（应用化学专业论文）CdTePAAP4VP核壳量子点在DNA荧光探针中的应用.pdf

摘要 本文合成了c d t e p a a p - 4 v p 核壳量子点，并构建基于c d t e p a a 4 v p 核 壳量子点和a u 纳米粒子问共振能量转移的d n a 荧光探针。 以c d t e 量子点为核，加入聚丙烯酸( p a a ) 调节c d t e 溶液p h 值，然后加 入4 乙烯基吡啶( 4 v p ) 并进行聚合，从而得到c d t e 仍w p 4 v p 核壳量子点。 p a a 作为c d t e 和p 4 v p 之间的桥梁，有利于c d t e ：p a a p 一4 v p 核壳量子点的 合成。考察了p h 值、4 v p 与c d t e 的摩尔比以及4 v p 聚合温度对合成反应的 影响，确定合适的反应条件为：p h = 7 5 ，4 v p ：c d t e = 1 4 9 2 ：1 ，4 v p 聚合温度为 8 0 c 。在此条件下合成c d t e p ! a a p - 4 v p 核壳量子点，并采用透射电镜、紫外 可见吸收光谱、荧光发射光谱和红外光谱对其进行表征。结果表明， c d t e p a a p 4 v p 核壳量子点尺寸均一，平均直径为1 3 3 n m ；相对于c d t e 核量 子点，c d t e p i 钆啪4 v p 核壳量子点的荧光强度高一倍，这有利于其在荧光探针 中的应用；c d t e p a a p 一4 v p 核壳量子点除羧基峰之外的特征吸收峰与4 v p 的 特征吸收峰相一致，表明p 4 v p 包覆在了c d t e 表面。 采用柠檬酸钠还原法制得了2 5 n m 的会纳米粒子，其吸收光谱与 c d t e ，p ：aa ，p 一4 v p 核壳量子点的荧光发射光谱重叠，符合荧光共振能量转移的要 求。将3 - s h d n a 与a u 纳米粒子相连，另一d n a 链( 与3 s h d n a 部分互 补) 与c d t e p ! a a p 一4 一v p 核壳量子点相连，分别得到a u d n a 和 c d t e p f 训p 4 v p d n a 。通过这两条d n a 链之间的杂交反应，将 c d t e p ：l w p 4 v p 和a u 的距离控制在1 1 0 n m ，从而构建基于荧光共振能量转移 的d n a 荧光探针。与c d t e p 蝴4 - v p d n a 相比，探针体系的荧光强度大大 降低，根据荧光淬灭机理的探讨发现，探针体系的荧光下降是由于 c d t e 胖a p 4 v p 和a u 之间发生了荧光共振能量转移。当加入目标d n a ( 其碱 基序列与3 - s h d n a 的碱基顺序完全互补) ，探针体系的荧光发生恢复，而当加 入单碱基错配的d n a ，荧光恢复较少。因此，此d n a 荧光探针可以用于d n a 序列的检测。 关键词：c d t e 仍- p 4 v p 核壳量子点；d n a 荧光探针；a u 纳米粒子；荧光共 振能量转移( f r e t ) a b s t r a c t i nt h i sa r t i c l e ，c d t e p 籼4 _ v pc o r e s h e l lq u a n t u md o t s ( q d s )w e r ep r e p a r e d a n dad n af l u o r e s c e n c ep r o b eb a s e do nf l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) f r o mc 矾e 限氏入霭4 趣q d s t oa u n a n o p a r t i c l e s ( a u n p s ) w a s c o n s t r u c t e d c d t eq d sw e r es y n t h e s i z e da n du s e da st h ec o r e t h e np hv a l u eo fc d t es o l u t i o n w a sa d j u s t e db yp o l y ( a c r y l i ca c i d ) ( p 从) a n d4 - v i n y l p y r i d i n e ( 4 - v p ) w a sa d d e da n d p o l y m e r i z e dt op r e p a r ec d t e p a a p - 4 - v p c o r e s h e l lq d s p a aw a sab r i d g e b e t w e e nc d t ea n dp 4 - v 只w h i c hc o n t r i b u t e dt ot h es y n t h e s i so fc d l e p l ，p 一4 - v p c o r e s h e l lq d s p hv a l u e ，m o l a rr a t i oo f4 - v pt oc d t ba n dp o l y m e r i z a t i o n t e m p e r a t u r eo f4 - v pw e r ei n v e s t i g a t e da n dp r o p e rr e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ： p hw a s7 5 ，m o l a rr a t i oo f4 - v pt oc d t ew a s1 4 9 2 ：1 ，a n dp o l y m e r i z a t i o n t e m p e r a t u r e w a s8 0 1 1 1 e n ，c d l p a m p - 4 一v pw e r ep r e p a r e d o nt h e s er e a c t i o n c o n d i t i o n sa n dc h a r a c t e r i z e d b y t r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p e ( t e m ) ， u l t r a v i o l e t - o b v i o u s l ya b s o r p t i o ns p e c t r u m ( u v ) ，f l u o r e s c e n c ee m i s s i o ns p e c t r u m ( f e ) a n di n f r a r e ds p e c t r u m ( 1 r ) n ep h o t oo ft e mi m a g es h o w e dt h a t c d t e p aa p 一4 v pq d sw e r eu n i f o r m s i z e da n d13 3 n mi n a v e r a g ed i a m e t e r s c o m p a r e dw i t hc d t ec o r eq d s ，t h eu v a n df es p e c t r u mo fc d t e p ! a a p 一4 一v po d s h a da no b v i o u s l yr e ds h i f ta n dt h ef l u o r e s c e n c eo fc d t e 佃a a 伊一4 - v pq d sw a s e n h a n c e dt ot w ot i m e sw h i c hs h o w e dt h ea d v a n t a g e si nf l u o r e s c e n c ea p p li c a t i o n i n a d d i t i o n ，t h ei rs p e c t r u ms h o w e dt h a ta l la b s o r p t i o np e a k se x c e p tf o rc a r b o x y lg r o u p s o fc d t e p ! aa p 4 v pq d sw e r et h es a m ew i t ht h a to f4 v pw h i c hi n d i c a t e dt h a t p - 4 v pc o a t e dc d t cn a n o p a r t i c l e s a u n p sw i t h2 5a mi nd i a m e t e r sw e r ep r e p a r e db yr e d u c t i o no fs o d i u mc i t r a t e i t w a sc o n f i r m e dt h a tt h e r ew a sa no b v i o u so v e r l a pb e t w e e nt h ef es p e c t r u mo f c d t e 霭k 父r 一4 - v pq d sa n dt h eu vs p e c t r u mo fa u n p s 。w h i c hw a so n eo ft h e c o n d i t i o n sf o rf r e t3 - s h - d n aw a sl i n k e dt oa u n p s ( a u - d n a ) a n da n o t h e rd n a s t r a n d ( p a r t l yc o m p l e m e n t a r yw i t h3 - s h - d n a ) w a sa s s e m b l e do n t ot h es u r f a c eo f c d t c p ! a a p 一4 - v pq d s ( c d t e p l a a p 一4 - v p d n a ) t h e n ，t h ed i s t a n c eb e t w e e n c d t e 化aa l ，p 4 v pq d sd o n o r sa n da u n p s a c c e p t o r sw a sc o n t r o l l e dw i t h i n1 1 0n m b yh y b r i d i z a t i o no fc d t e p i a a p 一4 v p d n aa n da u d n a ，w h i c hr e s u l t e di naf r e t f r o mc d r e i p aa p 4 一v pq d st oa u n p sa c c o r d i n gt of o r s t e rt h e o r ya n dad n a f l u o r e s c e n c ep r o b ew a sc o n s t r u c t e d n ef l u o r e s c e n c eo ft h i sp r o b ew a se x t r e m e l y d e c r e a s e dc o m p a r e dw i t hc d t e p a a p - 4 - v p d n ad u et of r e ta c c o r d i n gt ot h e i n v e s t i g a t i o no ft h em e c h a n i s mo ff l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g w h e nt a r g e td n a ( c o m p l e t e l yc o m p l e m e n t a r yw i t h3 - s h - d n a ) w a sa d d e d ，f l u o r e s c e n c er e c o v e r yw a s d i s c o v e r e d ，b u tn o ts oo b v i o u s l yi fs i n g l e b a s e - m i s t a c h e dd n aw a sa d d e d t h e r e f o r e ， t h i sd n af l u o r e s c e n c ep r o b ec a nb eu s e dt od e t e c td n a s e q u e n c e k e y w o r d s ：c d t e p a a p - 4 v pc o r e - s h e l lq u a n t u md o t s ( q d s ) ；ad n a f l u o r e s c e n c e p r o b e ；a un a n o p a r t i c l e s ( a u n p s ) ；f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得丞洼王些太堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：与身侵哗签字同期：叩年f 月“r 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解云洼王些太堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权丞洼王些盍堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学 校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者虢菊鸫 签字同期：口呵年f 月膨同 导师虢钐。p 厶私 签字同期洲年月，多同 学位论文的主要创新点 一、采用聚丙烯酸( p a a ) 作为聚4 一乙烯基吡啶( p 一4 一v p ) 和c d t e 的连接桥梁，合成c d t e p a a p 一4 一v p 核壳量子点。 二、采用荧光发射性能好的c d t e p a a p 一4 一v p 核壳量子点作为能量给 体，a u 纳米粒子作为能量受体，构建基于荧光共振能量转移的 d n a 荧光探针。 第一章前言 1 1 生物传感器 第一章前言 生物传感器的研究起源于2 0 世纪6 0 年代，1 9 6 7 年u p d i k e 和h i c k s 把葡萄 糖氧化酶( g o d ) 固定化膜和氧电极组装在一起，制成了世界上第一种生物传感 器。到2 0 世纪8 0 年代，生物传感器研究领域基本形成。近年来，随着科学技术 的发展与进步，生物传感器逐渐成为一种高新生物学分析检测技术，被应用到医 疗保健、食品工业、畜牧兽医、环境检测和发酵工程等多个领域，已成为人们研 究的热点之一。生物传感器与生物信息学、生物芯片、生物控制论、仿生学和生 物计算机等学科一起，处在生命科学和信息科学的交叉区域。它们的共同特征是： 探索和揭示出生命系统中信息的产生、存储、传输、n i 、转换和控制等基本规 律，探讨应用于人类经济活动的基本方法。生物传感器技术的研究重点是：广泛 地采用各种生物活性材料与传感器结合；研究和开发具有识别功能的换能器；丌 发生物传感器的应用。 1 1 1 生物传感器原理 生物传感器以固定化的生物活性成分( 酶、蛋白质、d n a 、抗体、抗原、 生物膜等) 或生物体本身( 细胞、微生物、组织等) 为敏感材料，与适当的物理 或化学换能器相结合，待测物质经扩散作用进入敏感材料，经分子识别、发生生 物学反应后，产生的信息被相应的物理或化学换能器转变成可处理的电信号，再 经信号处理单元处理后输出，便可知道待测物的相关信息n 吲。 1 1 2 生物传感器的种类 根据生物传感器组成部分( 识别部分和转换部分) 的材料或原理的不同，可以 有以下不同的分类方法： ( 1 ) 按照生物传感器中所采用的生物活性成分分类，可分为：微生物传感器、 免疫传感器、组织传感器、细胞传感器、酶传感器、d n a 传感器等。 ( 2 ) 按照生物传感器器件检测原理分类，可分为：热敏生物传感器、场效应 管生物传感器、压电生物传感器、光学生物传感器、声波道生物传感器、酶电极 生物传感器、介体生物传感器等。 天津：1 ：业人学硕十学位论文 ( 3 ) 按照生物敏感物质相互作用的类型分类，可分为亲和型和代谢型两种。 1 1 3 生物传感器的特点 相对于其它传感器，生物传感器有如下特点： ( 1 ) 特异敏感：生物传感器利用生物来源的化合物作为敏感元件，具有识别 靶分析物与类似物的高超能力，因此特异性、灵敏度和精确度较高。 ( 2 ) 快速：利用生物传感器可以直接瞬时测定分析物的示踪物或催化产物， 完成对靶物质的分析，响应速度快，且需要样品量少。 ( 3 ) 简便：生物传感器主要是由敏感元件和换能器整合在一起构成检测系统， 避免了实验室长时间多步骤的操作，体积小、成本低、操作简单，一般不需要样 品前处理，便于携带与现场检测。 ( 4 ) 连续性：生物传感器可再生和再使用固定的生物识别元件，对待检样品 可进行多次和连续测定，能实现连续检测和在线分析。 1 2d n a 生物传感器 d n a 生物传感器是最近几年发展起来的新型生物传感器咱1 ，具有很高的使 用价值。这类传感器起步比较晚，但一起步就吸收了其它各种传感器的优点，发 展速度十分迅猛，已经在许多的研究方面有所突破。用于临床疾病诊断是d n a 传感器的最大优势。对于感染类疾病诊断有关于结核杆菌、乙型肝炎病毒 ( h b v ) 、l 型艾滋病毒( h i v - i ) d n a 传感器的报道，此类传感器可用于测定相应 的细菌和病毒d n a 序列，以诊断相应疾病h 1 。 d n a 生物传感器的一个重要组成部分是信号转换装置，它与分子识别基质 可以是同一器件，也可为不同器件。其作用是把所感知的d n a 与待测物质特异 性结合产生的微小变化转变为可记录的信号。根据是否选用指示标记物，可分为t ( 1 ) 标识型，如用荧光试剂或电活性试剂标记探针或靶基因，利用荧光或氧化 还原信号的改变进行检测。选择合适的杂交指示剂是此法的关键。( 2 ) 无标记型， 如石英微天平( q c m ) 及表面等离子体基元共振( s p r ) ，分别利用质量及折射 率的变化进行检测。此法简单、易于实现在线检测。而根据d n a 转换器件转换 信号的不同，又可分为电化学、光学、声表面波法及力学检测等。主要介绍一下 光学检测法。 目前d n a 光学生物传感器主要是利用光波传导技术及消失波原理。当光完 全在棱镜底部发生全内反射时，产生的消失波渗透溶液介质可达3 0 0 r i m ，使检测 时光吸收达到最大值，从而可提高分析的灵敏度。主要分为荧光型、表面等离子 第一章前言 体基元共振型及共振镜型。 荧光型检测法是在d n a 探针中或待测靶基因中标上荧光标记物，也可在 d n a 杂交后加入荧光标记物。通过测定荧光标记嵌入d n a 双螺旋问所导致的荧 光信号的变化，检测d n a 。例如，g r a h a m 等人啤3 将1 6 m e r 或2 0 m e r 核普酸探针 固定于光纤表面，通过荧光素标记的核昔酸浓度与荧光响应的线性关系，检测了 纳克缴的d n a 序列，传感器表面可再生重复使用多次。最近，b i e r 等人旧1 以花 青二聚体y o y o 及p i c o g r e e n 作为与d n a 双链紧密亲合的荧光嵌入剂，由于与 d n a 杂交体问的双嵌入作用，使得完全配对、单碱基错配及两个以上不匹配所 产生的荧光信号有明显不同，从而能够明显区分不同d n a 序列，对目的基因的 检出限达到3 0 n g l ，是目前所报道中最灵敏的杂交传感器。循环再生6 0 次以后， 仍能有很好的灵敏度。 表面等离子体基元是金属表面上的表面电荷密度波。当改变入射角时，表面 等离子体基元共振可在反射光的一个非常尖锐的最小值观测。共振角对紧靠金属 膜外侧的介质折射率的变化非常灵敏。当金属膜表面固定的d n a 单链探针与溶 液中其互补体结合时，会引起消失波在液面与波导界面上折射率的改变，用光波 导将折射率的变化传输给检测器可进行检测。一种检测方式为s p r 扫描，是改 变入射角度，测定反射光强度与入射角的关系。如b i e r 等人们以a v i d i n b i o t i n 法 固定d n a ，用s p r 扫描法进行了核酸杂交测试。通过比较发现在共振角，可配 对的碱基个数越多，共振信号就越强，反射光强度则越小。另一种检测方式为 s p r 显微镜，是将入射角度固定在共振角附近，用c c d 射像检测反射光强与样 品不同部位的关系。c o r n 等人研究表明，此方式可区分单、双链d n a ，并有 可能进行突变识别。 1 3 荧光共振能量转移( f r e t ) 技术 基于荧光标记的d n a 检测技术近年来迅速发展，这种荧光标记法主要依赖 于d n a 标记的供受体之间的能量转移。1 9 4 8 年，f 6 r s t e r 提出了荧光共振能量转移 ( f r e t ) 的理论，所谓荧光共振能量转移指电子激发能在适当的能量供体和能量 受体对之问的传递。f r e t 分析法具有仪器简单、灵敏度高、所需样品量少、分 析速度快等优点，与色谱分离手段相结合，已成为一种有效的痕量及超痕量分析 技术。 1 3 1f r e t 的基本原理 荧光共振能量转移体系中有两个不同的荧光基团，如果一个荧光基团( 供 大沣工业人学颈+ 学竹论文 体d o n o r ) 的发射光谱与另一个基团( 受体a c c e p t o r ) 的吸收光谱有一定的重叠， 当这两个荧光基团问的距离小于1 0 n m 时，就可观察到荧光能量由供体向受体转 移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。 简单地说，就是在供体基团的激发状态下由一对偶板子介导的能量从供体向受体 转移的过程，此过程没有光子的参与，所以是非辐射性的。给体分子被激发后， 肖受体分子与给体分子相距一定距离，且给体和受体的基态及第一电子激发杏两 者的振动能级问的能量差相互适应时，处于激发态的给体将把一部分或全部能量 转移给接受体，使受体被激发，在整个能量转移过程中，不涉及光子的发射和重 新吸收。如果受体荧光量子产率为零，则发生能量转移后荧光熄灭；如果受体也 是一种荧光发射体，则呈现出受体的荧光，并造成次级荧光光谱的红移，其过程 如图1 - 1 所示。 132f r e t 的效率 ， 川 6o ， 一一- 一一一 “15r 附11 供受体问荧光共振能越转移示意幽 荧光能量转移的效率，依赖于给体荧光发射光谱同受体吸收光谱的重叠度、 给体与受体转移偶极的相对方向和给体与受体之日j 的距离，用f f r s t e r 方程式表 示； ： 墨i r ；+ 矗。 式中：r 为供受间的距离。 r 0 为能量传递达到5 0 的距离，它依赖于供受体双方的光物理性质以 及它们之f b j 的取向，用公式表示为： r 一( 8 7 9 x 1 0 8 j g2 鼬。) 知一 式中k 2 ：和能量供体与受体跃迁相互取向有关的因子 n ：溶剂的折射率 吼：无受体存在时能量供体的荧光量了产率 。 吣 ，叩e i 第一章前言 j ：光谱的重叠积分 在计算r o 时可认为能量供体与受体问的相互取向是无规则的，此时因子 k 2 = 2 3 。利用这个i 临界转移距离r 0 和实验测得的能量转移效率e 就可测出能量 供体与受体间的距离r 。 当能量供体被激发后，可通过测定激发念供体寿命的缩短，供体稳态荧光强 度的减弱，受体稳态荧光强度的增强以及荧光偏振的变化来确定e ，但常用的是 寿命测量法和荧光强度测量法两类方法。 激发念的能量供体可以通过辐射与非辐射方式失去能量。当有受体存在时， 多了一条非辐射退激的途径，故激发态能量供体的寿命缩短。使用测荧光寿命的 仪器可以很简单地得到有受体和无受体存在时的d 宰寿命t ，利用公式3 1 ： e ： i d + k lt i 。+ k t 进而算得e 。这一方法的优点是极为准确，但是由于d 宰的寿命t 为n s 数量级， 对仪器的要求很高，所以此类仪器很昂贵，且不易维修和推广使用。 荧光强度测量方法就是通过分别测量供体在没有受体和有受体时的荧光强 度来计算f r e t 效率。 荧光强度测量法测量简单，对仪器设备要求低，因此是目i i i f 使用较为普遍的 测量方法。既可以通过测量供体的荧光强度，也可以通过测量受体的荧光强度来 获得f r e t 效率。当f r e t 发生时，供体荧光减弱，而受体荧光增强，如果能准 确测量受体增加的荧光强度和供体减少的荧光强度，就可以准确测量f r e t 效 率。通过供体荧光强度来获得f r e t 效率的具体测量表达式为n ： ；f d - f o “ f d 得出，其中f d a 为受体存在时供体的荧光强度，f d 为受体不存在时供体的荧光 强度。 1 3 3f r e t 的应用 f r e t 作为1 0 n m 。1 0 0 n m 距离范围内的光学分子尺，具有高分辨率、高灵 敏度、简单方便等优点，越来越广泛地应用于无机离子的测定、酶活性的测定、 生物大分子间相互作用、生物大分子空i 、日j 结构和功能的研究、免疫分析和生物传 感器的研究中。 天津t ：业人学硕+ 学位论文 1 3 3 1 无机离子的测定 聚乙烯醇是一种可溶于水的高分子化合物，先通过氰脉酞氯将荧光胺( 给体) 和铬黑t ( 受体) 分别固定在聚乙烯醇的两个羟基上，将它作为试剂。在氨缓冲 溶液中( p h = 9 6 ) ，由于铬黑t 的吸收光谱与荧光胺的荧光光谱重叠都很小，不 发生荧光能量转移，试剂溶液呈现出荧光；当加入镁离子后，镁同铬黑t 形成络 合物，其吸收光谱向紫移，并与荧光胺发射光谱重叠，发生荧光能量转移，导致 荧光熄灭，荧光熄灭程度与镁离子浓度成比例。用此法测定镁，比相应的铬黑t 光度法灵敏度提高l o 倍以上。 1 3 3 2 酶活性的测定 l a t t 等设计了一种底物，在该底物中丹酞单元作为能量受体，它在甚至相隔 三个甘氨酞基的情况下也能淬灭色氨酸的荧光，当色氨酸一甘氨酞基之问的键断 裂时，又能恢复色氨酸的荧光。基于这种能量转移，他们测定了浚肽酶的活性。 如果将发射荧光的供体和生色团受体分别键合到反应过程中断裂基团的两 侧，那么当水解进行时，监测受体荧光的下降或供体荧光的增强，可用于分析水 解酶。 王进军等n 甜为了在活细胞内动态观察由表皮生长因子e g f 引起的p k a 酶 活性的变化，利用f r e t 原理设计了一种可以检测p k a 酶活性的报告蛋白 ( a k a r ) 。这种报告蛋白包含一个对p k a 特异性的底物结构域，一个与磷酸 化底物结构域相结合的磷酸化识别结构域。它的两端g f 的衍生物c f p 与y f p ， 利用f r e t 原理工作。当底物结构域被磷酸化后，分子内部就会发生磷酸化识别 结构域与其结合而引起的内部折叠，两个荧光蛋白相互靠近就会发生能量转移； 如果磷酸酶发生作用将其去磷酸化，分子就会发生相反的变化。通过对单个细胞 y f p 荧光强度进行随时间变化的定量分析，可以清楚地反映出e g f 诱导的单个 细胞p k a 酶活性变化大小的动念过程。 1 3 3 3 在生物大分子间相互作用中的应用 g r a h a m 等n 6 1 采用绿色荧光蛋白的变种，借助f r e t 技术，研究了r a c c d c 4 2 与其效应蛋白之问的相互作用。c h e ny 等人“铂将两蛋白质分别使用c f p y f p ( 或 b f p g f p ) 标记，当两者在同一细胞表达时，只要检测到f r e t 发生，则证明两 蛋白间距离小于1 0 0 h m ，存在相互作用。此方案己被成功地用来验证了c f p 钙 调蛋白与m 1 3 y f r p 融合蛋白问的相互作用。同时，在细胞凋亡的研究中，使用 b f p 和g f p 分别标记b c l 2 和b a x ，记录到了两者的时空相互作用。 与显微术相结合，f r e t 可以对活细胞中的蛋白质蛋白质相互作用进行显微 第一章前言 成像分析u 町。k e n w o r t h n 如利用荧光共振能量转移显微术，结合免疫荧光法，将 c y 3 和c v 5 分别作为供体和受体荧光团标记到抗体上，对蛋白质蛋白质相互作 用进行成像分析。 1 。3 3 4 在生物大分子空间结构和功能研究中的应用 f r e t 己被用于以分子水平观察生物大分子，如蛋白质、d n a ，r n a 等的空 问结构及其变化。t r i c e r r im a 1 等人通过利用荧光探针a l e x a 4 8 8 或 a l e x a 5 4 6 标记半胱氨酸突变体，成功地解决了在载脂蛋白a l 中的高密脂肪蛋 白( h d l ) 与磷脂结合的空i 、日j 结构问题，作为x 射线晶体结构分析的有益补充。 还有人将f r e t 用于r n a 构象变化的动力学研究，以及药物分子对肌动蛋白结构 的影响等。 f r e t 也被用于大分子的结构和功能作用及功能的调节机制之中。p e a r c e l l 砼订等通过构造由两侧有g f p 突变体的金属硫蛋白融合体，观察在内源性( n i t r i c o x i d e ，n o ) 产生时f r e t 的变化，揭示了金属硫蛋白在n o 信号通道中的作用。 h a m p e lk j 与b u r k ej m 乜习研究了核酶中l o o pe 1 i k e 序列构象改变对催化作用的影 响。m i y a w a k ia 等人心3 1 曾以5 异硫氰基荧光素为d 标记肌动蛋白，以a m s 为a 标 记肌钙蛋白，当二者重新组合成肌丝时，荧光基团之间会发尘能量转移。而c a 2 + 的加入会影响总荧光强度，从中显示了c a “的调节作用。 1 3 3 5 在免疫分析中的应用 这是能量转移荧光分析中，应用最多和最成功的领域，最早由u l l m a n 池 等 人提出( 1 9 7 6 年) 。常用的实验方法有竞争法和夹心法。 o s w a l d 等人心嗣将两种近红外的荧光染料s q 6 3 5 和s q 6 6 0 转化成它们的n h s 脂，将其共价结合到h s a 和抗h s a 上，形成偶联物s q 6 3 5 一h a s s q 6 6 0 一a n t i h s a 和s q 6 3 5 a n t i h a s s q 6 6 0 h a s ，利用h s a 和a n t i h s a 之间的免疫反应，可以测 定蛋白质的浓度。使用1 5 0 w 的标准氙灯，能够使检出限达到1 0 。7 m o l l 。实验 表明这两种染料光谱重叠较好，供体的量子产率和受体的消光系数较高，适用于 均相竞争免疫分析。 1 3 3 6 在传感器中的应用 w a l tdr 将荧光剂曙红作为给体，非荧光p h 指示剂酚红作为接受体，固定在 一聚合物膜( 如聚乙烯醇或牛血清蛋白) ，置于光导纤维的公共端，制成- - p h 传感器。当p h = 8 时，酚红的吸收光谱与曙红的发射光谱有最大程度的重叠。由 于荧光能量转移的淬灭作用，导致荧光强度随p h 值增高而降低，在p h = 6 0 8 o 范围内，荧光强度与p h 值变化成比例。 天津r ：业人学硕七学位论文 a h u j arc 将杂氧花青( o x a c y a n i n e ) 作为给体，双十八烷基二硫代氨基甲酸 盐作为接受体，固定在单分子l b 膜上，做成了基于荧光能量转移的金属离子荧 光纤为传感器。 u e y a m ah 等人1 以6 一羧基荧光素( 6 f a m ) 和6 羧基四甲基罗丹明 ( 6 - t a m r a ) 作为给体和受体，以对k + 特异结合的寡聚核苷酸为连接臂，得到了 一种可用于活细胞内1 0 测定的k + 传感器( p s o ) 。当无l ( + 存在时，p s o 以随机螺旋 状存在，给体和受体相对远离，f r e t 难以发生。当k + 存在时，p s o 折叠成高级 结构，使6 一f a f m 和6 t a m r a 靠近，f r e t 发生，从而实现对k + 的检测。 1 4 量子点在f r e t 中的应用 1 4 1 量子点概述 量子点，也称为半导体纳米晶体，是由尺寸小于l o o n m 的数目极少的原子 或分子组成的原子或原子团簇。目前文献中报道的主要涉及的是主族i i ，( 如 c d s e ) ，i l l v ( 如i n p ，i n a s 、和g a a s ) 、副族化合物以及s i 等元素，i i 和i i i v 副族化合物尤其引起人们的关注。量子点的特殊结构导致了它具有表面 效应、量子尺寸效应、介电限域效应和宏观量子隧道效应，从而派生出与宏观体 系和微观体系不同的低维物性，展现出许多不同于宏观块体材料的物理化学性 质和独特的发光特性。 相对于传统有机荧光染料分子，量子点具有如下特征瞄啪1 ：如连续分布激发 光谱较宽，发射光谱较窄，可通过控制半导体纳米粒子的尺寸调节荧光发射波长； 单一波长可同时激发不同大小的半导体纳米粒子，发射不同颜色的荧光，并具有 较高的量子产率和良好的化学、光学稳定性，不易发生光漂白。因此，荧光有机 分子作为生物体系的发光标记逐渐被量子点( q d s ) 所取代。 1 4 2 核壳型量子点 量子点具有大的比表面积，其表面键态和电子态都不同于颗粒内部，表面原 子配位不全导致悬挂键大量存在，这对粒子的物理化学性质都有重要的影响。另 外，量子点表面原子捕获电子或空穴的不连贯限制和降低了量子点的电学和光学 性质。为了制备稳定且发光性能优越的纳米材料，必须尽可能消除微粒表面的悬 空键，因此，已研究多种方法对纳米材料进行表面修饰。驯，其中一种有效的方法 就足用另外一种材料包覆其表面，这就是核壳型量子点，其表面适当的壳层可以 提高颗粒的光稳定性、光电化学性质、改善光谱性质，并减少对生物分子的毒性 第一章前言 口妇等。由核壳成分组成的不同可将核壳型量子点分为：无机无机核壳量子点和 无卡脯机核壳量子点。 1 4 2 1 无机无机核壳型量子点及其制备 无机无机核壳型量子点是采用无机半导体纳米材料包覆在另一种半导体纳 米粒子的表面，其无机壳层可以消除核层表面阴离子和阳离子的表面缺陷，而且 也会出现许多新的性质。根据半导体能带的相对位置的不同，无机无机核壳型 量子点分为两类：一类是由宽带隙半导体( 绝缘体) 为壳，窄带隙半导体为核，例 如：c d s e c d s ，c d s e z n s 等。这种核壳体系可以有效地钝化核微粒表面的非辐射 复合中心，核壳半导体微粒减少了核心半导体在导带的捕获态，从而显著提高发 光效率，降低荧光寿命，提高光稳定性等。另一类是以窄带隙半导体为壳，宽带 隙半导体为核，如：c d s a 9 2 s ，c d s h g s 等。这种体系可以提高电荷分离效率， 并表现出强的非线性光学性质。 无机无机核壳量子点的研究主要集中在i i 族，特别是c d s e z n s 和 c d s e c d s 体系受到了广泛和较为深入的研究口刳，此外已报道的体系还有： c d s c d ( o h ) 2 、c d s e z n s e 、h g s c d s 、c d s h g s 、c d s p b s 、z n s c d s 、z n s c d s e 、 c d s s i 0 2 、c d s a 9 2 s 、c d s 。j c d s e l x 、c d s h g s c d s 、i n p z n c d s e 、l n a s i n p 、 i n a s c d s e 、i n a s z n s e 、c d s z n o 、c d s z n s 、c d s s 、c d t e c d s 等。 制备无机无机核壳型量子点常用的方法有：沉淀法、反相微乳法、胶体化 学法、离子交换法、以及在微乳液合成时采用囊泡作微反应器，有机会属试剂法、 水热法、无机赫的水解、金属醇盐的水解等m 3 。以离子交换反应制备c d s p b s 核 壳微粒为例，通常条件下，由于c d s 和p b s 的品格常数差别很大，以聚乙烯基 吡咯烷酮为稳定剂，在水溶液中先制备出6 - - 8 n m 的c d s 微粒，并保持c d 2 + 过 量，即溶液中没有游离的s 2 。存在。然后向溶液中加入p b 2 + ，由于溶液中没有游 离的s 二，因此可以避免单独的p b s 成核，同时由于p b s 的溶度积比c d s 小得多， 在c d s 微粒的表面p b + 可以取代c d “，进而形成c d s f p b s 核壳量子点引。 1 4 2 2 无机有机核壳型量子点及其制备 无机有机核壳型量子点通常为聚合物无机纳米复合材料，它是指一类以无 机纳米材料均匀分散填充在聚合物基体中构成的复合材料。无机纳米晶的比表面 积很大，有机物对其表面进行修饰可以提供稳定的网络空间，限制晶粒的继续生 长，防止粒子聚集，因此给无机纳米晶粒带来高动力学稳定性。有机物可以钝化 材料，为粒子提供良好的表面状态。另外，有机物的特殊功能团还可以赋予材料 新的物理、化学性能。如用含硫酚醛树脂钝化c d s 纳米晶，除了尺寸、形态和 取向可控外，聚合物还可提供优良的机械特性和光学特性，使所形成的纳米复合 天津f = 业大学硕十学位论文 体系具有良好的可加工性和优良的综合光学性能。以聚合物为载体的无机纳米 复合材料综合了无机、有机和纳米材料的优良特性，具有良好的机械、光、电和 磁等功能特性，在光学、电子学、机械和生物学等许多领域具有广阔的应用前景， 已成为一个新兴的极富生命力的研究领域。剐。 将半导体无机纳米粒子与聚合物复合，目的是得到兼有无机纳米粒子稳定性 能好以及有机材料结构可控、加工简便、价格低廉等优点的复合纳米材料，但是 在真正实施的过程中，面临许多问题需要解决，从而使人们发展出很多种制备纳 米粒子聚合物复合材料的方法。 a 直接共混法 最简单也是最早发展起来的方法是直接分散法。卅踟。直接分散法又称共混 法，即先合成出各种形态的纳米粒子，再通过各种方式与聚合物复合，制备聚合 物基纳米复合材料。利用该方法制各的复合材料在电致发光、光伏太阳能电池以 及温敏材料等领域已有应用，有的已经达到产业化生产h 叫。该方法虽然简单， 纳米粒子与材料的合成是分步进行的，纳米粒子的形态、尺寸均可控制，但由于 无机纳米微粒具有较高的表面自由能，易于自发团聚，在利用直接分散法制备纳 米粒子聚合物复合材料过程中不可避免地出现纳米微粒的团聚现象，导致纳米 粒子在聚合物中分散不均匀，丧失或部分丧失其特有的功能和作用。 b 原位生成法 原位生成法是无机纳米粒子不预先制备，而是在反应中就地生成的一种方法 1 2 - 4 4 。该法主要用于制备过渡会属硫系化合物或卤化物聚合物复合材料，其基本 原理是，将基体与会属离子( m + ) 预先组成前驱体，使金属离子在聚合物中均 匀、稳定分散，然后暴露在对应组分( 如s 7 。，s e 孓) 气体或溶液中，原位反应生 成纳米粒子。其中第一步是控制微粒大小和均匀分散的关键，基体中要有限制、 吸附进而稳定金属离子的几何因素( 如空隙) 或化学组成结构。可以通过对聚合 物基体分子结构的设计、剪裁来控制粒子的粒径及分散性。嵌段共聚物和聚合物 共混物的相分离行为也有助于半导体团在形成过程中的分散。 c 层层组装法 层层组装法是由d e c h e r 发展起来的。忏倒。这是一种利用带相反电荷的聚电 解质在基片上交替沉积制备薄膜的一种方法，驱动力通常为静电力，它的简便与 普适性使其可以应用在许多领域。经过不断完善和发展，其无论在理论还是实际 应用等方面都得到深入的研究。近年来，层层组装技术也被应用在纳米粒子与聚 合物组装方面，所制备的复合材料具有电致发光的性质州。其缺点是仅适合制 备膜材料，如果制备体相材料则有一定困难。 d 溶胶凝胶法 第一章前言 溶胶凝胶法始于1 8 4 6 年e b e l m e n 和g r a h a m 对正硅酸乙脂在酸性条件下水 解形成玻璃状材料s i 0 2 的研究。所谓溶胶凝胶技术是指烷氧基金属化合物在溶 液中水解、缩合成溶胶液，然后除去溶剂转化为凝胶，最终制得固体氧化物或其 它固体化合物的方法。溶胶凝胶过程中水解和缩合反应一般是同时进行的，水 解、缩合的每一步都产生小分子副产物，如醇、水。这些小分子化合物从体系中 的离去是导致网络形成进而材料形成过程中高收缩率的主要原因h 引。 e 表面接枝法 纳米晶与聚合物介质问共价键的形成是避免产生相分离的有效方法。对于有 机金属法制备的纳米晶，常用手段是通过配体交换，在纳米晶表面部分引入可聚 合功能基团，通过它们与聚合物单体共聚，形成稳定的结构。具体的聚合方式有 自由基聚合、转移聚合、活性聚合等郾嵋刳。表面接枝方法还可以实现聚合物对单 个纳米晶的包覆。由于形成交联的聚合物保护层，纳米晶与外界环境几乎完全隔 绝，使复合纳米晶具有超强的抗酸碱、氧化和光氧化能力1 。如果在纳米晶表面 接枝上生物大分子或具有生物亲和能力的聚合物，就