（分析化学专业论文）新型细胞钙荧光纳米微胶囊传感器的研究.pdf

新型细胞钙荧光纳米微胶囊传感器的研究 刘斌 摘要细胞内的重要生理活性物质有很多，如钙，锌，铜，氧等。它们广泛分布 于人体的细胞和体液之中，对人体的生命活动起着重要的作用。随着人们对胞内 重要生理活性物质的重要作用以及他们与某些疾病发生和发展关系的认识越来越 深入，胞内重要生理活性物质的研究融成为化学，生物学，基础和临床医学等学 科的重要前沿热点研究课题。圈前胞杰重要生理活性物质的研究方法很多。人们 常常根据各种方法的特点，按照所进行实验的具体要求而选择不同的测定方法。 如生物发光蛋自法、有机显色剂法、离子传感器法、微电极法、核磁共振法，荧 光探针法等。其中又以荧光探针法研究居多。传统的荧光探针具有反应迅速、测 定灵敏度高、选择性好、线性范围宽等优点，但在生物医学研究应用中也存在一 些难以克服的缺陷，如有可能产生的细胞毒副作用、与细胞内物质的螯合作用、 与蛋白质的键合、指示剂泄露、光漂白效应等，因而对检测结果存在很大的干扰。 另外，传统豹荧光分子荧光标记方法，只能在生物分子的活性基团上连接少数的 几个荧光分子，分析灵敏度有限。人们经过大量的研究提出了很多的解决方法， 如双波长臻：率法，纳米徽胶囊包被法等，尤其是纳米微胶囊包被法可以有效的解 决上述闯题。在很大程度上克服了传统荧光试剂的缺陷，荧光染料的稳定性显著 提高，避兔了荧光染料与生物活性物质直接接触所带来的副作用，丽且光漂繇现 象也大大减少。为此，本论文利藤我们实验室自行合成的薪型c a 2 + 荧光探针s t d b t 和s t d i n ，采用纳米微胶囊包被法合成了两种细胞钙荧光纳米微胶囊传感器一生 物包埋胶囊聚针( p r o b ee n c a p s u l a t e db yb i o l o g i c a u yl o c a l i z e de m b e d d i n g ，p e b b l e s ) s t d b t 和s t d i a ，并采用透射电镜、荧光光谱法、激光共聚焦显微镜和流式细胞 仪等手段对所制餐纳米胶囊探针的形态及粒径分布、光谱性能、对c a z + 的响应性 能、发光稳定性及细胞标记性能等进行了系统的研究，与未包被的探针染料进行 了对比。结果表明，所剖各纳米胶囊探针粒径, j , ( 3 0 n m ) ，分布均匀，形态规则， 表面圆润，发光性质稳定，对c a 2 + 响应灵敏，且通过与细胞简单共培育即可有效 的进入细腿，其中s t d b t 纳米胶囊撵针主要标记臌核区域，标记后显微镜下至少 可观察臻以上。为胞核肉2 + 的测定研究提供有效的手段。 本研究论文主要包括以下两个部分： 一、概述 论文对纳米微胶囊翘被法合成聚合物型荧光纳米微胶囊传感器一生物包埋 胶囊探针q ) r o b ee n c a p s u l a t e db yb i o l o g i c a l l yl o c a l i z e de m b e d d i n g ，p e b b l e s ) 方法进 展和测定研究进展进行了较为详尽的综述。论述了聚合物荧光纳米微胶囊传感器 ( p e b b l e s ) 的方法原理、制备、细胞导入及其应用，最后阐述了本论文的目的和 研究内容。 二、实验部分： ( 1 ) 细胞钙荧光纳米微胶囊传感器的制备： 采用o p 1 0 环己烷氨水微乳液体系，合成了两种新型的细胞钙荧光纳米微 胶囊传感器( s t d b t ，s t d h a ) 。实验结果表明，合成的钙荧光纳米微胶囊传感器 ( s t d b t ，s t d i n ) 粒径d , ( 3 0 m ) ，分布均匀，形态规则，表面圆润，发光性质稳 定，是一种新型的细胞钙纳米荧光探针。 ( 2 ) 细胞钙荧光纳米微胶囊传感器的光谱性能研究： 实验测定了新型c a 2 + 荧光纳米胶囊探针s ) b t 和s t d h l 及其c a 2 + 配合物的荧光 发射光谱，并与未包埋的c a 2 + 荧光探针及其c a 2 + 配合物的荧光发射光谱进行了比 较。结果表明，当s t d b t 、s t d i n 包埋于硅壳纳米微球内后，荧光纳米微球与c e + 配位后的荧光发射峰分别位于5 8 0 n m 和5 6 5 n m ，相对于未包埋探针c a “配合物荧光 峰分别位移了5 n m 和3 6 n m 。 ( 3 ) 细胞钙荧光纳米微胶囊传感器的发光稳定性研究： 根据s t e m - - v o l m e r 公式，荧光染料s t d b t 、s t d i n 在加入猝灭剂后荧光被 迅速猝灭，而在包埋入氧化硅纳米微胶囊中之后再加入猝灭剂，对它的影响已经 不大。这一结果表明，荧光染料经纳米微胶囊包被后位于氧化硅网状纳米微胶囊 的核腔内，而非附着在颗粒表面，从而使得猝灭剂无法接近荧光染料，故而猝灭 减弱，发光更稳定。 ( 4 ) 细胞钙荧光纳米微胶囊传感器的细胞导入及标记性能研究： 应用新型的钙荧光纳米微胶囊传感器( s t d b t ) 与大鼠心肌细胞共孵育，结合 激光共聚焦显微镜和流式细胞仪，监测细胞荧光强度，考察探针细胞导入及荧光 标记情形。实验发现，钙荧光纳米微胶囊传感器( s t d b t ) 通过培育可以有效的 进入细胞，但主要标记胞核区域。纳米微胶囊传感器与细胞共培育0 5 d , 时后，在 细胞内就可以检测到强度较高的荧光信号。其后，随着培育时间的增加，胞内荧 光强度逐渐增加。 关键词：细胞钙；荧光纳米微胶囊传感器：生物包埋胶囊探针；制备；s t d b t ； s t d i n ；心肌细胞 l i s t u d yo fn e w f l u o r e s c e n tp e b b l en a n o s e n s o r sf o r i n t r a c e l l u l a rc a l c i u m l i ub i n a b s t r a c t c h a n g e si ni n t r a c e l l u l a ri o nc o n c e n t r a t i o n sa c c o m p a n ym a n yp r o c e s s e si n l i v i n gc e l l s ，i n c l u d i n gt r a n s p o r t ，s i g n a l i n g ，a n de n z y m ef u n c t i o n o n eo ft h em o s t w i d e l ys t u d i e di o n ，c a l c i u m ，h a sb e e nf o u n d t ob eu b i q u i t o u si nt h e s ea n do t h e rc e l l u l a r p r o c e s s e s 。s e v e r a lm e t h o d sh a v eb e e nd e v e l o p e df o rs t u d y i n gi n t r a c e l l u l a rc a l c i u m o # c a lf l u o r e s c e n c em e t h o d s 钕a n a l y z i n g i n t r a c e l l u l a ri o n ，c o n c e n t r a t i o n sh a v e b e c o m ew i d e s p r e a db i o l o g i c a lt o o l s + i n j e c t i o no ff l u o r e s c e n ti n d i c a t o rd y e si n t oac e l l c o m b i n e dw i t hd u a l w a v e l e n g t h ( r a t i o m e t r i c ) i m a g i n 岛c o n f o c a lm i c r o s c o p y ，t w o p h o t o n f l u o r e s c e n c e ，o rf l u o r e s c e n c el i f e t i m ei m a g i n gh a sp r o v i d e di m p o r t a n ti n s i g h t si n t ot h e c o n c e n t r a t i o na n ds p a t i a ll o c a t i o no fi o n st h r o u g h o u ts i n g l ec e l l s 。o n ec h a l l e n g ef o r t h e s eo p t i c a lm e t h o d sh a sb e e nt h a te a c hd y em u s tb ec h o s e ne a s e f u l l ym i da s s e s s e df o r i t sa b i l i t yt op r o v i d ea c c u r a t ea n dr e l i a b l ei n f o r m a t i o nf r o mw i t h i nac e l l 。f a c t o r ss u c h a st o x i c i t yt ot h ec e l l ，i n t r a c e l l u l a rs e q u e s t r a t i o n ，p r o t e i nb i n d i n g , a n dl e a k a g eo ft h ed y e f r o mt h ec e l l f r e q u e n t l yc o m p l i c a t et h ei n t e r p r e t a t i o n o ft h er e s u l t sa n dm u s tb e c o n s i d e r e d + w h i l et h e r ea r ei n d i c a t o rd y e s ，s u c ha sf u r a - 2 ，t h a tw o r kv e r yw e l lw i t h i n v a r i o u sc e l l s ，m a n yf l u o r e s c e n tp r o b e ss u f f e lf r o mt h ep r o b l e m sl i s t e da b o v e ，t h u s l i m i t i n gt h en u m b e ro fd y e sa v a i l a b l ef o rr e l i a b l ei n t r a c e l l u l a rm e a s u r e m e n t s 。 弧ep r o b e se n c a p s u l a t e db yb i o l o g i c a l l yl o c a l i z e de m b e d d i n g ( p e b b l e ) s e n s o r w a sd e v i s e di no r d e rt op r o v i d eaf l u o r e s c e n c eb a s e dm e t h o df o ri n t r a c e l l u l a ra n a l y s i s t h a tc i r c u m v e n t sm a n yo ft h ea b o v e m e n t i o n e dp r o b l e m s 。t h ep e b b l ei sa s u b m i c r o m e t e r ，s p h e r i c a lp o l y m e rt h a tc o n t a i n so n e o rm o r ef l u o r e s c e n td y e st h a ta r e t r a p p e dw i t h i nt h ep o r e so f t h em a t r i x 。髓ep o l y m e rp r o v i d e sap r o t e c t i v ec o a t i n gf o r t h ed y e s ，s ot h a tt h e ya r en o ta f f e c t e db yt h ec e l l ，t h e r e b ym i n a m i z i n ge r r o rf r o mp r o t e i n b i n d i n ga n dm e m b r a n e o r g a n e l l es e q u e s t r a t i o n 。t h u s ，p e b b l e sc a nb ec a l i b r a t e di n v i t r oa n du s e di nv i v o ，w i t ht h er e s p o n s eo ft h es e n s o r sr e m a i n i n gc o n s i s t e n tr e g a r d l e s s o fe n v i r o n m e n t m u l t i p l ed y e sc a nb ec o m b i n e di nas i n g l ep e b b l es e n s o r ，s ot h a ta i e f e r e n c es t a n d a r dc a l lb eu s e dt om i n i m i z ee l - f o bf r o mu n e v e nd y ed i s t r i b u t i o n s t h r o u g h o u tt h ec e l l a n o t h e ra d v a n t a g eo fp e b b l e s i st h a tt h e ya r es m a l le l l o u g ht ob 露 b i o c o m p a t i b l e ，y e tl a r g ee n o u g ht ob er e t a i n e di nt h ec y t o p l a s mo ft h ec e l lw i t hn o l e a k a g eo ft h es e n s o ro u to ft h ec e l l ，e v e na f t e rs e v e r a ld a y s f u r t h e r m o r e ，m a n yt o x i c e f f e c t so ft h ed y ea r ee l i m i n a t e d 。 懿薹 i nt h i sp a p e r ，t h eg e n e r a lt e c h n i q u e sf o rf a b r i c a t i n gp e b b l es e n s o r sf o rc a l c i u m b yu s i n gt h en e wf l u o r e s c e n tp r o b e s ( s t d b ta n ds 明) 酗t h a ts y n t h e s i z e di no u r l a b o r a t o r ya r ep r e s e n t e d t h ep r o p e r t i e si n c l u d es e n s o rs i z e ，c a l i b r a t i o n ，p h o t o b l e a c h i n g ， a n dm e t h o d sf o ri n s e r t i n gp e b b l es e n s o r si n t os i n g l ev i a b l er a tc a r d i a cm u s c l ec e l l s a r ea l s od i s c u s s e dw i t ht e m ，c o n f o c a lm i c r o s c o p ea n df l o wc y t o m e t r y 。 t h et h e s i si n c l u d e st w op a r t s ： 1 。r e v i e w m e t h o d sf o ri n t r a c e l l u l a rc a 2 + m e a s u r e m e n ta n dd e v e l o p m e n t 。ft h en a n o s c a l e p r o b e se n c a p s u l a t e db yb i o l o g i c a l l yl o c a l i z e de m b e d d i n g ( p e b b l e s ) s e n s o r sw e r e r e v i e w e di nd e t a i l 。t h ep r i n c i p l e ，m e t h o d sf o rf a b r i c a t i o na n di n s e r t i n gp e b b l e s e n s o r si n t os i n g l ec e l l sw e r ed i s c u s s e d , a n dt h ep u r p o s ea n dt h er e s e a r c hc o n t e n to ft h i s t h e s i sw a sr e p r e s e n t e d 。 2 。e x p e r i m e n t ( 1 ) f a b r i c a t i o no fp e b b l en a n o s e n s o r sf o ri n t r a c e l l u l a rc a l c i u m ：t w on e w f l u o r e s c , e n tp e b b l en a n o s e n s o r sf o ri n t r a c e l l u l a rc a l c i u mb yu s i n gt h en e wf l u o r e s c e n t p r o b e s ( s t d b ta n ds t d i n ) s y n t h e s i z e di no u rl a b o r a t o r ya l ef a b r i c a t e d 。t r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) w a su s e dt od e t e r m i n et h es i z ea n dt h es h a p eo ft h e p e b b l es e n s o r s i tw a sd e t e r m i n e dt h a tt h em i c r o e m u l s i o n p o l y m e r i z a t i o np r o d u c e sa p r e d o m i n a n ts i z ed i s t r i b u t i o no f3 0 - r i ms e n s o r s t h es e n s o r sa l s os h o w nar e g u l a r l y s h a p ea n ds m o o t h l ys u r f a c e ( 2 ) t h ep r o p e r t i e so fc a l c i u mp e b b l en a n o s e n s o r s ：t h ep r o p e r t i e si n c l u d e f l u o r e s c e n ts p e c t r a ，c a l i b r a t i o n ，o p t i c a l s t a b i l i t y w e r ei n v e s t i g a t e d t h ep e b b l e s e n s o r ss h o wal i t t l es p e c t r as h i f tc o m p a r e dt ot h ef r e ed y e s t h ec a l i b r a t i o nw a ss i m i l a r t ot h o s eo ft h ef r e ed y e s t h eo p t i c a ls t a b i l i t yo ft h ed y e se n t r a p p e dw i t h i nt h ep o l y m e r m a t r i xa l eb e t t e rt h a nt h o s eo ft h ed y en o ti n t h em a t r i x ( 3 ) l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p es t u d yo fi n s e r t i n gp e b b l es e n s o r si n t o s i n g l el i v i n g ，v i a b l ec e l l s ：t h ep e b b l es e n s o r sc a nb ei n s e r t e di n t oc a r d i a cm u s c l e c e l l sj u s ta f t e ri n c u b m e di tw i t hc e l l sf o ra b o u t3 0 m i n ，a n dd i s t r i b u t e ds e l e c t i v e l yi n t o t h en u c l e u so ft h ec e l l s + t h e f l u o r e s c e n ti n t e n s i t yo ft h ec a r d i a cm u s c l ec e l l si nv a r i o u st i m ea f t e rb e e n l a b e l e d 谢也c a l c i u mp e b b l es e n s o r s ( s t d b t ) w a si n v e s t i g a t e dw i t hf l o wc y t o m e t r y t h ee x p e r i m e n tr e s u l tv e r i f i e dt h er e s u l to fc o n f o c a lm i c r o s c o p e 。 i v k e yw o r d s ：i n l t a c c l l u l a rc a l c i u m ；s p h e r i c a lo p t i c a ln a n o s e n s o r s ；p e b b l e s ； f a b r i c a t i o n ；s t d b t ；s 卫d h ：c a r d i a cm u s c l ec e l l s v 学位论文独创性声明 y 90 02 04 本人声明所竖交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经注明弓 震的随容外，论文中不包含其他个人已经 “ 发表或撰写过的研究成果，氇不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位 或证书面使用过的材睾喜。对本文的研究做出重要贡献的个入和集体，均已在文中 作了嘲瞻说明并表示谢意。 作者签名： 学位论文使用授权声明 黾叛番。冬，； 霹期：兰垒：竺：三乙 本入围意研究生在校攻读学位裳闻论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校蜃，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西_ ；| 萃 范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电 子版秘纸质舨：有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制劳允许论文进入学校 图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索； 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：盛飘：够j 争乡i 1 1 引言 第一章概述 细胞内的重要生理活性物质有很多，如钙、锌、铜、氧等。它们广泛分布于 人体的细胞和体液之中，对人体的生命活动起着重要的作用。其中，钙是人体内 极其重要的金属元素( 日必需量为1 0 m g k g 左右) 。钙除了作为组成骨骼、牙齿的 主要原料外，还参与调节众多的生命过程。它不仅直接激活具有重要生理意义的 胞内机械活动，而且也作为胞内第二信使介导胞外信号( 如激素) 对胞内的反应。 钙对细胞的代谢与功能的调节作用几乎涉及到细胞的所有生理和生化过程，如细 胞的胞吞，胞饮、神经质释放、d n a 合成、细胞分裂、乃至细胞死亡等i ”。锌是 一种重要的人体必需的微量元素( 日需要量是1 0 1 5 m 曲。z n “是人体内2 0 0 多种酶 的组成成份，直接参与体内细胞生长发育，生殖、组织修复等各种生命代谢过程。 z n 2 + 在细胞的生命活动中起着非常重要的作用，基因转录、金属酶的功能、神经传 递等都必须有z n 2 + 的参$ 1 1 1 2 1 。铜是人类和动物体内重要的微量元素之一，它不仅参 与机体内蛋白质、氨基酸、核酸、脂肪、碳水化合物、维生素等营养物质代谢而 且还在骨骼发育、生殖、免疫、凝血、生物膜的稳定性等生理机能中起着重要作 用1 3 】。氧是维持人体生命的必需物质，是维持脏器功能的基本条件。生命体中任何 一个系统的氧的浓度及其分布出现异常，将直接影响到正常的生理活动1 4 1 。 随着人们对胞内重要生理活性物质的重要作用以及他们与某些疾病发生和 发展关系的认识越来越深入，胞内重要生理活性物质的研究已成为化学，生物学， 基础和临床医学等学科的重要前沿热点研究课题【。 1 2 胞内重要生理活性物质的研究方法 目前胞内重要生理活性物质的研究方法很多。人们常常根据各种方法的特点， 按照所进行实验的具体要求而选择不同的测定方法。如生物发光蛋白法、有机显 色剂法、离子传感器法、微电极法、核磁共振法，荧光探针法等。其中又以荧光 探针法研究居多。 1 2 1 火焰原子吸收光谱法 铜、锌是人体必需的微量元素。正常人体内铜、锌的含量很少，淋巴细胞内 含量更加甚微。叶平、刘源、赵力军等应用火焰原子吸收法测定淋巴细胞内铜、 锌，取得了很好得效果。应用该方法对细胞中铜、锌含量的测定，得到铜锌含量 的演变规律对全面研究克山病人体元素的代谢变化及评价心脏功能有实际i | 缶床意 义【9 l 。 1 2 2 有机显色剂法 紫脲酸铵类有机显色剂包括紫脲酸铵及其衍生物， t e t r a m e t h y l m u r e x i d e ( t m x ) ，p u r p u r a t e 一3 ，3 - d i a c e l i c a c i d e ( p d a a ) 和i , i - d i m e t h y l p u r p u r a t e3 , 3 - d i a c e t i ca c i d e ( d m f d a a ) 。该类有机显色剂均为低c a 2 + 亲和力，常被用来 测定肌纤维受到刺激时快速大量的游离【c a 2 + 】i 的瞬态变化【l o ，1 。偶氮类有机显色剂 主要有偶氮j 9 l g m ( a r s e n a z o ) 和a n t i p y r a l a z o - i i i 等，与紫脲酸胺类有机显色剂相比 较，该类试剂对于c a 2 + 的具有较高的灵敏度。1 9 7 5 年b r o w n 等首次采用注入偶氮 胂的方法测定了鱿鱼巨轴突细胞内游【c a “h 变化1 1 2 j 1 2 3 微电极法 w a l l e r 将离子交换膜钙选择性微电极技术应用于细胞c a 2 + 活度的测定，使得 这方面的研究工作得以迅速的发展1 1 3 】。c a “选择性微电极的特点在于其测定线性范 围宽( 1 0 8 1 0 - 2 m m o l l c a 2 + ) ，并可直接插入细胞内，迅速、连续地提供细胞内任 意部c a 2 + 活度的动态变化信息，但对细胞有一定程度的损伤，很难实现无损分析， 所以无法检测生理条件下的细胞内游离【c a 2 + 】j ，且与一般的生理过程相比，电极响 应时问较长( 通常需要几秒) ，仅能用于静息状态下的细胞内 c a “】i 的测定，不适合 连续、动态地测定瞬间细胞内游离钙的变化。 1 2 4 核磁共振法侧m r ) 1 9 8 3 年g e r r y - a s m i t h 等合成了氟代指示剂n f - b a p t a , 并利用该指示剂对小 鼠的胸腺细胞进行了1 9 f - n m r 检测，建立了核磁共振法测定细胞内游离钙离子的 方法。1 9 f n m r 测定细胞内游离钙由于在细胞器内分布均一，不存在隔室化效应， 并且正常细胞内含氪成分很少，氟代指示剂进入细胞脱酯完全，测定无本底信号 的干扰，计算方法简单，提高了检测的精确度，而且这种方法可与”p n m r 联合 直接考查细胞内c a 2 + 与m 9 2 + 、a t p 、磷酸肌酸、一等之间的关系。但这种方法较 为昂贵，不适用于普通实验室及常规操作i i “。 该法也应用于测定溶液中的活性氧【”】，核磁共振法是非侵入的测定，但是精 确度有限。 1 2 5 生物发光蛋白法 1 9 6 2 年，s h i m o m u r a 【9 】等从多管水母( a e q u o r i a vi c t o r i a ) 中分离出一种蛋白质 水母发光蛋白( a e q u o f i n ) 。1 9 6 7 年，r i d g w a y 和a s h l e y 用该蛋自首次成功地应用 于活细胞内【c a 2 + 】i 的测定。 1 2 石荧光探针法 荧光探针法是近年来发展起来的一类离子浓度测定方法，其原理是采用一些 能与被测离子特异结合的荧光分子，这些分子与被测离子结合后，其光学性质发 生变化，在一定波长的光激发下发出特定波长的荧光，荧光强弱与溶液中的被测 离子浓度成一定的相关性，因此可阻通过测定荧光强度来反映细胞中重要生理活 性物质离子的浓度。 荧光探针法按探针的性质可以分为绿荧光蛋白探针法( 主要是基于绿荧光蛋 白及其突变体的方法) 和化学荧光探针法( 一般以一些有机的小分子荧光染料作为 荧光探针) 。 1 2 6 1 绿荧光蛋白法( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ，g f p ) 1 9 9 2 年，g f p 作为水母发光蛋白的配对物被分离，作为辅助蛋白的g f f 在水 母中的功能是将其所产生的蓝光转换为绿光，这是因为它们之间进行了能量转换 的缘放。研究人员开始设计f r e t 依赖的c a “荧光指示剂，g o l o v i n av a c ta l 报道 合成了一种与c a 2 具有低亲和力的c a “o f p 指示剂并用于测定亚细胞器中的c a “ 浓度也可用于检测c a 2 * 浓度的快速变化，另外由于对c a “的低亲和力，这类指示 剂与c a 2 + 反应速率很大，也可用于分析由于肌肉收缩而引起的c a “的变化m j 。 g e t z o f f 等报道了一个g 珊的突变体，它在其共轭生色团位置结合z n 2 + 。从而导致 了荧光强度的加强”8 1 。 但是，g f p 在应用中还发现有许多问题亟待解决：( 1 ) 荧光信号强度的非线性 性质使得定量非常困难；( 2 ) 多数生物具有微弱的自发荧光现象，并有着类似的激发 和发射波长，这个荧光背景会影响某些g f p 的检测1 1 9 1 。 1 2 6 2 小分子荧光探针法 该法可以无损伤导入细胞，对被测离子选择性高、响应迅速且能与现代先进 的荧光成像技术联用，是目前应用最广泛的测定细胞内重要生理活性物质离子浓 度的方法。 目前常用的小分子c p 荧光探针主要是由美籍华裔科学家t s i c n 等合成的三 代小分子c a “荧光探针及其类似物。1 9 8 2 年美籍华裔科学家t s 蛔等合成了第一 代c a 2 + 荧光探针q u i n 1 、q u i n - 2 、q u i r t 3 1 2 0 。1 9 8 5 年，第二代c a 2 + 荧光探针出现， 3 包括f u r a 1 、f u r a 2 、f u r a 3 、i n d o 1 1 2 l 】，其中f u r a - 2 最好。1 9 8 9 年，第三代c a 2 + 荧光探针f l u o 3 出现吲。 近几年来，我国的试剂合成工作者在钙荧光探针合成方面取得了一定的进步， 设计和合成了一系列新型钙荧光探针，如s t d i n 、s t d b l “。其中性能较好的 s t d i n 是一种新型具有靶向性的胞浆内c a 2 + 荧光指示剂。与其它指示剂相比，该 指示剂具有较好的靶向性，只标记胞浆c a 2 + 而不标记胞核c a 2 + ，据此可比较准确 地测定胞浆内的c a 2 + 浓度【c a 2 + i 2 4 1 。 用于细胞内z n 2 + 浓度钡i 定的荧光探针近几年来研究较多。t s q 明是1 9 8 7 年由 f r e d e r i c k s o n 等发展起来的。它首先用于z 2 + 的成像，这个工作被认为在生物锌荧 光探针发展上一个里程碑式的工作。它和z n 2 + 结合后，吸收波长和发射波长分别 位于3 3 4 n m 和4 9 5 n m 。在4 9 5 n m ，它能够发出很强的荧光，量子产率达到了0 1 。 作为一个中性p h 值的荧光探针，它已经被证明是一个具有很好的选择性，无毒的 荧光探针。荧光素是在探针分子中采用最广泛的荧光团，因为萁在水溶液中有很 强的荧光量子产率，而且其激发波长在可见光区范围。因此以荧光素为荧光团的 z n 2 + 荧光探针如：z n p y r - 1 、z n a f - 1 、z n a f - 2 、z n a f - 2 d a 等在生物医学研究中得 到了广泛的运用瞄1 。 对用于生物体内氧活性氧浓度的测定，探针的选择需要考虑众多因素，这些 因素包括：探针自身的发光性能及其在生物体内的溶解性能、毒副作用、稳定性 等。目前已用于生物体中氧探测的光学探针主要有荧光素类荧光探针、钌络合物 系列荧光探针等。荧光素类荧光探针：荧光素的结构特点使其具有特定属性【2 7 j o p i t z 掣冽以罗丹明绿和荧光素为荧光指示剂，采用f c s ( f l u o r e s c e n c ec o r r e l a t i o n s p e c t r o s c o p y ) 技术，构建了一种灵敏度高的氧传感器。聂金雷等【冽以二氯荧光素为 探针，利用荧光分光光度计直接定量测定线粒体内活性氧产生，并观察活性氧产 生的动态变化，从而建立了一种简便、准确、定量测定线粒体活性氧产生的方法。 t e d f o r d 等p 0 】最近将四碘荧光素b 包埋于硅胶凝胶，含氟聚合物中，制得的氧传感 器响应快，灵敏度高，检出限低。钉络合物系列荧光探针：近红外区的长波( c m 6 0 0r i m ) 相对于常规荧光( e m 6 的条件下，将分 别作为指示和参比的两种荧光染料包埋在纳米微胶囊传感器中。这个传感器包含 了 一 个对氧灵敏 的荧 光 染料 r u ( i i ) - t r i s ( 4 ，7 一d i p h e n y l 一1 ，1 0 - p h e n a n t h r o l i n e ) c h l o r i d e ( r u ( d p p ) 3 “) ，其光稳定，荧光 量子产率高o o ) ，且激发态寿命长( 5 1 3 a s ) ，极易被氧猝灭，是一种非常理想的指 示染料。另外还有一个对氧不灵敏的染料o r e g o ng r e e n4 8 8 d e x l r a n 作为参比染料， 因为其尺寸较小只有5 0 3 0 0 r i m 和包埋传感器的惰性基体，所以在其进入活细胞时， 对细胞的生理功能基本上没有影响。将参比染料o r e g o ng r e e n 4 8 8 d e x 仃a n 连接在 葡萄糖上，使之易于分散在聚合物基体中，同时分子体积增加有利于阻止染料的 泄漏。 y o n g - e u ul e ek o o 等【4 6 1 报道了另外一种实时测定活细胞中溶解氧的方法，他 们运用有机修饰硅酸盐( o r g a n i c a l l ym i d i f i e ds i l i c a t e ) ( o r m o s i l ) 纳米粒子作为基体，这 个纳米粒子经过一个溶胶凝胶的过程而形成。实际上这种方法其实也是一种溶胶一 凝胶法制备聚合物荧光型纳米微胶囊传感器( p e b b l e s ) 的一种变化，其形成一共使 9 用了两种先驱体：一个是p t m s ( p h e n y l t r i m e t h o x y s i l a n e ，苯基三甲氧基硅烷) ，另一 个是m t m s ( i n e t h y l t r i m e t h o x y s i l a n e ，甲基三甲氧基硅烷) 。首先是以p t m s 为基体的 纳米粒子的形成，经过了一个溶胶一凝胶的过程。第一步是苯基三甲氧基硅烷在酸 性条件下的水解形成核纳米粒子，然后是硅烷的凝聚，但是经过这种方法所得到 的p e b b l e s 的平均尺寸大d x 为3 0 0 - 8 0 0 r a n 。经过研究发现水解的时间长短和p t m s 的用量是决定p e b b l e s 尺寸大小的主要因素。通过降低p t m s 的浓度和延长水解 时间，p e b b l e s 尺寸大小得到了很好的降低，尺寸的降低有效的缩短了响应时间 和降低了进入细胞时的生物学上的损害。但是这种基于p t m s 的纳米粒子在水中 的溶解度相对较低，这样一来，使p e b b l e s 在活体中的应用就较为困难。因此在 其表面涂抹一层亲水的m t m s ，以提高其在细胞环境内的亲水性。这个传感器包 含了一个对氧灵敏的铂卟啉染料作为指示剂，和一个对氧不灵敏的染料作为参比 进行比率强度测定。有两组指示染料和参比染料经常被使用，分别是：铂八乙基 n l - 吩( p l a t i n u m ( 1 1 ) o c t a e t h y l p o r p h i n e ) 和d i o 高氯酸盐( 3 ，3 一d i o c t a d e c y l o x a c a r b o c y a n i n e p e r c h l o r a t e ) ；铂八乙基卟吩酮( p l a t i n u m 一( mo c t a e t h y l p o r p h i n ek e t o n e ) 和八乙基口卜吩 ( o c t a e t h y l p o r p h i n e ) 。这种p e b b l e s 有很高的灵敏度，其猝灭响应为9 7 ，在溶解 氧的浓度范围内( o 一4 3p p m ) 其s t e r n v o l m e r 图有很好的线性范围。 1 4 2 3 乳液聚合法【3 2 】 对敏感试剂( 荧光指示剂) 本身在结合分析对象前后有荧光信号变化时，一般用 反相微乳液聚合等方法制各亲水型p e b b l e s 。但象k + 、n a + 、a 一等还没有与之结合 产生荧光变化的荧光染料，对这类分析对象则须进行一个信号转化过程。m o n f 等 1 4 7 删提出中性离子载体和亲脂p h 指示剂的离子交换原理，以阳离子为例其基本过 程是：中性离子载体可以选择性识别被测的阳离子，亲脂性p h 指示剂的质子化形 式和非质子化形式具有不同的光学性质( 荧光光谱或吸收光谱的变化) 。p h 指示剂为 中性时，敏感膜中加入亲脂性的阴离子( 如四苯硼酸根离子) r - 以维持电中性，由于 被测的阳离子m + 与h + 具有相同的电荷，为了维持体系的电中性，中性离子载体每 从溶液中结合一个m + ，就必须有一个h + 进入溶液，反之亦然。这一离子交换过程 将影响到亲脂p h 指示剂的存在形式，因p h 指示剂的质子化与非质子化形式具有不 同的光学性质，可被光学检测器检出。整个体系依赖于不同组分间的热力学平衡。 为了使传感器微型化，一般用荧光而不用吸收光作为检测手段。据此原理可以构 建亲脂。i 生p e b b l e s 。采用乳液聚合是制各亲脂性传感器的主要方法。钾离子在细 胞内起着非常重要的作用，通常用来检测细胞内钾离子浓度的方法有微电极和膜 片钳技术。但这些方法对细胞内多个分析对象检测无能为力。与之相比p e b b l e s 1 0 提供了一个在单个活细胞中对多种分析对象进行分析的全新手段。 m u r p h yb r a s u e l 等【4 埘用乳液聚合法制备钾离子p e b b l e s ：在正己烷中加入单 体聚甲基丙烯酸癸酯、交联剂和增塑剂，p e g 作为表面活性剂，用过硫酸钾引发， 在水浴条件下，升温n 8 0 ，全速搅拌下反应3 0 4 0 m i n ，然后降低搅拌速度反应 2 h ，最后在室温下反应8 1 2 h 。反应完成之后，用水和乙醇漂洗过量的p e g 和未反 应完全的单体，用唧洗去增塑剂，然后在7 0 。c 下干