（植物学专业论文）滇黄芩的结构及其有效成分含量变化动态研究.pdf

摘要 滇黄芩( s c u t e l l a r i aa m o e n ac h w r i g h t ) 为唇形科( l a b i a t a e ) 黄芩属( s c u t e t l a r i al i n n ) 多年生草本植物，以根入药，是西南地区药用黄芩的主流品种。近年来，对中华人民 共和国药典历版收载的同属植物黄芩( b a i c a l e n s i sg e o r g i ) 的形态结构、有效成分 及药理作用等方面的研究已充分报道，然而对滇黄芩的相关研究报道较少，仅涉及本草 考证、生药研究、组织培养等方面。本论文运用结构植物学、组织化学和植物化学等方 法，揭示了滇黄芩营养器官的解剖结构及发生发育规律，黄酮类物质在营养器官中的组 织化学定位，不同生长时期、不同器官黄芩苷和总黄酮积累动态变化，并与黄芩进行了 比较，以期了解的滇黄芩的结构发育过程，以及黄酮类化合物的积累规律，为滇黄芩的 进一步研究开发提供理论基础和科学指导。 1 滇黄芩各营养器官的解剖结构以及发生发育与一般双子叶草本植物相似。其根的 发育可分成原分生组织、初生分生组织、初生结构和次生生长4 个阶段。初生木质部为 二原型，凯氏带明显，初生结构中开始积累淀粉粒；次生生长主要是由维管形成层和木 栓形成层的活动完成，木栓形成层起源于中柱鞘细胞；茎的次生结构和叶维管束外有厚 壁细胞群分布，1 较成熟的茎中厚壁细胞群连成一环。 2 组织化学研究结果显示：滇黄芩根从初生生长时期开始积累黄酮类物质，多年生 根的中柱鞘及韧皮部、茎及叶的表皮及皮层中的薄壁细胞是黄酮类物质的主要积累场所， 且在根中积累部位的组化反应的显色程度较茎叶中的深。 3 对各个生长时期滇黄芩营养器官的总黄酮和黄芩苷的含量测定结果表明：各个时 期总黄酮和黄芩苷在滇黄芩中的含量均为地下部分( 根) 高于地上部分( 茎叶) ，与组织 化学研究结果相一致，说明根是黄酮类物质积累的主要部位； 4 在不同生长时期滇黄芩的相同器官中，黄芩苷及总黄酮的含量变化规律相似。在 根中，黄芩苷及总黄酮的含量均在营养生长期和枯萎期存在两个明显高峰，且在营养生 长期为全年最高；在茎叶中，黄芩苷和总黄酮的含量则均在盛花期达到高峰。 5 有效成分变化动态分析结果显示，滇黄芩地上及地下部分的黄酮类物质的含量变 化呈现出此消彼涨的变化规律。在根中营养生长期和枯萎期呈现两个高峰期，在盛花期 最低：而在茎叶中则为盛花期最高，营养生长期和枯萎期较低。根据这一规律，可以考 虑采用春季采收根，秋季采收茎、叶的采收方式，以更充分地利用滇黄芩植物资源。 6 结合解剖学，组织化学和植物化学研究结果显示，从根的初生生长到次生生长阶 段，薄壁细胞数量不断增多，有效成分积累也逐渐增加，薄壁细胞的多少与有效成分的 积累呈一定程度的正相关，进一步表明植物的组织结构特征与次生代谢产物的分布和积 累具有一定的相关性。 7 滇黄芩与同属近缘种黄芩在解剖结构、组织化学及植物化学方面均有差异。结构 上的差异主要表现在：滇黄芩较成熟的地上部分营养器官中出现细胞壁明显加厚的厚壁 组织，而黄芩中则没有或不明显；组织化学和植物化学的研究结果均显示药用黄芩主要 有效成分在滇黄芩中的含量高于黄芩。据此应加大对地方品种滇黄芩的综合开发利用。 关键词 滇黄芩；营养器官；根；解剖学；组织化学；植物化学；总黄酮；黄芩苷； a b s t r a c t s c u t e l l a r i aa m o e n ac h w r i g h t ( l a b i a t a es c u t e l l a r i al i n n ) i sap e r e n n i a lh e r b a c e o u s p l a n t i t sr o o tn a m e l yc h i n e s e t r a d i t i o n a lm e d i c i n e d i a nh u a n g q i n ，i sm a i n l yu s e di n s o u t h w e s to fc h i n a w i t hr e g a r dt or e s e a r c ho nm o r p h o l o g i c a ls t r u c t u r e ，a c t i v ei n g r e d i e n t s a n dp h a r m a c o l o g i c a le f f e c t so fs c u t e l l a r i a b a i c a l e n s i sg e o r g i ，w h i c hi st h er e l a t e dp l a n t sw i t h a i n c l u d e di nt h ep h a r m a c o p o e i ao fp e o p l e sr e p u b l i co fc h i n a , h a sb e e nd e s c r i b e di n m a n yr e p o r t sb yp r e d e c e s s o r si nr e c e n ty e a r s h o w e v e r , l i t t l er e s e a r c hw h i c ho n l yi n c l u d e t e x t u a lr e s e a r c ho f h e r b a l i s m ，p h a r m a c o g n o s ys t u d i e s ，t i s s u ec u l t u r e ，e t c ，h a sb e e nd o n eo n & a i nt h i ss t u d y ，w es y s t e m a t i c a l l yi n v e s t i g a t e dt h ed e v e l o p m e n ta n ds t r u c t u r eo fn u t r i t i v e o r g a n s ，d i s t r i b u t i o na n dt h ed y n a m i cc h a n g e so fc o n t e n to ff l a v o n o i d sf r o md i f f e r e n to r g a n s ， d i f f e r e n tg r o w i n gs t a g e s ，b yu s i n ga n a t o m y , h i s t o c h e m i s t r ya n dp h y t o c h e m i s t r ym e t h o d s ，a n d t h e nc o m p a r e ds aw i t hs b ，w i t hav i e wt or e v e a lt h es t r u c t u r ea n dd e v e l o p m e n tp r o c e s so fs a ，a sw e l la st h ea c c u m u l a t i o no ff l a v o n o i d s ，p r o v i d i n gat h e o r e t i c a lf o u n d a t i o na n ds c i e n t i f i c g u i d a n c ef o rt h ef u r t h e rr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to n & a 1 t h ea n a t o m i c a la n dd e v e l o p m e n to fn u t r i t i v eo r g a n so fs aa r et h es a m ea so t h e r d i c o t y l e d o n s t h ed e v e l o p m e n to fr o o tc o u l db ed i v i d e di n t of o u rs t a g e s ，p r o m e r i s t e m ， p r i m a r ym e r i s t e m ，p r i m a r ys t r u c t u r ea n ds e c o n d a r yg r o w t hs t a g e s t h ep r i m a r yx y l e m i s d i a r c h t h ec a s p a r i a ns t r i pa n ds t a r c hg r a i nc a l lb ec l e a r l yo b s e r v e di nt h ep r i m a r ys t r u c t u r e t h es e c o n d a r yg r o w t h m a i n l yd e p e n d so nt h ea c t i v i t i e so fv a s c u l a rc a m b i u ma n dc o r k c a m b i u m t h ec o r kc a m b i u mo r i g i n a t e sf r o mp e r i c y c l ec e l l s t h et h i c k w a l l e dc e l l sa r e d i s t r i b u t e do u t s i d et h es e c o n d a r yv a s c u l a rb u n d l e si ns t e m sa n dl e a v e s ，a n da r ed i s t r i b u t e d t o g e t h e ri n t oo n er i n gi nt h em o r em a t u r es t e mt i s s u e 2 t h ep r e s e n th i s t o c h e m i c a lr e s u l t si n d i c a t et h a tf l a v o n o i d si sa c c u m u l a t e di nt h er o o to f & af r o mt h ep r i m a r yg r o w t hs t a g e t h ep e r i c y c l ea n dp h l o e mi np e r e n n i a lr o o t ，a n dt h e p a r e n c h y m ac e l l so fe p i d e r m a la n dc o r t i c a li nt h es t e ma n dl e a f , a r et h ep l a c e sw h e r e f l a v o n o i d si sm a i n l ya c c u m u l a t e d a n dt h eh i s t o c h e m i s t r yr e s u l t sd e m o n s t r a tt h a tt h ec o l o ro f r e l e v a n tt i s s u e si nr o o t si sd e e p e rt h a ni ns t e m sa n dl e a v e s 3 t h er e s u l to ft e s t i n gc o n t e n to fb a i c a l i na n df l a v o n ei nv e g e t a t i v eo r g a n so fs ai n e a c hg r o w t hp e r i o ds h o w st h a tt h ec o n t e n to fb a i c a l i na n df l a v o n ei nt h eu n d e r g r o u n do r g a n s ( r o o t s ) a r eh i g h e rt h a nt h ea b o v e g r o t m do r g a n s ( s t e m sa n dl e a v e s ) i ne a c hp e r i o d i ts q u a r e w i t ht h eh i s t o c h e m i c a lr e s u l t sa n di n d i c a t et h a tr o o ti sm a i nf l a v o n o i d ss t o r i n gp o s i t i o n 4 i nt h es a m e o r g a n so f s a ，t h ed y n a m i cc h a n g e so f c o n t e n to f b a i c a l i na n df l a v o n ea r e s i m i l a ri nd i f f e r e n tg r o w t hp e r i o d s o b v i o u s l yt h ev e g e t a t i v eg r o w t hp h a s ea n dt h ew i l t i n g s t a g ea r et h et w op e a kp e r i o d sf o ra c c u m u l a t i o no fb a i c a l i na n df l a v o n ei nr o o t s ，a n dt h e v e g e t a t i v eg r o w t hp h a s ei st h eh i g h e s t h o w e v e r , t h ef l o r e s c e n c ep h a s ei st h ep e a kp e r i o df o r a c c u m u l a t i o no fb a i c a l i na n df l a v o n ei ns t e m sa n dl e a v e s 5 t h er e s u l ts h o w st h a tt h ea c c u m u l a t i o nr e g u l a r i t yo ff l a v o n o i d si nt h eu n d e r g r o u n d o r g a n s ( r o o t s ) a n dt h ea b o v e g r o u n do r g a n s ( s t e m sa n dl e a v e s ) p r e s e n ta so n e f a l l sa n o t h e r r i s e s t h ev e g e t a t i v eg r o w t hs t a g ea n dt h ew i l t i n gs t a g ea r et h et w op e a kp e r i o d sf o r a c c u m u l a t i o no ff l a v o n o i d si nr o o t sa n dl o w e s ti nf l o r e s c e n c es t a g e h o w e v e r , t h e a c c u m u l a t i o no ff l a v o n o i d si ns t e m sa n dl e a v e si sh i g h e s ti nt h ef l o r e s c e n c es t a g ea n dl o w e s t i nt h ev e g e t a t i v eg r o w t hs t a g ea n dt h ew i l t i n gs t a g e a c c o r d i n gt ot h i sa c c u m u l a t i o nr e g u l a r i t y , g r o w e r sc a nh a r v e s tr o o t si ns p r i n g ，s t e m sa n dl e a v e si na u t u m n ，f o rb e t t e ru s eo ft h ep l a n t r e s o u r c e so f & a 6 a n a t o m y , h i s t o c h e r n i c a la n dp h y t o c h e m i s t r yr e s u l t si n d i c a t et h a tb o t ht h ea m o u n to f p a r e n c h y m ac e l l sa n dt h ec o n t e n to ff l a v o n o i d si nr o o t sa r ei n c r e a s e df r o mt h ep r i m a r y g r o w t hs t a g et ot h es e c o n d a r yg r o w t hs t a g e s ot h ec o n t e n to ff l a v o n o i d si nn u t r i t i v eo r g a n s h a sc l o s er e l a t i o n sw i t ht h ea m o u n to fp a r e n c h y m ac e l l s s t r u c t u r eo fp l a n ti sc l o s e l yr e l a t e d t od i s t r i b u t i o na n da c c u m u l a t i o no ft h e i rs e c o n d a r ym e t a b o l i t e s 7 t h ed i f f e r e n tr e s u l t so fa n a t o m i c a ls t r u c t u r e ，h i s t o c h e m i s t r ya n dp h y t o c h e m i s t r y b e t w e e ns a m o e n aa n ds b a i c a l e n s i sa r ea l s od i s c u s s e di nt h i s p a p e r t h eo b v i o u s t h i c k - w a l l e dc e l l sa r ed i s t r i b u t e di nt h em o r em a t u r es t e ma n dl e a f t i s s u eo fs a ，b u ta r en o t f o u n do rn o to b v i o u si ns b a n dt h ed i f f e r e n th i s t o c h e m i c a la n dp h y t o c h e m i s t r yr e s u l t s b e t w e e nt h e s et w oi n d i c a t et h a tt h ec o n t e n to ff l a v o n o i d si ns ai sh i g h e rt h a nt h a ti ns b t h e r e f o r ei ti sn e c e s s a r yt os t r e n g t h e nt h ec o m p r e h e n s i v ed e v e l o p m e n ta n du t i l i z a t i o no nt h e e n d e m i c ss p e c i e s 口) k e yw o r d s s c u t e l l a r i aa m o e n a c h w r i g h t ，n u t r i t i v eo r g a n s ，r o o t s ，a n a t o m y , h i s t o c h e m i s t r y , p h y t o c h e m i s t r y , f l a v o n e ，b a i c a l i n v 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它 相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：弛圣摹鹤 指导教师签名：氇羔哟 2 。刃年z 月占e l 力叩尸 年 月，么e l 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其 它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：孑b 祥裼 2 7 年工月，舌日 西北大学硕上学位论文 第一节课题研究背景及意义 第一章绪论 目前，国际上崇尚自然、回归自然、选择自然己成为不可逆转的潮流，用天然药物 替代化学药品已成为今后国际医药发展的趋势。中草药的特色和优势顺应了世界医药的 发展趋势，在预防疾病、治疗和保健方面被越来越被人们所认同，受到世界人民的青睐。 每种药用植物能防病治病主要是该植物的药用部分中含有相应的药用化学成分，药 用植物的结构与其有效成分的积累具有一定的相关性。将药用植物的结构及其生长发育 的研究结合该植物主要药用成分积累动态的测定，可以进一步了解药用植物的结构与主 要药用成分的关系，阐明其分布部位和贮存场所，可以了解药用植物生长发育不同时期， 主要药用成分含量的变化规律【l 】。 药用黄芩是我国重要的大宗中药材之一，其主要活性成分有黄芩苷、黄芩素、汉黄 芩苷、汉黄芩素等黄酮类化合物，具有清热解毒、止血安胎、抗炎、降压、抗氧化、调 节免疫等多方面的作用。目前国内外对黄芩属药用植物的研究均以中华人民共和国药 典所列黄芩( & b a i c a l e n s i sg e o r g i ) 为核心，对其形态结构、有效成分及药理作用等 方面的研究成果已有充分报道。特别是近两三年来，国际上对药用黄芩的研究持续升温， 发表论文近百篇，以抗肿瘤、抑制人类免疫缺陷病毒( h i v - 1 ) 和t 细胞白血病病毒 ( h t l v - 1 ) 以及治疗心血管疾病等为热点。随着药用黄芩用量加大，资源破坏严重，野 生产量锐减，栽培技术也不完善，难以满足社会需求。因此，深入对地道药材的研究与 开发以扩大药材种质资源迫在眉睫。 本课题为陕西省教育厅自然科学基金资助项目【0 7j k4 0 2 ，以黄芩近缘种滇黄芩为 研究材料，通过研究滇黄芩营养器官的显微结构特征，有效成分的组织定位，不同部位 和不同发育期与有效成分积累的关系，并与黄芩的显微结构特征和有效成分相比较，不 仅对于探讨植物结构与其次生代谢产物积累的关系方面具有理论意义，而且对扩大黄芩 的药源具有现实意义，同时为滇黄芩种质资源的保护和筛选提供检测指标，为将野生滇 黄芩变为家种、g a p 栽培管理及提高其产量、质量等生产实践问题提供科学指导。 第一章绪论 第二节国内外相关研究进展 滇黄芩( s c u t e l l a r i aa m o e n ac h 晰曲t ) 为唇形科( l a b i a t a e ) 黄芩属( s c u t e l l a r i al i n n ) 多年生草本植物，以根入药，属国家三级重点保护野生药材，是西南地区药用黄芩的主 流品种，现收载于云南省药品标准。主要用于治疗各种炎症、以及胃痉挛和解除乌 头中毒引起的多种中枢神经症状，药用历史悠久。通过文献收集、整理，现对滇黄芩的 研究进展综述如下。 1 本草考证 滇黄芩( s c u t e l l a r i aa m o e n ac h w r i g h 0p a 黄芩之名始载于滇南本草，日：“味苦， 性寒，上行泻肺火，下降泻膀胱火。男子五淋，女子暴崩，调经安胎，清热。胎中有火 热不安，清胎热，除六经实火、实热。所谓实火可泻，黄芩是也。热症多用之 。 植物名实图考称：“黄芩生秭归山，滇南亦有 。云南中草药选记载了滇黄 芩：“生于向阳坡草地、石隙或杂草丛中。花期六至九月，果稍后成熟”，“滇黄芩为多 年生草本，茎锐四棱形，直立。主根粗壮圆锥形。花萼唇形，花冠二唇形，小坚果4 ，近 圆形”【2 1 。 滇黄芩的其它别名还有西南黄芩( 中药材品种论述) ，条芩、子芩、枯芩( 四川、 云南) ，土黄芩( 贵州) ，魁芩( 四川) ，雅致黄芩、美黄芩( 云南红河) ，小黄芩( 云南曲 靖) ，傈僳族药名音译：“喜勒怒几( 怒江中草药) 等。虽然滇黄芩有如此多的别名，但 均可以确定为唇形科黄芩属植物滇黄芩。【2 】 历代本草记载使用的药用黄芩经考证至少有3 种植物来源，其主流应是黄芩 ( s c u t e l l a r i ab a i c a l e n s i sg e o r g i ) ，其次是主产云南的滇黄芩和主产甘肃泾州的甘肃黄芩。 ( 云南省药物研究所，2 0 0 5 ) 2 分类与资源 黄芩属植物约3 0 0 多种，世界广布。我国有黄芩属植物1 0 2 种，5 0 变种。其中黄芩 亚属( 一s u b s c u t e l l a r i a ) 有9 9 种，分为5 组：异花黄芩组、顶序黄芩组、腋序黄芩组、 盔状黄芩组和膜苞黄芩组。滇黄芩属于黄芩亚属的顶序黄芩组、狭叶黄芩亚组。【3 】 滇黄芩主要分布于我国西南地区的云南中南部、中部、西北部、四川南部及贵州西 北部。以云南资源最多，主要分布于丽江、大理、楚雄、新平等地。多生长在海拔1 7 0 0 - , - , 2 5 0 0f f l 左右的云南松林下或灌木丛草地及疏林中【2 1 。滇黄芩资源十分丰富，8 0 年代普 2 两北人学硕士学位论文 查云南省内藏量达上百万千克【4 1 。目前仍以野生资源为主，还未形成规模化种植。 3 原植物与药材 据中国植物志【3 1 描述：滇黄芩为多年生草本。根茎近垂直或斜行，粗壮，圆锥 形，径可达1c m 以上；茎直立，高1 5 - - - 3 0 c m ，茎丛生，多分枝，四棱形，常带紫色， 沿棱上被倒向或近开展的微柔毛。叶长圆形或长圆状卵形，长1 4 - - - 3 3t i l l ，宽0 7 1 4c m ，常对折，边缘有不明显的圆齿至全缘，上面疏被微柔毛至几无毛，下面常沿中 脉及侧脉有柔毛至几无毛，侧脉3 - - 4 对，叶柄长1 2i n t o ，腹凹背凸，被微柔毛。花对 生，排成顶生长5 1 4a m 的总状花序，长偏向一侧；苞片叶状，花萼常带紫色，长约3 l l l m ，被腺毛及柔毛，背部有盾状附属物，果时增大为5l l l m ：花冠紫色或蓝紫色，长2 4 3 c m ，向上渐宽，至喉部宽达7 m m ，冠檐二唇形；雄蕊4 枚，2 强，花丝扁平，下部被纤 毛，花盘肥厚。小坚果卵球形，棕褐色，具瘤和短柔毛。花期5 - - 9 月，果期7 - 1 0 月。 ( 图版i ，1 ，2 ) 滇黄芩的干燥根呈圆柱形或倒圆锥形，长l o - - - 3 0 c m ，直径1 3 c m 。根头部粗大， 表面黄棕色，有扭曲皱纹，并见疣状支根痕，老根中心呈枯朽状。质坚脆；断面不平坦， 污黄色或黄绿色。气微，味苦。【5 j 滇黄芩药材横切面显示，木栓层为6 - - - - 9 列扁平细胞组成，无石细胞分布；韧皮部 约占根直径的1 4 ，有石细胞和纤维散在；形成层束间不明显。木质部木质束8 - - - 1 3 个， 导管群排列成不规则形，导管群数目多。木射线由8 1 8 列薄壁细胞组成，略有弯曲。 中央无木栓环。【6 】 4 组织培养 由于黄芩类植物种子成熟不一致，果实成熟一粒掉一粒，种子不便收集，并且种子直 播后出苗不齐，人工驯化种植的种苗问题难于解决。云南省滇黄芩野生家种进行了一些 试验，取得了一定的成绩，但因种子采收量小，靠种子直播，面积扩大很难，未能形成规模 化种植，只是在省内某些制药企业的药材资源圃中有零星种植。【7 1 利用生物技术，研究滇黄芩组织培养技术，繁殖试管苗或生产人工种子，可解决这一 难题。赵振玲等【7 1 对滇黄芩的愈伤组织、胚状体、芽、根、试管小植株等进行了诱导培 养，获得了用于大田种植的再生种苗及用于生产人工种子的各类包埋材料。 5 化学成分与药理学研究 滇黄芩主要含：黄芩素( b a i c a l e i n ) ，汉黄芩素( w o g o n i n ) ，黄芩苷( b a i c a l i n ) ，汉黄芩 第一章绪论 苷( w o g o n o s i d e ) 及3 1 种黄酮类化合物【引。 药理研究证明黄酮类化合物是黄芩属药用植物的主要有效成分，其中含量较高并具 有明显药理作用的是黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素。四种成分均有抗氧化清除 自由基的作用【9 1 1 】。黄芩素是其中已知主要成分中最强的自由基清除剂【9 1 。 黄芩苷与黄芩素对人免疫缺陷病毒( h i v ) 逆转录酶的活性和成人白血病病毒( m l v ) 逆转录酶有抑制作用倍受人们关注。赵晶【1 3 】的研究发现，黄芩素抑制h i v r t 活性较黄 芩苷强。 黄芩素、黄芩苷和汉黄芩苷有强烈的抗炎活性，其中黄芩素和黄芩苷的作用较强【1 4 1 ： 黄芩苷对临床眼科常见的多种细菌均有不同程度的抑菌作用【”】。此外，研究表明黄芩苷 具有一定的免疫调节功能【1 缸1 引。 6 滇黄芩与黄芩的比较 滇黄芩与黄芩( s b a i c a l e n s i s ) 同为黄芩属、黄芩亚属、顶序黄芩组、狭叶黄芩亚 组药用植物。滇黄芩主要在我国西南地区药用，黄芩则作为正品在我国大部地区药用。 从外部形态来区分滇黄芩及其近缘种黄芩( 图版i ，2 ，3 ) ，主要从株高、叶形及腺点有 无几个方面进行，见表1 。 表1 滇黄芩与黄芩形态特征的主要区别 t a b 1t h er a i nd i f f e r e n c e si nm o r p h o l o g y b e t w e e ns a m o e n aa n ds b n i c 伍l e n s 主s 滇黄芩与黄芩的化学成分也存在差异。郭朝民等【1 9 】采用薄层色谱分析和紫外光谱分 析法对滇黄芩和黄芩进行了分析，其结果见图1 、2 。由图1 、2 可明显看出二者的不同。 4 西北大学硕上学位论文 】材 2 填冀苓 u i j 、，八、一、。、 蜘掰钓狮 、鲥 田2i t 井瑕被毙港圈 f i g 1t l ca n a l y s i so fs aa n ds bf i g 2u va b s o r p t i o ns p e c t r ao fs 口a n ds b 据云南省药物研究所2 0 0 5 年发布：滇黄芩与正品黄芩的主要化学成分基本一致。 但在一些黄酮类成分上有差异，仅从正品黄芩中分离到的黄酮类化合物有：( 2 s ) 7 ，27 ，6 三羟基5 甲氧二氢黄酮，5 羟基7 ，8 二甲氧基黄酮，5 ，8 二羟基6 ，7 二甲氧基黄酮， 5 ，27 二羟基6 ，7 ，8 三甲氧基黄酮，5 ，7 ，2 三羟基黄酮，5 ，7 ，47 三羟基8 甲氧基黄酮， 5 ，7 ，27 三羟基8 甲氧基黄酮，5 , 7 ，27 三羟基8 ，6 二甲氧基黄酮，5 ，2 ，57 - 三羟基 6 ，7 ，8 三甲氧基黄酮，5 ，27 ，67 三羟基7 ，8 二甲氧基黄酮，5 ，7 ，2 ，3 四羟基黄酮，5 ，7 ，2 ，5 四羟基8 ，67 二甲氧基黄酮，2 ，6 ，27 ，47 四羟基67 甲氧基查耳酮等。 仅从滇黄芩中发现，而在正品黄芩中尚未分离到的黄酮类化合物有：( 2 k 3 r ) 3 ，5 ，7 三羟基二氢黄酮，( 2 s ) 5 ，7 ，8 三羟基二氢黄酮，( 2 s ) 5 ，27 ，6 三羟基7 甲氧基二氢黄酮 ( 滇黄芩新素) ，( 2 r ，3 r ) 3 ，5 ，7 ，27 四羟基二氢黄酮，白杨素，5 ，7 二羟基黄酮，5 ，27 - 二 羟基6 ，7 ，8 ，67 四甲氧基黄酮( 黄芩新素i i ) ，5 ，7 ，8 三羟基黄酮( 去甲汉黄芩素) ，( 2 s ) 5 ，2 7 。6 三羟基7 甲氧基双氢黄酮2 o 1 3 d 葡萄糖吡喃苷。 刘美兰等( 2 0 】用r p h p l c 法测定几种药用黄芩中黄芩苷( 5 ，6 二羟基7 葡萄糖醛酸 黄酮) 和汉黄芩苷( 5 羟基8 甲氧基7 葡萄糖醛酸黄酮) 的含量，测定结果显示：滇黄 芩中黄芩苷含量最高，为1 7 9 0 ，高于黄芩的1 3 1 6 ；汉黄芩苷含量则黄芩为3 3 0 ， 高于滇黄芩的1 0 6 。符洪等【2 l 】亦用r p h p l c 法对不同产区的黄芩属植物的成分进行 了测定，结果显示黄芩素含量滇黄芩高于黄芩，而汉黄芩素含量则黄芩较高。 5 第一章绪论 第三节问题的提出及研究思路 滇黄芩是西南地区药用黄芩的主流品种，文献报道表明，目前对滇黄芩缺乏全面系 统的研究，仅在本草考证、化学成分的分离鉴定、组织培养等方面有少量研究。然而， 对滇黄芩的生物学研究如滇黄芩的结构、主要有效成分的含量、结构与成分积累的相关 性及有效成分含量的动态变化规律等领域的研究尚属空白；对滇黄芩与同属近缘种黄芩 在结构、有效成分积累方面有何区别也尚无相关报道。 为此，本课题采用结构植物学、组织化学和植物化学等方法系统研究滇黄芩的主要 药用成分黄酮类物质在营养器官中产生和贮存的组织、细胞的结构，不同生长期各药用 部位发育过程中有效成分含量的变化动态，以及比较研究与同属不同种植物的结构及有 效成分含量变化之间的差异。重点研究以下几个方面： ( 1 ) 滇黄芩营养器官的解剖结构及发育规律； ( 2 ) 主要药用成分黄酮类物质( 黄芩苷及总黄酮) 在滇黄芩各器官中的组织化学定位 及含量； ( 3 ) 滇黄芩植物结构与成分积累的相互关系； ( 4 ) 滇黄芩植物体不同部位、不同生长期黄芩苷和总黄酮含量的动态变化； ( 5 ) 将滇黄芩与黄芩的解剖结构、有效成分的组织化学及植物化学研究结果进行比较。 通过对以上存在问题的研究，搞清滇黄芩植物结构特征，有效成分在植物体内的分 布、含量及其随植物生长发育的动态变化规律，搞清滇黄芩与黄芩在植物结构、有效成 分含量及其动态变化规律之间的异同，为开发新药植物资源、扩大药用黄芩原植物资源 提供科学依据。 6 两北大学硕士学位论文 第一节研究材料 第二章研究材料与方法 实验材料于2 0 0 7 年至2 0 0 8 年采自云南省农业科学院植物园，为四年生滇黄芩。植 物解剖的实验材料幼苗以5 0 酒精配制的f a a 固定，成熟材料以7 0 酒精配制的f a a 固定。 第二节研究方法 1 植物解剖学方法 1 1 石蜡切片法 黄芩幼苗的各部分用5 0 酒精配制的f a a 固定，成年植株用7 0 酒精配制的f a a 固 定。常规石蜡切片，切片厚度8 1 2 岬，铁矾苏木精或番红固绿染色，加拿大树胶封片( 李 正理，1 9 7 8 ) 。l e i c a d m l b 显微镜观察并照相。 t 2 荧光显微镜法 用荧光显微镜观察滇黄芩不同器官不同部位的石蜡切片，以判断其组织内是否有细 胞壁木质化加厚的细胞及加厚程度，并观察淀粉粒的积累。 2 植物组织化学方法 2 1 氢氧化钠溶液显色 取滇黄芩不同器官新鲜材料做徒手切片，滴加5 n a o h 水溶液，临时装片，立即于 显微镜下观察各组织显色反应并照相。 2 2 三氯化铁溶液显色 取滇黄芩不同器官新鲜材料做徒手切片，滴力n 5 f e c l 3 水溶液，临时装片，立即于 显微镜下观察各组织显色反应并照相。 2 。3 盐酸一镁粉溶液显色 取滇黄芩不同器官新鲜材料做徒手切片，滴加盐酸镁粉溶液，临时装片，立即于 显微镜下观察各组织显色反应并照相。 7 第二章研究材料! j 方法 2 4 对照实验 依据黄酮类物质易溶于醇溶剂设置同步阴性对照实验，即将新鲜的根、茎、叶材料 置于无水乙醇中2 4 h 后取出，滴加5 n a o h 溶液，显微镜观察并照相。以滇黄芩及黄 芩黄酮类物质的主要成分黄芩苷标准品作阳性对照。 3 植物化学方法 3 1 高效液相色谱法 3 1 1 仪器、试剂和色谱条件 3 1 1 1 仪器 w a t e r s 2 6 9 5 2 9 9 6 型高效液相色谱仪( 美国w a t e r s 公司) ，色谱柱( s y m m e t r y c l 8 ， 5 岬，2 5 0m m x 4 6m m ) ；d h g - 9 1 2 3 a 型电热恒温鼓风干燥箱( i - 海一恒科技有限公 司) ：b r a n s o nb 3 2 0 0 s 超声清洗器( 上海必能信超声有限公司) ：t 2 1 4 电子天平( 北京赛 多利斯仪器系统有限公司) 。 3 1 1 2 试剂 黄芩苷对照品( 中国药品生物制品检定所，供含量测定用，纯度：9 8 ) 。甲醇( 天津科 密欧) 为色谱纯，无水乙醇为分析纯，水为重蒸水。 3 1 1 3 色谱条件 色谱柱：s y m m e t r y c l 8 ，5 岬，2 5 0m m x 4 6a i m ；流动相：甲醇：0 2 磷酸水溶液 ( 4 0 ：6 0 ) ；流速：1 om l - r a i n 1 ；检测波长：2 8 0 n m ：柱温：3 0 * ( 2 。 3 1 2 对照品及样品溶液的配制 3 1 2 1 对照品溶液的制备 精密称取在6 0 c 减压干燥4 t j x 时的黄芩苷标准品6 m g ，置于l o m l 容量瓶中，加甲醇 溶解并稀释至刻度，再取l m l ，加甲醇定容置1 0 m l 容量瓶中，摇匀，使用时稀释成浓度 为o 0 6 0 m g m l 。1 的黄芩苷对照品溶液。 3 1 2 2 样品溶液的制备 分别取滇黄芩的根和茎叶5 5 干燥7 2h ，将干材料捣成细粉，精密称取0 2 5 9 粉末， 置5 0 m l 三角瓶中，反复提取三次，每次加入1 0 m l7 0 乙醇溶液，超声波振荡3 0 r a i n ，过 滤，滤液用7 0 乙醇定容至5 0 m l 容量瓶中，再取l m l 用甲醇溶液定容至1 0 m l 容量瓶中， 过0 4 5 9 m 滤膜，备用。将部分峰面积超出标品线性范围的样品再稀释至线性范围内。 8 西北大学硕? 学位论文 3 1 3 标准曲线的绘制 精密吸取上述对照品溶液( 浓度为0 0 6 m g m l 。1 ) l 、2 、4 、6 、8 、1 0 p l ，在上述色谱条 件下测定峰面积。以进样量x ( 肛g ) 对峰面积y 绘制标准曲线，得回归方程： y 3 e + 0 6 x 1 2 8 2 2 ，r 2 = 0 9 9 9 2 ，如图2 所示。表明黄芩苷含量在0 0 6 烬范围内与峰面积 呈良好的线性关系。 按上述色谱条件测得的色谱图见图l ： 图1 ：黄芩苷的h p l c 色谱图 a 对照品；b 滇黄芩样品：根；c 滇黄芩样品：茎叶；1 黄芩苷 f i g 1h p l cc h r o m a t o g r a m so fb a i c a l i n a r e f e r e n c es u b s t a n c e ；b s a m p l eo fs a m o e n a ：r o o t ； c s a m p l eo f s a m o e n a ：s t e ma n dl e a f ； 1 b a i c a l i n 9 第二章研究材料上j 方法 2 ：0 0 0 0 0 0 1 5 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 - 5 0 0 0 0 0 y - r 鬻6 0 ；：9 乒9 9 2 = 么 10 20 4o 6o 进样量( i ig ) 图2 ：黄芩苷标准曲线 f i g 2t h eg r a p ho fs t a n d a r dc u r v eo fb a i c a l i n y = 0 0 5 9 5 x 一0 0 0 3 1 r 2 = 0 9 9 9 7 。 7 - i瓦1 n1 标品浓度( i ig m 1 ) 图3 ：总黄酮标准曲线 f i g 3t h eg r a p ho fs t a n d a r dc u r v eo f f l a v o n e 5 3 1 4 方法学考察 3 1 4 1 精密度试验 同一样品溶液重复进样5 次，