的范围内，热稳定性明显高于游离果胶酶；其最适 p h 为4 5 ，比游离果胶酶的最适p h 高1 0 个单位，在p h 值3 5 4 5 的范围内磁 性固定化酶对p h 的稳定性较游离酶有明显提高；其操作稳定性较以未磁化树脂为 载体的固定化酶低，在前6 次的重复使用中可以保持较高的酶活力，达6 1 1 1 ； 在4 下，其贮藏稳定性较游离酶高。 关键词：果胶酶 固定化离子交换树脂磁化 i i s t u d i e so nt h ei m m o b i l i z a t i o no fp e c t i n a s eb yn o n - m a g n e t i ca n d m a g n e t i ci o n - e x c h a n g er e s i n c h e ns h a n s h a n ， a b s t r a c tp e c t i n a s ei sac o m p l e xg r o u po fe n z y m e st h a td e g r a d ev a r i o u sp e c t i c s u b s t a n c e s p e c t i n ，t h em a j o rc o m p o n e n ti nt h em i d d l el a m e l l aa n dp r i m a r yc e l lw a l lo f h i g h e rp l a n t s ，h a sag r e a ti m p a c to nt h ev i s c o s i t ya n dt u r b i d i t yo ff r u i tj u i c e s p e c t i n a s e i sm a i n l yu s e df o ri n c r e a s i n gt h ey i e l da n dc l a r i f i c a t i o no ff l u i tj u i c e s t h e r e f o r e ，t h eu s e o fp e c t i n a s ei nt h ep r o d u c t i o no ff r u i tj u i c e si sv e r yc o m m o n d u et ot h er e l a t i v e l yh i g hc o s to f p e c t i n a s eu s e di nf r u i tj u i c ep r o c e s s i n gi ti so f t e n a d v a n t a g e o u st oh a v eas y s t e mi nw h i c ht h ee n z y m ec a nb er e c o v e r e do ru t i l i z e d r e p e a t e d l y ac o m m o nm e t h o do fa c h i e v i n gt h i sa i mi st oi m m o b i l i z et h ee n z y m eo na s o l i ds u p p o r t i m m o b i l i z a t i o nt e c h n o l o g yo f p e c t i n a s ei sa ne f f e c t i v em e a s u r et oa c h i e v e u t i l i z i n gr e p e a t e d l ya n di m p r o v es t a b i l i t y m a n yo r g a n i ca n di n o r g a n i cs u b s t a n c e sh a v eb e e nu s e da st h es u p p o r tm a t e r i a l s i o ne x c h a n g er e s i ni so n eo ft h em o s tw i d e l yu s e dm a t e r i a l si ni n d u s t r y i th a st h eb r o a d a p p l i c a t i o np r o s p e c ta st h ec a r r i e ro fi m m o b i l i z a t i o nf o ri t sl o wp r i c e g o o dm e c h a n i c a l p r o p e r t i e s ，a n ds t a b l ep h y s i c a lp e r f o r m a n c e r e c e n t l y ，m a g n e t i cp a r t i c l e sr e c e i v e c o n s i d e r a b l ea t t e n t i o nb e c a u s eo ft h e i r w i d e l y u s ei n b i o m e d i c i n e ，c y t o l o g y , b i o e n g i n e e r i n ga n ds oo n c o m p a r e dw i t hn o n - m a g n e t i cc a r l i e r s ，e n z y m ei m m o b i l i z e d b ym a g n e t i cc a r r i e r sc a nb em o r ee a s i l yr e c o v e r e da n ds e p a r a t e df r o mt h er e a c t i o n s y s t e m i nt h i sa r t i c l e ，i m m o b i l i z a t i o no fp e c t i n a s eb yn o n - m a g n e t i ca n dm a g n e t i ci o n e x c h a n g er e s i nw a ss t u d i e d t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fi m m o b i l i z a t i o n ，c h a r a c t e r i s t i c so f n o n m a g n e t i ca n dm a g n e t i ci m m o b i l i z e de n z y m ew e r em a i n l yi n v e s t i g a t e di nt h i st h e s i s m o r e o v e r , t h ee x t e r n a lc o n f i g u r a t i o no fi m m o b i l i z e de n z y m e sw a sc h a r a c t e r i z e db y s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) t h em a i ne x p e r i m e n t a lr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h r o n 曲p r i m a r i l yr e s e a r c ho nt e nk i n do fa b s o r p t i o nr e s i na n di o ne x c h a n g er e s i n u s e dw i d e l yi ni n d u s t r y , w ef i n dt h eb e s ts u p p o r tf o r t h ei m m o b i l i z a t i o no fp e c t i n a s ei s t h ea n i o n - e x c h a n g er e s i nd 3 8 0 ( 2 ) p e c t i n a s ew a si m m o b i l i z e do na n i o n - e x c h a n g er e s i nd 3 8 0u s i n gg l u t a r a l d e h y d ea s c r o s s l i n k i n gr e a g e n t e f f e c to ft e m p e r a t u r e ，p h ，t i m e ，a m o u n to ft h ee n z y m e ， c o n c e n t r a t i o no fg l u t a r a l d e h 【y d e c r o s s - l i n k i n gt e m p e r a t u r ea n dt i m eo nt h ea c t i v i t y r e c o v e r yo fi m m o b i l i z e de n z y m ew a sm a i n l yi n v e s t i g a t e di n t h i st h e s i s t h eo p t i m u m n i c o n d i t i o n sf o rt h ei m m o b i l i z a t i o nw e r ea sf o l l o w s ：4 0 ，p i - 1 5 5 ，6 h ，0 7 5m lp e c t i n a s e t h e c o n c e n t r a t i o no fg l u t a r a l d e h y d ew a s0 1 ，c r o s s l i n k i n gt e m p e r a t u r ea n dt i m ew e r e4 c a n d4 hr e s p e c t i v e l y u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h ea c t i v i t yr e c o v e r yo fi m m o b i l i z e d p e c t i n a s ec a l lr e a c ht om o r et h a n8 1 6 7 ( 3 ) c o m p a r e dw i t hf r e ep e c t i n a s e ，t h ec h a r a c t e r i s t i c so fi m m o b i l i z e dp e c t i n a w e r ea sf 0 u o w s ： t h eo p t i m u mw o r k i n gt e m p e r a t u r ew a s6 0 cw h e r e a st h ef r e ee n z y m ew a s5 0 。c ；t h eo p t i m u m w o r k m gp hw a s4 0w h e r e a st h ef r e ee n z y m ew a s3 5 f r o mt h ed a t ai l l u s t r a t e da b o v e ，w e c a nd r a wt h ec o n c l u s i o nt h a tt h et h e r m a ls t a b i l i t yo ft h ei m m o b i l i z a t i o ne n z y m eh a s o b v i o u s l yi m p r o v e d m o r e o v e lt h ei m m o b i l i z e dp e c t i n a s eh a daw i d e l yp hs t a b i l i t y s c o p e t h eo p e r a t i o ns t a b i l i t ya n ds t o r a g es t a b i l i t ya r ev e r yi m p o r t a n tt a r g e t st oe v a l u a t e w h e t h e rt h ei m m o b i l i z a t i o ne n z y m eh a sp r a c t i c a b i l i t ya n dt h ec o m m e r c i a l i z a t i o n i tw a s s e e nt h a tt h ei m m o b i l i z a t i o ne n z y m eh a dg o o do p e r a t i o ns t a b i l i t y i tc a ns t i l lk e e ph i g h a c t i v i t y ( 5 0 ) a f t e rt e nt i m e so p e r a t i o n s f u r t h e rm o r e ，t h es t o r a g es t a b i l i t yo ft h e i m m o b i l i z a t i o ne n z y m ei m p r o v e do b v i o u s l yt h a nt h ef r e ee n z y m ew h e ns t o r e da t4 c ( 4 ) p e c t i n a s ew a si m m o b i l i z e do nm a g n e t i cr e s i nu s i n gg l u t a r a l d e h y d ea sc r o s s - l i n k i n g r e a g e n t t e m p e r a t u r eo ft h ei m m o b i l i z a t i o nm e d i u m ，p h ，i m m o b i l i z a t i o nt i m e ，a m o u n t o ft h ee n z y m e ，c o n c e n t r a t i o no fg l u t a r a l d e h y d e ，c r o s s l i n k i n gt e m p e r a t u r ea n dt i m e w e r ei n v e s t i g a t e da si m m o b i l i z a t i o np a r a m e t e r si nt h i st h e s i s t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s f o rt h ei m m o b i l i z a t i o nw e r ea sf o l l o w s ：3 0 c ，p h 5 5 ，6 h ，0 5m lp e c t i n a s e t h e c o n c e n t r a t i o no fg l u t a r a l d e h y d ew a s0 0 1 ，c r o s s - l i n k i n gt e m p e r a t u r ea n dt i m ew e r e i o ca n d2 hr e s p e c t i v e l y u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h ea c t i v i t yr e c o v e r yo f i m m o b i l i z e dp e c t i n a s ec a nr e a c ht om o r et h a n1 3 7 5 ( 5 ) c o m p a r e dw i t hf r e ep e c t i n a s e ，t h ec h a r a c t e r i s t i c so fm a g n e t i ci m m o b i l i z e dp e c t i n a s ew e r e a sf o l l o w s ：l h eo p t i m u mw o r k i n gt e m p e r a t u r ew a s7 0 cw h e r e a st h ef r e ee n z y m ew a s5 0 c ； t h eo p t i m u mw o r k i n gp hw a s4 5w h e r e a st h ef r e ee n z y m ew a s3 5 i nt h i sr e s e a r c h ，w ec a n c o n c l u d e dt h a tt h et h e r m a ls t a b i l i t yc o e t w e e n3 0 6 0 c ) o ft h ei m m o b i l i z a t i o ne n z y m e h a so b v i o u s l yi m p r o v e d m o r e o v e r , t l l cp hs t a b i l i t yo ft h ei m m o b i l i z e dp e c t i n a s e i m p r o v e dw h e nt h ev a l u eo fp hi sb e t w e e n3 5 4 5 t h eo p e r a t i o ns t a b i l i t yi sn o ta s g o o d a st h ep e c t i n a s ei m m o b i l i z e do nn o n - m a g n e t i cr e s i n i tw a ss e e nt h a tt h e i m m o b i l i z a t i o ne n z y m eh a dag o o do p e r a t i o ns t a b i l i t y i tc a ns t i l lk e e ph i g ha c t i v i t y ( 6 1 1 1 、a f t e r s i xt i m e s o p e r a t i o n s f u r t h e rm o r e ，t h es t o r a g e s t a b i l i t yo f t h e i m m o b i l i z a t i o ne n z y m ei m p r o v e do b v i o u s l yt h a nt h ef r e ee n z y m ew h e ns t o r e da t4 c k e y w o r d s ：p e c t i n a s e i m m o b i l i z a t i o ni o n e x c h a n g er e s i n m a g n e t i z a t i o n 学位论文独创性声明 y9 0 0 6 8 1 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：毯：垄塑塑堑日期：迎： 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西 师范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文 的电子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进 入学校图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：登：塑塑 文献综述 l 果胶及果胶酶 1 1 果胶 1 i 1 果胶物质的概念 果胶( p e c t i n ) 是法国人b r a c e n n o t 于1 8 2 4 年发现的，p e c t i n 一词是由希腊文 “p e k t o s ”而来，意思为容易成胶的物质，中文译为“果胶” 1 l 。 果胶物质存在于高等植物中，是呈胶态的聚合碳水化合物的总称。其基本结 构是d 吡哺半乳糖醛酸以a 1 ，4 糖苷键连接的线型长链，其中羧基大部分被甲基 化】。现己证实：果胶类物质，代表高等植物初级细胞壁和相邻间紧密联合的一 组多糖，也代表从植物材料制备的一群复杂胶状多聚体。果胶类物质的化学组成， 要以a ( 1 ，4 ) 键合的d 半乳糖醛酸为基本结构，其中糖醛酸的羧基，可能不同程 度地甲基酯化，以及部分或全部形成盐型l “。 1 1 2 果胶物质的分类 果胶是一种天然高分子化合物，它的相对分子质量为2 3 x 1 0 4 6 1 0 5 。由于 果胶的来源不同，其分子量有很大的差异，表1 - 1 为不同来源的各种果胶分子量1 5 1 。 表1 - 1 不同物质中的果胶分子量 来源分子量 苹果和柠檬 梨 柑橘 3 0 x 1 0 5 6 0 x 1 0 5 2 5 x 1 0 4 3 5 x 1 0 4 2 3 x 1 0 4 7 1 x 1 0 4 向日葵1 2 x 1 0 5 d 半乳糖醛酸聚糖作为果胶类物质的基本结构，其甲氧基含量或酯化程度变 化的幅度很大，约为0 8 5 。依据酯化度d e 值( 酯化的d 半乳糖醛酸残基在总 的d 半乳糖醛酸残基中所占的百分数) 的不同，可以把果胶分为高甲氧基果胶 ( h i g h m e t h o x y lp e c t i n ，缩写为h m p ) 和低甲氧基果胶( 1 0 w - m e t h o x y lp e c t i n ，缩 写为l m p ) 两类，低甲氧基果胶的酯化度低于4 5 。 1 9 4 4 年4 月美国化学会正式公布“果胶类物质的修订名称”，对当时常用的几 个名词规定了它的含义 4 j ： ( 1 】原果胶( p r o t o p e c t i n ) ：指植物中水不溶性的果胶，它在有限的水解作用中产 生果胶酯酸； ( 2 ) 果胶酯酸( p e c t i n i ca c i d ) ：指甲氧基比例量较大的多聚半乳糖醛酸，它在适 宜条件下能与糖和酸形成凝胶，当甲氧基含量降低时能与某些金属离子形成凝胶。 ( 3 ) 果胶酸( p e c t i ca c i d ) ：基本上不含甲氧基的果胶类物质，就叫做果胶酸。果 胶酸的金属盐叫做果胶酸盐( p e c t i n a t e ) 。 1 1 3 果胶的结构 果胶物质广泛存在于植物的根、茎、叶、果实中，是细胞壁的重要组成成分， 与纤维素、半纤维素共同维持植物的构造。未成熟时，原果胶成分含量高，使得 水果和蔬菜具有坚硬的质构；成熟后，植物组织中的原果胶成分逐渐减少，果胶 酯酸和果胶酸成分增多，植物的质构发生相应的变化。果胶是细胞壁与细胞壁及 细胞与细胞之间的连接物质。细胞壁组成( 图1 ) 可分为质膜( p l a s m am e m b r a n e ) 、 初生壁( p r i m a r yc e l lw a l l ) 、中层( m i d d l el a m e l l a ) 【6 j 。中层以果胶物质为主，初 生壁以果胶为基质。果胶束缚水的能力很强，且随果胶链的增长，缚水性不断增 强，这给榨汁带来相当大的困难，因此要想提高果汁榨汁率就要设法先降解果胶。 图i - 1 植物细胞壁简图 果胶物质主要是由d 毗喃型半乳糖醛酸通过a 1 , 4 糖苷键连接成主链( 图 1 2 ) ，并带有中性糖( d 半乳糖、l 阿拉伯糖、d - 山梨糖、l 鼠李糖等) 侧链的高 聚物 7 , e l 。 o 图1 - 2 果胶的化学结构 2 i ，鼠李糖能与半乳糖醛酸交替出现在主链中，这段主链区称为鼠李半乳糖醛 酸聚糖区( r h a m n o g a l a c t u r o n a n ) ，无鼠李糖出现的主链区称为同型半乳糖醛酸区 ( h o m o g a l a c t u r o n a n ) ( 图1 - 3 ) 【9 1 。l 鼠李糖在果胶的主链上引入了节点，其它中 性糖再作为侧链连接于鼠李糖上。因此，鼠李糖可使主链发生扭转【1 0 】。主链中的 羧基部分被甲酯化，部分羧基结合了阳离子，部分羟基被乙酰化等，这些结构特 点构成了果胶物质分子结构的差异，并体现了不同的生物活性1 1 1 , 1 2 。 9m e g 踟a ( 甲酯化一半乳糖醛酸) ea r a ( 阿拉伯糖) a c - g a i a ( 乙酰化一半乳糖醛酸) k 7 g 矗i ( 半乳糖) 图1 3 果胶的结构 1 1 4 果胶对果汁加工工艺的影响 苹果、柑桔、山楂、桃等果实中含有较多的果胶物质，加工中汁液粘度较大， 导致压榨与澄清发生困难，因此，为了制取高质量的清汁必须用果胶酶处理果汁， 使果胶降解，提高出汁率、加速过滤和澄清 2 , 1 3 - 1 5 l 。 果胶、蛋白质、淀粉、多酚等大分子物质是造成果汁混浊的主要因素1 1 6 , 1 7 ， 其中，果胶是较主要的影响因素。胶体物质在有氧、光线照射、振动及贮藏时发 生一系列的变化，如化合、凝聚等，使果汁溶液原来的稳定性被破坏，形成混浊 直至出现沉淀【1 8 1 。控制果汁混浊的方法是合理控制酶解工艺，使果胶完全水解。 果胶酶用来分解可溶性果胶，使其转变为半乳糖醛酸，消除果胶引起的沉淀【1 9 l 。 不过酶的加入量、酶解作用时间、温度都要合理控制，过滤后的清汁及时浓缩、 杀菌、灌装，彻底使酶失活，防止后混浊的产生。 3 1 2 果胶酶 1 2 1 果胶酶及其分类 果胶酶( p e c t i n a s e ) 是催化果胶物质分解的一类酶的总称，它主要包括果胶酯酶 ( p e c t i n e s t e r a s e ，简称p e ) 、聚半乳糖醛酸酶( p o l y g a l a c t u r o n a s e ，简称p g ) 、聚甲基半 乳糖醛酸酶( p o l y m e t h y l g a l a c t u r o n a s e ，简称p m g ) 、聚半乳糖醛酸裂解酶 ( p o l y g a l a c t u r o n a t el y a s e ，简称p g l ) 和聚甲基半乳糖醛酸裂解酶 ( p o l y m e t h y l g a l a c t u r o n a t rl y a s e ，简称p m g u l 2 母2 8 1 。商品果胶酶制剂都是复合酶， 有固体和液体两种，主要由各种曲霉属霉菌制成。它除了含有数量不同的各种果 胶分解酶外，还有少量的纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和阿拉伯聚糖 酶等等。 ( 1 ) 果胶酯酶( p e ) 果胶酯酶是一种催化果胶分子中的甲酯水解生成果胶酸和甲醇的水解酶。果 胶酯酶存在于植物中，霉菌和一些细菌及酵母也能产生果胶酯酶。在霉菌果胶酶 制剂和番茄中，果胶酯酶和聚半乳糖醛酸酶或果胶酸裂解酶一起组成了活性果胶 解聚体系，因此，在使用商业酶制剂降解果胶物质时，常伴随着甲醇的释出。果 胶酯酶有如下基本性质： 果胶酯酶作用的最适p h 值，根据其来源不同而有所差别。霉菌果胶酯酶 的最适p h 约为5 0 ；细菌果胶酯酶的最适p h 则为7 5 8 0 。 果胶酯酶作用的最适温度在3 5 5 0 之间，超过5 5 ，很容易失活。 钙离子和钠离子对果胶酯酶有激活作用。 ( 2 ) 聚半乳糖醛酸酶( p g ) 聚半乳糖醛酸酶分为内切聚半乳糖醛酸酶( e n d o p 和外切聚半乳糖醛酸酶 f e x o p g ) 。 内切聚半乳糖醛酸酶随机水解果胶酸和其他聚半乳糖醛酸分子内部的糖昔 键，生成相对分子质量较小的寡聚半乳糖醛酸。通常所说的聚半乳糖醛酸酶就是 指内切聚半乳糖醛酸酶。 内切聚半乳糖醛酸酶存在于高等植物、霉菌、细菌和些酵母中，它能使底 物的粘度快速下降。由于酶只能裂开和游离羧基相邻的糖苷键，因此底物水解的速 度和程度随它的酯化程度增加而快速地下降。许多研究工作证明内切聚半乳糖醛 酸酶具有多种分子形式和同功酶。例如，在番茄中该酶有两种分子形式，分子量分 别为3 5 ，0 0 0 和8 5 ，0 0 0 。不同来源的内切聚半乳糖醛酸酶具有类似的分子量和米 氏常数值，但是它们的比活力存在着很大的差异。大多数内切- 聚半乳糖醛酸酶 的最适p h 值在4 5 范围内，其中黑曲霉内切半乳糖醛酸酶的最适p h 值是4 0 ， 4 因此它在水果加工中得到广泛的应用。 外切聚半乳糖醛酸酶从聚半乳糖醛酸链的非还原端开始，逐个水解a 一1 ，4 糖苷 键，生成d 半乳糖醛酸和每次少一个半乳糖醛酸单位的聚半乳糖醛酸。外切聚半 乳糖醛酸酶存在于高等植物和霉菌中，也存在于一些细菌和昆虫的肠道中。外切 聚半乳糖醛酸酶对溶液的粘度改变不大，但是还原性显著增加。外切聚半乳糖醛 酸酶作用的最适p h 值一般为4 5 。但也有例外，如欧氏植病杆菌外切聚半乳糖 醛酸酶的最适p h 值为7 5 。 ( 3 ) 聚甲基半乳糖醛酸酶( p m g ) 聚甲基半乳糖醛酸酶分为内切聚甲基半乳糖醛酸酶( e n d o p m g l 和外切聚甲基 半乳糖醛酸酶( e x o p m g ) 。内切聚甲基半乳糖醛酸酶随机切断果胶分子内部的a 1 ，4 糖苷键。使果胶的分子变小，粘度迅速下降；外切聚甲基半乳糖醛酸酶从果胶分 子的非还原末端开始，逐次水解a 1 ，4 糖苷键，粘度下降不明显。 ( 4 ) 聚半乳糖醛酸裂解酶( p c l ) 聚半乳糖醛酸裂解酶，又称果胶酸裂解酶，主要是由细菌产生的，个别由植 物病原菌产生，它的最适p h 值一般为8 9 5 ，可分为内切聚半乳糖醛酸裂解酶 ( e n d o - p g l ) 和外切聚半乳糖醛酸裂解酶( e x o p g l ) 。e n d o p g l 通过反式消去作用， 随机切断果胶酸分子内部的a 1 ，4 糖苷键，生成具有不饱和键的相对分子质量较小 的聚半乳糖醛酸，粘度迅速下降：e x o p g l 通过反式消去作用，切断果胶酸分子还 原性末端的a 1 ，4 糖苷键，生成具有不饱和链的半乳糖醛酸，使还原性增加，但粘 度下降不明显。 ( 5 ) 聚甲基半乳糖醛酸裂解酶( p m g l ) 聚甲基半乳糖醛酸裂解酶又称果胶裂解酶。能直接地裂解高度酯化的聚半 乳糖醛酸。霉菌和少数几种细菌都能产生果胶裂解酶，但它不存在于高等植物中。 目前所有已知的果胶裂解酶都是内切酶，它们以随机的方式解聚高度酯化的果 胶，使溶液的粘度快速下降。高度酯化的果胶是果胶裂解酶最好的底物，果胶 裂解酶同底物的亲和力随底物的酯化程度提高而增加。在果汁加工中，特别是 在含高酯化果胶的苹果汁中脱果胶时，果胶裂解酶起着重要作用。不同来源的 果胶裂解酶的分子量相近，大约为3 0 ，0 0 0 左右，但它们的最适p h 值差别较大。 例如，从黑曲霉生产的果胶裂解酶的最适p h 是6 0 左右而从镰刀霉菌分离的 酶的最适p h 值是8 6 。 果胶酯酶、聚半乳糖醛酸酶、聚甲基半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶和 聚甲基半乳糖醛酸裂解酶的作用模式如图1 4 所剥；2 7 1 。 暴胶酯酶 聚甲基半乳糖醛酸裂解酶 + 图1 - 4 果胶酶作用机制 1 2 2 果胶酶在果汁加工中的作用 果胶酶是果汁加工中应用的最重要的酶。现在已广泛用于苹果汁、葡萄汁、 柑橘汁等的生产加工中。 食品中常用的果胶酶来源于真菌，2 0 世纪3 0 年代人们已经知道了真菌酶能使 浑浊的果汁澄清，直到1 9 6 5 年日本的e n d o 和y a m a s a k i 才对果胶酶的澄清作用进 行系统的研究。研究发现苹果汁的混浊是由带负电的部分脱甲氧基的果胶与带正 睫嘬嚼拇铎商商酶母臁雉潜雉雉啄黼辱一再一辱铎锫聚露卿昏黼母嚼嚼嚼睡嚼 电的蛋白质核缠绕在一起，- 形成以蛋白质为核、果胶为壳的复核结构( 图1 5 a ) ， 果胶酶的澄清机理是破坏果胶外壳使带正电的蛋白质部分外露( 图1 5 b ) ，外部带 负电的混浊颗粒将发生静电攻击，形成大颗粒而沉淀( 图1 5 c ) i 2 9 】。为了获得出 汁率高及澄清效果好的果汁，果胶酶处理已成为加工澄清果汁所必需的步骤 3 0 - 3 3 。 果胶酶在果汁加工中的作用主要可以概括为以下两点1 3 7 】： ( 1 ) 使细胞间层的原果胶部分分解，降低果汁粘度，改善果浆的压榨性能，提 高出汁率，缩短压榨时间； ( 2 ) 分解起悬浮稳定作用的果胶，使果汁中的悬浮颗粒絮凝沉降，提高澄清效 果，防止后混浊产生，保证果汁品质 3 8 - 4 1j 。 果胶蛋白质 ab c 图1 5 果汁中果胶蛋白质的絮凝机理 2 酶的周定化 2 1 固定化酶的发展简史 酶不溶于水而显示催化活性这一现象，虽然早就为人们所熟知，但是并没有 人积极地开展酶的固定化研究工作。真正开始有效地研究、利用并积极开展固定 化的研究工作，是由g r u b h o f e r 和s c h l e i t h 在1 9 5 3 年首先开始的。他们将羧肽酶、 淀粉酶、胃蛋白酶和核糖核酸酶等结合固定在重氮化聚氨苯乙烯树脂上，第一次 实现了酶的固定化。之后，人们就开始了固定化酶的研究工作，进入6 0 年代，以 k a t z i r - k a t c h a l s k i 教授为首的科学家对酶的固定化方法和固定化酶理化性质进行了 大量的研究工作。1 9 6 9 年日本的千烟一郎博士首先将固定化氨基酰化酶应用于d l - 氨基酸的光学拆分上，实现了酶连续反应的工业化，开创了固定化酶应用的新纪 元【4 2 】。 在1 9 7 1 年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”( i m m o b i l i z e d e i l z v m e ) 的名称1 4 2 】。所谓固定化酶( i m m o b i l i z e de n z y m e ) 是借助物理方法或化学 方法将酶固定于水不溶性或者水溶性载体而制成的一种酶制剂形式【4 3 删。酶的固 7 定化( i m m o b i l i z a t i o no fe n z y m e s ) 是指通过某些方式将酶和载体相结合，酶被载 体材料束缚或限制于一定区域内进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的 一类技术【4 5 郴】。研究证明，很多酶固定化后，更趋稳定，依靠过滤和离心等简单 的方法，就可以将酶和底物分开，这样不仅可以在较长时期内反复使用，而且可 以运用装柱等连续运转方式生产。目前，固定化酶的研究领域已涉及到生物工程、 医药工程、食品工程、生命科学、高分子材料、化学工程等许多相关学科 4 4 , 4 8 - 5 4 】。 2 2 固定化酶的特点 与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同 时，还呈现稳定性高，对抑制剂的敏感性降低，有的酶具有了抗蛋白酶分解的特 性：酶与产物的分离回收容易、可多次重复使用；可以对反应进行精确控制，反 应可随时中止、启动，恒态反应可保证产品的质量稳定；适应多酶系同时反应或 继时连续反应：连续操作及自动化控制、工艺简便，且产品中不会带进酶蛋白或 细胞，提高酶的利用效率，降，氐生产成本等一系列优点。它在应用上和理论上的 巨大潜力吸引了诸多领域的科研机构及企业科技部门研究人员的注意力，成为现 代酶工程领域的研究热点，在固定化载体与固定化方法的研究上都取得了诸多进 展，固定化酶的种类也日益扩展【5 5 5 8 j 。 2 3 酶的固定化方法 酶固定化的方法很多，主要包括吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法等 4 2 小，5 6 j 9 】( 图2 - 1 ) 。 露诵圈 桊 吸附法共价偶联法交联法 包埋法 图2 - 1 固定化酶的方法 ( 1 ) 吸附法( a d s o r p t i o n ) 吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相 互作用而达到固定化目的的方法。根据吸附剂的特点又分为两种：物理吸附 ( p h y s i c a la d s o r p t i o n ) 和离子交换吸附( i o nb i n d i n g ) 4 4 , 6 0 l 。物理吸附是通过氢键、疏水 键和p 一电子亲和力等物理作用力将酶固定于不溶性载体上的方法。常用的载体有： 高岭土、皂土、硅胶、微孔玻璃、纤维素、赛珞玢和火棉胶等。离子交换吸附法 是指在适宜的p h 和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基团的相 互作用而达到酶固定化的方法。常用的载体有：c m 纤维素、d e a e 纤维素、d e a e 葡聚糖凝胶等。工艺简便及条件温和是吸附法的显著特点，其载体选择范围很大， 涉及天然或合成的无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化； 酶失活后可重新活化，载体可以再生【2 0 , 6 0 - 6 3 l 。吸附法也有许多不足，如酶量的选择 全凭经验，p h 值、离子强度、温度、时间的选择对每一种酶和载体都不同，酶和 载体之间结合力不强易导致催化活力的丧失和玷污反应产物等。 ( 2 ) 共价偶联法( c o v a l e n tc o u p l i n g ，o rc o v a l e n tb i n d i n g )共价偶联法是借助共 价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联制备以固定化酶的方 法1 4 4 , 6 0 1 。由于酶与载体间连接牢固，不易发生酶脱落，有良好的稳定性及重复使 用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法，其常用载体包括天然高分子 材料( 纤维素、琼脂糖、淀粉、葡萄糖凝胶、胶原及衍生物等) 、合成高聚物( 聚丙 烯酰胺、聚苯乙烯、尼龙、多聚氨基酸、乙烯- 顺丁烯二酸酐共聚物等) 和无机载体 ( 多孔玻璃等) f m 】。 ( 3 ) 交联法( c r o s s l i n k i n g ) 交联法是利用双功能试剂或多功能试剂 ( b i f u n c t i o n a l o rm u l t i f u n c t i o n a lr e a g e n t ) 在酶分子间、酶分子与惰性蛋白间或酶分子 与载体问进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方