（植物学专业论文）铜绿微囊藻的二氧化碳浓缩机制及uvb辐射对其影响的研究.pdf

摘要 许多藻类尤其是蓝藻可以通过二氧化碳浓缩机制f c 0 2c o n c e n t r a t i n g m e c h a n i s m s ，c c m ) 提高胞内c 0 2 浓度，用以弥补其r u b i s c o 对c 0 2 过低的亲和力。 不同的生物或者同种生物由于生存环境条件的不同而有不同的c c m 。c c m 的调节 对细胞能量和营养物质的分配相当重要，同时许多环境因子也可以影响其组分的表 达。本文在综述了蓝藻的二氧化碳浓缩机制的基础上对有害水华蓝藻之一铜绿微囊 藻的二氧化碳浓缩机制及紫外线b ( t w b ) 对此机制的影响进行了探讨。 铜绿微囊藻能够直接利用h c 0 3 进行光合作用，在通空气培养时具有多种二氧 化碳( c 0 2 ) 和碳酸氢根o i c 0 3 - ) 转运系统；其羧体一般为五角形或者圆形，数目 为3 4 1 士1 3 7 个。经过长期的u v - b 辐射，铜绿微囊藻的最大光合放氧速率几乎没 有变化，但是对外界无机碳的表观亲和力却显著增加。在胞外无机碳浓度为1 5 0 g m o l l 1k h c 0 3 及p h8 0 条件下，n a + 依赖型的h c 0 3 转运子对光合作用的贡献份额 由对照样品的4 3 4 - 4 0 2 降低到u v - b 处理样的3 4 5 - 3 1 9 ，而n a + 非依赖型的 h c 0 3 转运子对光合作用的贡献份额由对照样品的8 7 增加到处理样的1 8 3 。c 0 2 转运系统对u v b 辅射没有h c 0 3 。转运系统敏感，它们对光合作用的贡献份额几乎 没有变化，在对照样和处理样中分别为4 7 9 - 5 1 o 和4 9 8 4 7 2 。虽然u v - b 辐射 对不同无机碳转运子的影响不同，但是总的d i c ( 溶解性c i ) 转运几乎不受影响。 经过长期u v b 辐射，铜绿微囊藻细胞内羧体的形状虽然没有变化但是数目减少到 2 7 0q - 1 1 8 个。因此，铜绿微囊藻可以通过有效地调节自身的二氧化碳浓缩机制运 转以适应外界u v - b 的长期辐射。 关键词：二氧化碳浓缩机制；c 0 2 转运系统；h c 0 3 转运系统；光合放氧； 羧体；铜绿微囊藻；紫外线- b a b s t r a c t m a n ya l a g er e q u i r ec 0 2c o n c e n t r a t i n gm e c h a n i s m ( c c m ) t oi n c r e a s et h ec 0 2 c o n c e n t r a t i o ni nt h ep r o x i m i t yo fr u b i s c oa n dt oc o m p e n s a t ef o rt h el o wa f f i n i t yo f r u b i s c of o rc 0 2 ，a n dt h i si se x p e c i a l l ye v i d e n ti nc y a n o b a c t e r i a an u m b e ro fc c m v a r i a n t sh a v eb e e nf o u n da m o n gt h ed i f f e r e n ts p e c i e so ri nt h es a m es p e c i eu n d e r d i f f e r e n tg r o w nc o n d i t i o n s c c mm o d u l a t i o nm a yb ec r u c i a li nt h ee n e r g e t i ca n d n u t r i t i o n a lb u d g e t so f c e l l ，a n dam u l t i t u d eo fe n v i r o n m e n t a lf a c t o r sc a ne x e r tr e g u l a t o r y e f f e c t so nt h ee x p r e s s i o no fc c mc o m p o n e n t s t h ec c mi nc y a n o b a c t e r i u mw a s r e v i e w e di nt h ep r e s e n tp a p e r , a n dt h e nw es t u d i e dt h ec c mi no n eo ft h em o s th a r m f u l b l o o m - f o r m i n gc y a n o b a c t e r i u mm i c r o c y s t i sa e r u g i n o s ak t i t z8 5 4a n dt h ee f f e c t so f u v - bo ni t so p e r a t i o n a i r - g r o w n 彪a e r u g i r l o s a8 5 4c o u l dm i l i z eh c 0 3 。f o ri t sp h o t o s y n t h e s i sa n d p o s s e s s e dm u l t i p l et r a n s p o r t e r sf o rc 0 2a n dh c 0 3 。i t sc a r b o x y s o m e sw e r er e g u l a r l y p e n t a g o n a lo rr o u n da n dt h ea v e r a g en u m b e ro fc a r b o x y s o m e sp e rc e l ls e c t i o nw a s 3 4 1 士 1 3 7 a f t e re x p o s e dt 0l o n g - t e r mu v - b t h em a x i m a lp h o t o s y n t h e t i cr a t ew a s a p p r o x i m a t e l yt h es a m e ，b u tt h ea p p a r e n ta f f m i t yf o rd i s s o l v e di n o r g a n i cc a r b o nw a s s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d a t1 5 0 “m o l l 1k h c 0 3a n dp h 8 0 ，n a + - d e p e n d e n th c 0 3 t r a n s p o r t e rc o n t r i b u t e d4 3 4 - 4 0 2 t ot h ep h o t o s y n t h e s i si nt h ec o n t m kw h i l ei tw a s 3 4 5 - 3 1 9 i nu v - bt r e a t e dc e l l s h o w e v e r , t h ec o n t r i b u t i o no fn a + - i n d e p e n d e n t h c o ；。t r a n s p o r t e ri n c r e a s e df i o m8 7 i nt h ec o n t r o lt o1 8 3 i nu v - bt r e a t e dc e l l s a sf o rc 0 2 - u p t a k es y s t e m s , t h e yw e r el e s ss e n s i t i v et h a nt h eh c 0 3 。t r a n s p o r ts y s t e m s ， a n dt h ec o n t r i b m i o nb e t w e e nt h e ms h o w e dl i t t l ed i f f e r e n c e , r e s p e c t i v e l y4 7 9 - 5 1 o i n t h ec o n t r o la n d4 9 8 _ 4 7 2 i nu v - bt r e a t e dc e l l s t h u s t h er a t eo ft o t a li n o r g a n i c c a r b o nu p t a k ew a sm a r g i n a l l ya f f e c t e da l t h o u g hu v - bh a dad i f f e r e n te f f e c to nv a r i o u s i n o r g a n i cc a r b o nt r a n s p o r t e r s c a r b o x y s o m e si nt h eu v - bt r e a t e ds a m p l e sa p p e a r e dt o h a v en o r m a ls t r u c t u r e b u tt h e i rn u m b e r ss i g n i f i c a n t l yd e c l i n e dt o2 7 0 - 士1 1 8 t h e r e f o r e , c c mc a nb ee f f i c i e n t l yr e g u l a t e dt oa d a p tt ot h el o n g - t e r mu v - be x p o s u r ei n 膨 a e r u g i n o s a k e yw o r d s ：c a r b o x y s o m e ；c 0 2c o n c e n t r a t i n gm e c h a n i s m ；c 0 2 u p t a k es y s t e m ； h c 0 3 t r a n s p o r ts y s t e m ；m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a ；p h o t o s y n t h e t i c o x y g e ne v o l u t i o n ；u v 二b 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 饼挠卑辛磷 吼渺产厂月髟日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，l l p 学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权 中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通 过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：宝争之殇 日期沙7 年多月铲日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。回壶i 金塞逞銮厦澄卮；旦兰玺 旦二笙i 旦三生筮查! 作者签名：豪辛镑 日期：矽7 年月岔日 第一章蓝藻二氧化碳浓缩机制的研究进展 蓝藻是一类分布广泛的可以进行放氧光合作用的原核生物，它利用c 0 2 浓缩机 制( c c m ) 来提高羧体内c 0 2 浓度以补偿其r u b i s c o 对c 0 2 亲和力的不足( e s p i ea n d c a n v i n1 9 8 7 , m i l l e re ta 1 1 9 9 0 ) 。c c m 包括以下步骤：无机碳( c i ：c 0 2 和h c 0 3 ) 经相应的转运子跨质膜转运，在胞内以h c 0 3 。形式累积；细胞质中累积的h c 0 3 。经 扩散进入羧体，后由碳酸酐酶( c a r b o n i ca n h y d r a s c , c a ) 催化脱永形成c 0 2 ，引起 r u b i s e n 周围c 0 2 浓度升高；其中，相当一部分c 0 2 被r u b i s c o 固定，余下的c 0 2 在向外扩散过程中被依赖于光能的c 0 2 转运途径部分回收( 图1 ) ( v o l o k i t ae ta 1 1 9 8 4 ，b a d g e re ta 1 1 9 8 5 ，m i l l e re ta 1 1 9 9 0 ，k a p l a na n dr e i n h o l d1 9 9 9 ，p r i c ee ta 1 2 0 0 2 ) 。由于不同蓝藻利用外界c i 不同故它们所拥有的转运子也不同，但是所有的 c c m 都有相同的生理现象：0 2 对c t h 固定的抑制作用较低；c 0 2 补偿点较低；对 外界c i 亲和力较高等( g i o r d a n oe a 1 2 0 0 5 ) 。 f i g 1 ag e n e t i cm o d e lf o rt h eo p e r a t i o no f8p h o t o s y n t h e t i cc 0 2o a n c e n t m t i n g m e c h a n i s mi nc y a n o b a c t e r i a ( g i o r d a n oe ta 1 2 0 0 5 ) 。 图1 蓝藻c c m 工作模式图。 1 二氧化碳浓缩机制的组成 蓝藻c c m 包括两类主要的功能元件：一类是无机碳转运子，它将c i 转运到细 胞内并以h c 0 3 的形式在胞质内积累；另一类是羧体，其内含有c a 和r u b i s c o h c 0 3 在此被转化成c 0 2 同时进行光合作用。 1 1 无机碳转运系统 蓝藻对c 0 2 具有高亲和力，即使在碱性p h 值条件下，它也更倾向于以c 0 2 为 碳源( 特别是生长于低c 0 2 浓度下的藻细胞) 。因此，h c o ；转运系统一直在c 0 2 转运系统的掩盖下很难被直接发现，但现代分子生物学技术的发展使筛选缺乏c 0 2 转运能力的突变株成为现实，很好地解决了这个问题。目前，在蓝藻中至少发现五 种无机碳转运子( 图2 ) 。两种c 0 2 转运子分别是：( 1 ) 组成型c 0 2 转运系统n d h - 1 4 ， 由n d h d 4 n d h f 4 c u p b ( c h p x ) 组成( s h i b a t d e t a l 2 0 0 1 m a e d a e t a i 2 0 0 2 。p r i c ee t a l 2 0 0 2 ) ；( 2 ) 低c 0 2 诱导型c 0 2 转运系统n d h 1 3 ，由n d h d 3 n d h f 3 c u p a ( c l a p y ) 组成( s h i b a t a e t a l 2 0 0 1 ，m a e d a e t a l 2 0 0 2 ) 。三种h c 0 3 转运子分别是：( 1 ) b c t l ， 一种诱导型高亲和力的n 矿非依赖型h c 0 3 转运子。由c m p a b c d 操纵子编码( o m a t a e ta 1 1 9 9 9 ) ；( 2 ) s b t a ，一种诱导型高亲和力的n a + 依赖型h c 0 3 。转运子由s b t a 基 因编码，在无机碳转运中起重要作用( s h i b a t a e t a l 2 0 0 2 ) ；( 3 ) b i c a ，最近新发现 的一种n a + 依赖型h c 0 3 转运子，对h c 0 3 亲和力较低但转运速率很高( p r i c ee ta 1 2 0 0 4 ) 。 1 1 1 依赖于n d h 1 脱氢酶复合体的c 0 2 转运 c 0 2 既可以溶于水也可以溶于脂类，一般认为它通过细胞膜上的水通道以扩散 的方式进入细胞内，然后通过位于类囊体膜上的两种特殊的n d h - i 复合体转交为 h c 0 3 。s y n e c h o c y s t i ss pp c c 6 8 0 3 和其它蓝藻的基因组分析表明蓝藻中只有i 型 n a d ( 1 ) t t 脱氢酶即n d h 1 ( k a n e k oe ta 1 1 9 9 6 ) 。n d h 1 复合物在胞内有不同的作 用，编码它的基因既有单拷贝也有多拷贝，其中与c 0 2 转运有关的两种为多拷贝基 因，分别是n d h d 和n d h f , 前者有6 个拷贝即基因n d h d l 6 ，而后者只有3 个拷贝 ( n a k a m u r a e t a l 1 9 9 8 ) 。基因突变分析表明n d h d i n d h d 2 和n d h f i 与呼吸作用中氧 化n a d p h 和还原i q 有关，能够促进p s i 的循环电子传递，n d h d y n d h d 4 希7 n d h f 3 n d h f , 则催化c 0 2 的主动吸收，把c 0 2 转化为h c 0 3 ，n d h d j n d h d 6 功能不祥 ( k l u g h a m m e r e ta 1 1 9 9 9 ，o h k a w ae ta 1 2 0 0 0 a , b s h i b a t ae ta 1 2 0 0 1 ) 。另外还有两种 蛋白质c h p y ( c u p a ) 和c h p x ( c u p b ) 也参与c 0 2 的吸收，关于c h p x 和c h p y 的具体功能目前尚不清楚，一种模型认为它们有类似于碳酸酐酶的功能，在光照条 2 件下催化细胞质内c 0 2 到h c o f 的转化，从而在c 0 3 的主动转运中起作用( p r i c e e t a 1 2 0 0 2 ) 。上述成分组成了两种c 0 2 转运系统：n d h f j n d h d y c h p y 基因编码商c 0 2 亲和力n d h - 1 3 复合体，而由n d h f 4 n d h d d c h p x 基因编码的则是低亲和力n d h 一1 4 复合体( m a e d ae ta 1 2 0 0 2 ，s h i b a t ae ta 1 2 0 0 1 ) 最近，蛋白质组学研究只证实了 n d h f 4 n d h d 4 c h p y s n1 7 3 5 存在于类囊体膜上，作为亚复合体在c i 限制下被诱导， 但没有在类囊体膜上检测到n d h f 3 n d h d 3 c h t y ( h e n a n a ne ta 1 2 0 0 4 ，p r o m m e e n a t e e ta 1 2 0 0 4 ，z h a n gc ta 1 2 0 0 4 ，b a t t c h i k o v ae ta 1 2 0 0 5 ) 。 r i g 2 f i v ec iu p t a k em e c h a n i s m si nc y a n o b a e t e r i a t h r e eb i c a r b o n a t et r a n s p o r t e r s ， b c t l ，b i c aa n ds b t a , l o c a t e do nt h ep l a s m a m e m b r a n ea n dt w oc 0 3u p t a k es y s t e m s ， n d h - 1 3a n dn d h - 1 4 , o nt h et h y l a k o i d s ( b a d g e re ta 1 2 0 0 6 ) 图2 蓝藻的五种无机碳转运系统。 1 1 2b c t l 型h c 0 3 转运系统 b c t l 型h c 0 3 转运子是最早被发现和研究的c i 转运子。低c 0 2 诱导 s y n e c h o c o c c u s7 9 4 2 的质膜合成4 2 k d 蛋白，这种蛋白的发现使得我们对h c 0 3 转 运机制的研究进入到分子水平( o m a t aa n do g a w a1 9 8 5 ，1 9 8 6 ) 。在s y n e c h o c o c c u s 7 9 4 2 中，该4 2 k d 蛋白是由c m p a ( e c y t o p l a s m i cm e m b r a n ee r o t e i n ) 编码的，c m p a 与c m p b ，c m p c 及c m p d 共同组成一个操纵子( o m a t ae ta 1 1 9 9 0 ，o n l a t a1 9 9 2 ) 。 近期研究表明c m p a 是h c 0 3 的结合位点，c m p b 位于膜内以二聚体的形式存在， c m p c 和c m p d 为膜外周蛋白，为a t p 的结合位点( m a e d ae ta 1 2 0 0 0 ，b a d g e ra n d 3 硕士肇位论文 m a s t e r s t h e s i s p r i c e2 0 0 3 ) 。b c t l 型高亲和力h c 0 3 - 转运系统属于a b c ( a t pb i n d i n gc a s s c s c ) 型转运子家族，也就是通常所说的转运a t p a s e s ，该家族成员通常由a t p 提供能量 ( h i g g i n s2 0 0 1 ) 。b c t l 型h c 0 3 - 转运系统只存在于淡水生境的1 3 蓝藻中，而在海 洋蓝藻中不存在( b a d g e ra n dp r i c e2 0 0 3 ) ，原因可能有两点：( 1 ) 海洋中有较高 的n a + 梯度用来做c i 转运的动力而非a t p ( b r y a n t2 0 0 3 ) ；( 2 ) 或者海洋中h c 0 2 浓度相对较高，对亲和力高而又耗能的h c 0 2 。转运子的需求少( b a d g e r c ta 1 2 0 0 6 ) 。 1 1 3s b t a 型h c 0 3 。转运系统 s b t a 型h c o f 转运子最初是在s y n e c h o c y s t i s 6 8 0 3 的厶n d h d j n d h d 4 双突变株中 被证实的，4 n d h d j n d h d 4 s b t a 突变株几乎完全失去转运c i 的能力。它专一依赖于 n d ，h c 0 2 转运速率在6m m o l l 。1n a + 时达最大值，大约需要lr r i mn a + 才能达到最 大值的一半( s h i b a t ae ta 1 2 0 0 2 ) 。n t p j 在s y n e c h o c y s t i sp c c 6 8 0 3 的无机碳转运中起 到重要作用，其具体功能还不确定，可能是一个原初外向n 矿泵，为s b t a 型h c 0 3 。 转运子所必需( s h i b a t a e t a l 2 0 0 2 ) ，另外n d h r ( c c m r ) 可以调节s b t d 的表达( w a n g e ta i 2 0 0 4 ) 。 1 1 4b i c a 型h c o f 转运子 b i c a 是在海岸蓝藻s y n e c h o c o c c u sp c c 7 0 0 2 中被发现的一种n a + 依赖性h c 0 3 转运子，但是与s b t a 型h c 0 3 。转运系统没有明显的序列同源性。它对底物的亲和 力相对较低( 大约3 8um ) 但却可以维持较高的光合速率( p r i c ee ta 1 2 0 0 4 ) 。b i c a 转运子的活性达到最大速率一半时大约需要1 7m mn a + ，达到饱和速率时约需要 2 0m mn d ( p r i c ec ta 1 2 0 0 4 ) 。s y n e c h o c o c c u sp c c 7 0 0 2 中的b i c a 在碳限制条件下 被高效地诱导表达，在高c 0 2 环境中只有较低水平的表达。此外，在s y n e c h o c o c c u s w h 8 1 0 2 和s y n e c h o c y s t i sp c c6 8 0 3 中虽然也发现了这种转运子，但是在 s y n e c h o c y s t i sp c c6 8 0 3 中b i c a 基因可能是组成性表达( p r i c ee ta 1 2 0 0 4 ，w a n ge ta 1 2 0 0 4 ) ，而在s y n c c h o c o c c u sw h8 1 0 2 中此方面的研究还不是很清楚。 目前在蓝藻中已经发现两种n r 依赖型的h c 0 2 转运系统，n a ? 在h c 0 2 。转运中 的作用可能为：( 1 ) 参与n a + h + 反向运输系统，产生a t p ；( 2 ) 参与n a + h c 0 2 。 同向转运子，以a t p 为能量将h c 0 2 - 转运至胞内( g i o r d a n oe t a l 2 0 0 5 ) 。 1 2 羧体 羧体为蛋白小体，在蓝藻c c m 的运转过程中起关键作用。细胞中绝大部分 r u b i s e o 位于其内，同时还含有c a ( p r i c ea n db a d g e r1 9 9 1 ，p r i c ee ta 1 1 9 9 2 ，s oa n d e s p i e1 9 9 8 ) 。根据r u b i s c e 与羧体结合方式的不同可以将羧体分为两类，后来系统 4 发生学分析表明这两类羧体的基因也不同，含有1 a 型r u b i s c o 和含有l b 型r u b i s c o 的羧体分别为d 型羧体和b 型羧体。相应地，蓝藻也可分为a 一型和1 3 一型( b a d g e r e ta 1 2 0 0 2 ) 。 一些编码羧体的基因已经被鉴定、测序和作图。从蓝藻s y n e c h o c o c c u ss t r a i n p c c 7 9 4 2 的突变株中得到一个编码羧体蛋白的基因簇：c c m k , c c m l , c c m m , , c c m n ， c c m o ，虽然这个基因家族所编码产物的具体功能不确定，但是这些产物却为羧体的 结构和功能所必需。通过序列分析可知在s y n e c h o c o c c u s 中，基因c c m k 和c c m o 与 化能自养菌中编码羧体膜的基因c s o s l 有极高的同源性，可推测该基因产物为蓝藻 羧体膜的组成成分( p r i c ee ta 1 1 9 9 3 ) 。 目前认为羧体在c c m 中起两方面的作用( 邱保胜和高坤山，2 0 0 1 ) ：( 1 ) 充当 微室，借助低水平的c a 活性催化h c 0 2 脱水产生c 0 2 ，从而使羧化部位c 0 2 浓度 升高。这样即可以活化r u b i s c o ( s c h w a r z e t a l 1 9 9 5 ) ，还可补偿蓝藻r u b i s c o 对c 0 2 相对较低的亲和力，进而降低0 2 对光合作用的竞争性抑制。( 2 ) 作为c 0 2 泄漏的 屏障( p r i c ea n d b a d g e r l 9 8 9 b ) ，但是羧体如何解决c 0 2 泄漏的问题还有待于进一步 研究。有人认为是由于c a 分布在羧体的中心位置。其催化脱水产生的c 0 2 在扩散 出3 - 4 r i m 厚的羧体鞘之前就被固定( c a n n o ne ta 1 2 0 0 1 ) 。有人认为羧体鞘是c 0 2 泄漏屏障，但是这方面的证据很少。己知0 2 很容易扩散进入羧体( s h i v e l ye ta 1 1 9 9 8 ) ，如果c 0 2 泄漏屏障位于羧体鞘，则羧体鞘的孔径应该介于0 2 和c 0 2 分子直 径之问，但是在s y n e c h o c y s t i sp c c6 8 0 3 中，c 0 2 比0 2 更容易透过羧体鞘( m a r c u s e t a 1 1 9 9 2 ) 。也有人认为c 0 2 主动转运系统在回收泄漏的c 0 2 中充当重要的角色，从 而使羧体中的c 0 2 泄漏降到最低程度( p r i c e e ta 1 2 0 0 2 ) 。 1 3 无机碳转运的能量需求 研究表明，依赖于n d h - l 的循环电子传递主要驱动c 0 2 转运( o g a w a1 9 9 3 ) 。 利用特异性的电子传递抑制剂与电子受体研究发现s y n e c h o c o c c u su t e x6 2 5 的 c 0 2 转运依赖于循环电子传递，而h c 0 2 转运依赖于线性电子传递( l ia n dc a n v i n 1 9 9 8 ) 。进一步的研究表明，低c 0 2 诱导型c 0 2 转运系统可能由p s i 活性支撑，而 p s i 活性依赖于p s i i 向p s i 的电子传递；组成型c 0 2 转运系统部分依赖于p s i 循环 电子传递( m a e d a e t a l 2 0 0 2 ，o g a w a a n d k a p l a n 2 0 0 3 ) 。循环电子传递和线性电子传 递都可引起跨类囊体膜i i 旷，p 矿是形成a t p 的必需条件。而a t p 可以为a b c 型h c 0 3 繁运子提供能量，也可被用来产生| ln a + ，从而推动s b t a 或b i c a 型h c 0 3 。 转运子的运转( o g a w aa n dk a p l a r g2 0 0 3 ，p r i c ee ta 1 2 0 0 4 ) 。研究表明，在c 0 2 主动 转运中ap 矿是推动c 0 2 向h c 0 3 转化的直接能源( t c h e m o vc ta 1 2 0 0 1 ) 2 蓝藻的无机碳跨质膜转运研究 2 1 测定胞内累积无机碳的研究方法 测定胞内累积无机碳的方法有以下三种( 邱保胜和高坤山，2 0 0 1 ) ： ( 1 ) 硅氧烷液体离心技术：k a p l a n 等( 1 9 8 0 ) 运用硅氧烷液体离心技术进行 的开创性研究第一次直接地证实蓝藻能在胞内累积c i ，他们发现照光后多变鱼腥藻 ( a n a b a e n a v a r i a b i l i s ) 细胞可在胞内累积高于胞外5 0 0 倍的c i ，目前，硅氧烷液体 离心技术仍是最直接的证明蓝藻细胞累积c i 的方法。藻细胞温育在缓冲液内，其下 为一层硅氧烷液体，接下来是碱性淬灭溶液。在光下以1 4 c 标记的溶解性无机碳 ( d 1 1 4 c ) 温育细胞，然后通过离心使细胞经硅氧烷液体层进入碱性淬灭溶液而迅速 终止c i 吸收。这种溶液尔后用于分析有机组分中酸稳定的1 4 c 和已在胞内积累但尚 未被代谢的酸不稳定1 4 c 。 ( 2 ) 质谱检测：采用装备有气透膜系统的质谱仪测定胞外c 0 2 浓度，分析细 胞对c i 的积累。实验材科温育在与质谱仪相连的气透膜封闭小池中，用金属网支 撑的二甲基硅氧烷橡胶膜将质谱仪的入口毛细管与细胞悬液分开，只有氧气和二氧 化碳等气体能渗透膜进入质谱仪。由于质谱测定的是c 0 2 浓度，因而须在反应液里 加入碳酸酐酶以确保c 0 2 信号与总c i 浓度成比例。i ，在光下向被抑制了c a l v i n 循 环的细胞悬液中加入c a ，通过检测反应液中二氧化碳减少估测库大小；i i ，c i 以 库形式存在于胞内，关掉光源后检测从细胞中泄漏出的二氧化碳以估计库大小 ( b a d g e re ta 1 1 9 9 4 y ue ta 1 1 9 9 4 ) 。 ( 3 ) 荧光淬灭检测：m i l l e r 等( 1 9 9 1 ) 最早注意到c i 积累与p s i i 光化学淬 灭问有密切联系。胞内c i 积累引起叶绿素a 荧光相对于c 0 2 补偿点时发生淬灭， 在无c 0 2 固定条件下荧光淬灭程度与胞内c i 浓度密切相关。尽管c 0 2 固定本身也 起到淬灭荧光的作用，但有c 0 2 固定时，胞内c i 库大小与荧光淬灭程度间仍密切 相关。因此，运用脉冲调制荧光仪，同步测定光合放氧或c 0 2 转运，即可监测c i 库状况。尽管荧光淬灭技术仅对c i 库形成的初始速率或c i 库大小提供间接的定性 估计，但它具有应用方便、无损伤和快速的特性。 2 2 蓝藻细胞利用h c o s - 的证据 证明蓝藻利用h c 0 3 。作为碳源的方法有以下六种： ( 1 ) 比较不同p h 条件下的光合速率：当环境中c 0 2 浓度一定时，在碱性p h 6 和较酸性条件下分别测定藻细胞的光合速率。如果光合速率在碱性p h 下明显高于 较酸性条件下的速率，便可认为h c 0 3 通过了细胞膜并为光合作用提供了碳源。当 然，其它因素也可能引起光合速率在高p h 值条件下上升。 ( 2 ) 比较h c 0 3 。脱水与c 0 2 固定速率：c i 在水环境中以h 2 c 0 3 、c 0 2 、h c 0 3 。 和c 0 3 2 - 的形式存在( 其中h 2 c 0 3 的相对含量很低，可以忽略不计) ，几种形态的 c i 之间存在动态平衡。当反应液中没有c a ( h c 0 3 。脱水反应的催化剂) 时，h c 0 3 。 脱水产生c 0 2 的速率很低，此时蓝藻的光合作用将会受c 0 2 供给的限制。在这种情 况下，如果光合速率高于h c 0 3 脱水产生c 0 2 的速率，即可证实这种蓝藻中存在 h c 0 3 的主动运输。 ( 3 ) 比较h c 0 3 脱水与溶解性c i ( d i c ) 积累速率：向反应液中加入一定量的 h 1 4 c 0 3 ，监测蓝藻细胞在胞内累积d 1 1 4 c 的时间进程。实验结果表明，胞内d 1 1 4 c 积累的初始速率高于反应液中h 1 4 c 0 3 脱水生成1 4 c 0 2 的速率，这为蓝藻细胞主动吸 收h c 0 3 提供了令人信服的证据。 ( 4 ) 以质谱仪检测c 0 2 泄漏：采用抑制c 0 2 转运的方法可为蓝藻细胞中存在 h c 0 3 - 转运系统提供有力证据。在水环境中，各种形式的c i 经脱水、水合和解离等 反应达到化学平衡。向反应系统中加入一定量的h c 0 3 。，达到平衡后，系统中的c 0 2 浓度可通过计算和实验测定得t 丑( b a d g e r e t a l 1 9 9 4 ) 。当c 0 2 转运系统的抑制剂( 如： h 2 s 、n a 2 s 和c o s ) 存在时，蓝藻细胞悬液中的c 0 2 浓度高出该平衡值数倍。e s p i e 等( 1 9 9 1 ) 将其解释为：h c 0 3 经主动运输进入蓝藻细胞，尔后在胞内脱水为c 0 2 而向外泄漏。由于泄漏出的c 0 2 转变为h c 0 3 1 丑对较慢，因而c 0 2 在反应液中累积， 从而引起反应液中c 0 2 浓度远高于平衡值。正常情况下，从胞内泄漏出的c 0 2 经高 效c 0 2 运输系统转运回细胞。对c 0 2 转运能力稍低的蓝藻来说，即使无c 0 2 转运 抑制剂存在，d i c 的快速吸收和积累也会引起胞外c 0 2 浓度明显升高( b a d g e ra n d a n d r e w s1 9 8 2 ) 。 ( 5 ) 荧光淬灭：荧光淬灭的初始速率与h c 0 3 转运的初始速率紧密相关，这 可能是由于h c 0 3 转运的初始速率影响胞内c i 库形成的初始速率，因而可采用这项 技术分析蓝藻细胞中的h c 0 3 转运( e s p i e e ta 1 1 9 9 1 ) 。 ( 6 ) 通过突变株进行研究：缺失c 0 2 转运系统的突变株，在碱性条件下如果 能够像野生型一样正常生长，则可以证明h c 0 3 - 转运系统的存在( s h i b a t ae ta 1 2 0 0 2 ) 。 7 硕士擘住论文 m a s t e r st h e s i s 2 3 测定蓝藻细胞转运c 0 2 的方法 证明蓝藻细胞利用c 0 2 作为碳源的方法有下列四种； ( 1 ) 硅氧烷液体离心技术：向细胞悬浮液中加入经1 4 c 标记的酸化c i 溶液， 1 0 s 后通过离心，细胞经硅氧烷液体层进入碱性淬灭溶液，从而迅速终止c i 吸收。 在这1 0 s 之内，细胞悬浮液中的c i 大多以c 0 2 形式存在。到第一次取样时，胞内 c i 浓度可达到最大值的9 0 0 。当加入h 1 4 c 0 3 或加入1 4 c 0 2 和c a 时，最终胞内c i 浓度与单独加入h c 0 2 的虽然比较接近，但细胞内c i 的积累速率大幅度降低。这一 实验结果表明，光照条件下蓝藻细胞可转运c 0 2 。硅氧烷液体离心技术适于鉴别c 0 2 转运系统的存在与否，但由于其时间分辨率较低，所以分析c 0 2 转运的初始速率较 为困难。 ( 2 ) 检测照光条件下胞外二氧化碳浓度的变化：当细胞浓度很高时，单位体 积的细胞悬浮液吸收c 0 2 的速率远高于反应液中h c 0 3 脱水产生c 0 2 的速率。质谱 分析表明，光照后的蓝藻细胞迅速大量吸入c 0 2 ，使得反应液中c 0 2 浓度几乎降至 零。同时测定光合放氧速率，结果表明胞外c 0 2 浓度的急剧下降不能用c 0 2 固定引 起的消耗来解释，而应该是由c 0 2 运输系统运转所引起。向反应液中加入c a 会阻 止这种胞外c 0 2 浓度的急剧下降，这表明c 0 2 浓度下降主要是由于c 0 2 吸收而不 是总c i 吸收引起( e s p i ee ta 1 1 9 8 8 ，m i l l e re ta 1 1 9 9 0 ) 。h c 0 3 脱水产生c 0 2 的速率 常随反应液中c 0 2 浓度的变化而改变，因此对实验结果进行动力学分析较为困难。 h c 0 3 主动运输对m m o l l 1 水平n a + 具有依赖性，所以加入c a 后也可采用质谱技 术研究c 0 2 转运的动力学。 ( 3 ) 荧光淬灭：叶绿素荧光淬灭的初始速率与c 0 2 转运的初始速率相关，故 可利用该方法分析蓝藻细胞对c 0 2 的吸收情况。 ( 4 ) 通过突变株进行研究：筛选h c 0 3 缺失突变株对c 0 2 转运进行研究，使 编码n c 0 3 。转运子的基因突变或者结合部分c 0 2 转运突变株来研究c 0 2 转运。 3 环境因子和蓝藻二氧化碳浓缩机制的相互影响 蓝藻在地球上大约生存了3 5 亿年( s c h o p f 2 0 0 0 ) ，在漫长的自然进化过程中， 大气中的c 0 2 浓度下降0 2 浓度上升，为了适应水环境中c 0 2 的供给情况，逐渐进 化出了一个非常有效地捕捉c i ( c i ：c 0 2 和h c 0 3 。) 的机制进行光合作用，即c c m ( b a d g e ra n dp r i c e 2 0 0 3 ，o i o r d a n oe ta 1 2 0 0 5 。b a d g e re ta 1 2 0 0 6 ) 。由此可见c c m 的 出现是为了适应不断变化的生活环境，是自然选择的结果。c c m 的作用概括起来 有三点：( 1 ) 当外界d i c 和，或c 0 2 的浓度降低时，改善胞外c 0 2 的供给同时提供 8 生存竞争优势；( 2 ) 当外界环境中的营养物质如n 、p 、f e 和s 等缺少对改善原料 的利用效率；( 3 ) 耗散过剩能量的方式之一( q i ua n dl i u2 0 0 4 ) 。所以，环境因子 如营养物质、能量供应和c 0 2 浓度反过来在调节c c m 的活性方面起着重要作用 ( b e a r d a l la n dg i o r d a n o2 0 0 2 ) 。 3 1 环境因子对c c m 的调节作用 当生长在高c i 浓度下( e g 2 - 5 ) ，蓝藻表现出一种低亲和力的c c m ：即对 c i 的表观k 忱增高同时积累胞内c i 的能力降低。当转移至碳限制的低碳条件下( e g t 2 0 3 5 0 p p mc 0 2 ) ，则高亲和力的无机碳转运系统( b c t l ，s b t a 和n d h - 1 3 ) 被诱导， 同时伴随着浓缩c i 能力升高和羧体数目的增加( o h k a w a a t a l 2 0 0 0 a , b s h i b a t a e t a l 2 0 0 1 。2 0 0 2 a , b ，m a e d aa ta 1 2 0 0 2 ，p r i c ea ta 1 2 0 0 2 ) 。从高碳转移到低碳浓度下的时间 段实验表明：高亲和力的c c m 的在4 - 6 h 内完全被诱导( y ue t a l 1 9 9 4 ，b e n s e h o p a t a 1 2 0 0 3 ) 。 蓝藻的c c m 是一个主动的耗能过程，能量直接来源于电子传递链或者