（生物化学与分子生物学专业论文）4氨基糖的合成及糖蛋白寡糖链的化学分析.pdf

4 一氨基糖的合成及耱蛋白寡穗链的化学坌堑 第2 页共4 3 页 摘要 糖、蛋白质、核酸是三类最基本的生命物质，随着对糖类化合物功能的 深入认识，糖类的相关研究发展迅速。近年来，糖生物学已成为后基因组时 代生命科学的重要前沿。合成及有效分析方法的确立一直是糖类及其相关研 究中的难点。本文主要涉及4 一氨基糖的化学合成及糖蛋白寡糖链分析体系的 建立两个方面。 4 一氨基糖的合成：以d 一半乳糖为原料，采用1 位与6 位环化，2 位苄 基取代的方法，利用空间位阻，将叠氮基导入糖的c 4 位，经还原成功地得到 了目标化合物4 一脱氧一4 一氨基一d 一葡萄糖。 糖蛋白寡糖链分析体系的建立：采用糖的荧光衍生化及二维h p l c 的分 析方法建立了灵敏、快速、准确的糖蛋白寡糖链结构分析体系。 关键词：糖，4 一脱氧一4 一氨基一d 一葡萄糖，合成，结构分析 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 ! = 壑茎董些盒堕丝董至自塞蔓壁盟垡堂坌堑羔塑l 型坐! 垦一 a b s t r a c t c a r b o h y d r a t e w i t hp r o t e i na n dn u c l e i ca c i di s o r eo ft h et h r e ep r i m a r y e l e m e n t sw h i c ha r em a d eu po fl i f e w i t ht h ed e v e l o p m e n to fc o g n i t i o n i n f u n c t i o no fc a r b o h y d r a t e ，t h er e s e a r c hr e l a t i n g t oc a r b o h y d r a t ed e v e l o p sv e r y r a p i d l y i nt h ep a s tf e wy e a r s ，g l y c o b i o l o g yh a sb e e nb e c o m i n gt h ei m p o r t a n t f o r e l a n do fp o s t g e n o m ea g e t h ee s t a b l i s h m e n t o fs y n t h e s i sa n de f f e c t i v e a n a l y t i c a lm e t h o di sa l w a y st h en o d u s i ng l y c o b i o l o g ya n dc o r r e l a t i v es t u d y t h e a r t i c l ei sm a i n l yi n v o l v e di nt w os i d e s ：o n ei sc h e m i c a ls y n t h e s i so f4 - a m i n o s u g a r ；t h eo t h e ri st h ee s t a b l i s h m e n to f t h es y s t e mt oa n a l y z et h eo l i g o s a c c h r i d e s i ng l y c o p r o t e i n t h es y n t h e s i so f4 - a m i n os u g a r ：t h er e a c t i o ni sb e g i n n i n gw i t hd g a l a c t o s e w i t ht h ec y c l i z a t i o no fc1a n dc 6 ，b yt h er e p l a c e m e n to f b e n z y lg r o u p i nc 2a n d o w n i n g t os t e r i ch i n d r a n c eo fs p a c e t h ea 五d o g r o u p i si n d u c t e dt oc 4 s u c c e s s f u l l y t h e nt h r o u g h t h er e d u c t i o n ，t h et a r g e tp r o d u c ti sa c h i e v e d t h ee s t a b l i s h m e n to ft h e s y s t e m t o a n a l y z e t h e o l i g o s a c c h r i d e s i n g l y c o p r o t e i n ：t h es y s t e mi s e s t a b l i s h e dt h r o u g ht h ef l u o r e s c e n c ed e r i v a t i v eo f s u g a ra l o n gw i t ht w o - d i m e n s i o n a lh p l c ，w h i c h c o u l dm a k et h ed e t e c t i o nr a p i d ， a c c u r a t ea n d s e n s i t i v e l y k e y w o r d s ：e a r b o h y d r a t e ， s y n t h e s i s ， 4 - d e o x y - 4 一a m i n o - d - g h c t o s e , s t r u c t u r a la n a l y s i s 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 4 一氨基糖的合成及糖蛋白寡糖链的化学分析 第4 页共4 3 页 第一章综述 第一节糖类简介 作为三类最基本的生命组成物质糖、蛋白质、核酸，糖类的研究已 经有近百年的历史，糖类在自然界中分布最广、数量最多，也最早被人们研 究和认识【”。一个世纪以来，从生命科学的角度来看，糖类研究尽管也有很大 发展，但是，与蛋白质和核酸的飞跃式发展速度相比，显得远远落伍【2 】。为什 么经过1 0 0 多年的漫长道路，人们才开始认识到糖类在生命过程中的重要作 用? 主要原因有两点 3 , 4 1 ：理论上简单化：人们过低地估计了糖类对生命过程 的贡献。过去，药理学家们认为糖类只不过是一种能源和细胞的内支撑物； 在药物化学家考虑糖类合成时只涉及到一个基本反应，碳氧键的形成，觉得 化学反应是简单的。方法上困难重重：由于糖类的纯化处理和结构鉴定都 令人十分烦恼，因此没有人肯在方法上花很多工夫，许多人绕着走 2 1 。八十年 代以后，由于分子生物学，特别是免疫学和细胞生物学的迅速发展，糖的作 用功能才被逐渐地揭示和认识，特别是近十年来，糖类的结构测定和研究取 得了长足的发展。 糖类是自然界中存在的一类具有广谱化学结构和生物功能的有机化合 物，几乎所有的动物、植物和微生物体内都含有。许多研究结果表明：糖类 在生物体内具有极其重要的生物学功能t 5 , 6 】，尤其是作为一类重要的信息分子， 它在受精、发生、发育、分化、神经系统和免疫系统平衡的维持等方面起着 重要作用；在炎症和自身免疫疾病、老化、癌细胞的异常繁殖和转换、病原 体感染、植物和病原体相互作用、植物与根瘤菌共生等生理和病理过程中都 存在糖类的介导【7 1 。近年来，随着糖类结构和功能关系研究的突飞猛进，人们 日益认识到糖类在生命现象中的重要意义，糖类结构和功能的研究将成为继 蛋白质、核酸之后在生命科学领域中探索生命奥秘的第3 里程碑。 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 ! = 塾苎堕笪鱼盛墨董望鱼塞蕉壁塑些堂坌堑蔓：至墨! ! ! 一 第二节糖生物学 1 0 0 多年前德国著名科学家e f i s c h e r 就开始了糖类研究，1 9 2 3 年m h e i d e lb e r g e r 和t o s w a l d 提出细菌的抗原部分是多糖而不是蛋白质，因此， 糖类的生命科学几乎与蛋白质的生命科学同时诞生。但是，其发展速度远远 落后于蛋白质和核酸。直到本世纪6 0 年代，对糖蛋白的研究仍侧重于蛋白部 分，对糖链的作用缺乏足够的重视，认为糖类化合物除了提供能量维持生命 外，只有构成结构组织功能。近2 0 年来，随着细胞生物学和分子生物学的发 展，人们逐渐发现多糖具有许多方面的生物活性，而且多数无毒，是比较理 想的药物，如昆布多糖和肝素有抗凝血作用，硫酸软骨素可防止血管硬化 9 】， 香菇多糖、银耳多糖、刺五加多糖、黄芪多糖、灵芝多糖、酵母葡聚糖、茯 苓多糖、地黄多糖、枸杞多糖等具有增强免疫功能和抗癌作用f 1 0 】等。特别是 近十几年来。糖类结构测定和生物活性研究取得了明显进展，大量实验事实 揭示糖类是重要的信息分子、参与许多生理和病理过程，有关研究渗透到生 物学各个领域，1 9 8 8 年，英国几位多年从事糖类研究者首次提出“糖生物学” 这个名词【3 】，继之国际上发行了g l y c o b i o l o g y 和t r e n di ng l y c o s i c e n c ea n d g l y c o t e c h n o l o g y 等杂志【4 】。1 9 9 3 年在美国召开的第一届糖工程年会上，会议 主席称“糖生物学”是生物学领域的最后一个重大前沿。美国化学会还出版 了糖类学术会议论文专著糖类抗原【9 】。我国学者对糖化学研究十分关注， 特别是对糖类信息传递和识别进行了非常好的综述瓯”j 。 糖生物学的崛起和发展前景：以糖类作为研究对象的糖生物学是近年来 生命科学中出现的新兴前沿学科。1 9 9 0 年，3 个试验室几乎同时发现了血管 内皮细胞白血球粘附分子1 ( e l a m 1 ) 【1 2 1 ，后更名为e 一选凝素( e s e l e c t i o n ) 这种 位于内皮细胞表面的分子能识别白血球表面的四糖s i a - l e x 。更令人吃惊的 是，在肺癌和大肠癌细胞的表面也发现了s i a - l e x 。随后便出现了以此研究成 果为依据的开发和生产抗炎和抗肿瘤药物的热潮。因此e l a m 1 和s i a - l e x 的发现将糖生物学研究推向了生命科学的前沿。随着糖生物学基础研究的进 一步发展，及其研究方法和技术的日趋成熟，作为生命科学前沿学科，糖生 物学研究势必倍受重视，蓬勃发展。同时，糖生物学涉及诸多生物学科如分 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 ! 二壑苎蕉盟鱼堕丝焦星皂塞董壁盟垡堂坌堑 苎! 壅苎塑蔓 子生物学、细胞生物学、病理学、免疫学和神经生物学等，这也势必推动这 些学科的发展。现已出现免疫糖生物学，病毒糖生物学等多种交叉学科a 2 1 世纪生命科学的研究焦点之一是对多细胞生物的高层次生命现象的解释，因 此以生物体内细胞识别和调控的信息分子糖类为研究对象的糖生物学无疑是 必不可缺的，其发展前景不可估量。 第三节糖类研究动向和进展 1 作为信息分子的糖类 随着现代医学研究的进步、糖类合成化学和结构鉴定技术的发展，人们 逐步认识到寡糖和多糖的结构涉及到许多( 主体) 生命历程。糖类作为信息分子 已经得到普遍承认。现代科学研究发现，在细胞发展过程中，糖类分子决定 两个相反的基本细胞操作过程【1 3 1 ：0 正确地保持自身免疫防御体系( 抗细菌、病 毒感染) ；当细胞脱轨、出现自身免疫疾病或癌症时，细胞表面的糖分子就 改变结构和组成。当代主流化学家们正在认识到这样的事实：糖类是天才、 绝妙的简明信息箱。最近的发现支持这种假说 1 4 , t 5 1 ：细胞表面的糖分子参与了 细胞的特异性识别；特异性白细胞内皮细胞的细胞粘接分子c a m ( l e c c a m 2 ) 参与了感染部位的白细胞补充和某些癌细胞的代谢( 或者说生物多糖是修复细 胞的特异性粘接剂，粘接过程受配糖体调节1 ，以糖类为主要成分的药物逐渐 被发现，例如，拜糖平( 一种伪四糖，d 糖苷酶抑制剂) 【l6 1 ，水杨基l e w sx ( s l e 。) 的鉴定【l7 】是发现糖类作为先导药物的重大进展。 因为单糖具有多个可以反应的羟基，因此，同样一个寡糖中的单糖可以 有不同的连接方式，生成许多异构体，其数目比寡核苷酸、核寡肽多得多f 1 8 。 这么多的异构体给糖类的结构研究带来了极大的困难，另一方面也使糖类能 够携带极大量的信息。一种异构体可以代表一种信息，这可看成非常专一的 信息。在糖蛋白中经常出现的n 糖苷键连接的糖链是由4 个n 。乙酰氨基葡萄 糖，3 个甘露糖，2 个半乳糖，2 个唾液酸和1 个岩藻糖，共1 2 个糖基组成， 这样一个糖链的异构体可以达到1 0 2 4 ，是一个惊人的天文数字。其实在自然界 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 ! = 墼苎董塑宣堕墨壁墨旦曼蔓篁墼些堂坌堑 墨! 夏茎塑墨 中，这些糖链的结构还不是任意的，而是有一定规律可循的。作为信息分子 的糖类结构研究的困难不仅在于同一结构糖链可以有多种异构体，而且在于 糖链的不均一性。以糖蛋白为例，在同一肽链的同一个糖基化位点上所接的 糖链的结构可以不同：或是一个糖苷键的连接方式不同：或是多了或少了几 个糖基。这样，每一种糖型就相当于一种信息，一种糖型的混合物代表了一 组信息。因此，在研究糖链所携带的信息时，就不仅要考虑糖链的结构，而 且还要定量地分析同一糖基化位点的各种糖型的相对比例。 多细胞生物的细胞表面覆盖着一层糖链，亦称糖被【1 9 】。糖被如同大地表 面的植被，糖蛋白上多分支n 糖链则象树上粗大的树枝，o 糖链是细小的树 枝；膜糖蛋白的胞外肽链就如树干，穿越质膜的肽段和胞内肽段则是树根。 糖脂的脂质插入脂双层的外层，其肽链犹如小草。在细胞表面还包裹着一层 作为细胞间质的蛋白聚糖。这些不同组分和结构的糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖 被统称为糖复合物。细胞表面形成分支的糖链宛如天线，在细胞间传递着信 息。它们参与了细胞间的粘附f 2 0 f ，如作为细菌、病毒等病原体的受体l ，或 作为激素信息分子的受体。人类约有4 0 5 0 亿个细胞，这些细胞又组成了许 多细胞集团。每个集团的细胞以不同的方式相互粘附，细胞和基质之间也存 在着相互识别和相互作用，集团之间又相互识别、相互作用和相互制约，调 节和控制着高等生物沿着固有的空间轴和时间轴井然有序地发展。在如此复 杂的发展过程中所需的极其巨大的“生物信息”只能由所含信息量比核酸和 蛋白质大几个数量级的糖链分子来承担。 在细胞核和细胞质内发现了蛋白质的一些丝氨酸或苏氨酸的羟基可以发 生n 一乙酰氨基葡萄糖糖基化1 2 2 1 。这种糖基化和一些蛋白质的磷酸化相似：都 发生在s 或t 的羟基上；都与一些蛋白质体系的装配和解聚有关，进而影响 到细胞核质内的一些生理过程。还观察到r n a 聚合酶i i 的最大亚基c 一端结 构域中的些丝氨酸和苏氨酸既能发生n 乙酰氨基葡萄糖糖基化又能磷酸化 弘，且这两种修饰有不相容性。这些实验结果都提示了n 一乙酰氨基葡萄糖糖 基化可能是细胞核质内一些生理过程的另一种调控方式。在细胞核内还发现 有肝素和硫酸类肝素等糖胺聚糖的存在【2 5 1 ，这些多聚阴离子能影响d n a 和 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 ! 二壑苎塑盟鱼垡垦董堡旦塞蕉壁箜些兰坌堑 里! 夏茎竺壅 r n a 的结合，很可能是因为这些酸性多糖能与d n a 结合的组蛋白相互作用。 2 糖类与遗传学 糖类在遗传学上的重要地位一一糖类在遗传学上是非常重要的物质之 一，过去人们并没有给予足够的评价。例如，d n a 与r n a 的区别，既不在 碱基上、也不在磷酸上，其唯一的差别是在核糖( r n a ) 或脱氧核糖( d n a ) a z ： r n a 的核糖上2 位有羟基，d n a 的核糖上2 位无羟基。核糖的2 位羟基对 于r n a 来说，不仅是折叠成固有三维结构的关键因素，也是r n a 具有催化 作用的重要组成部分，我们认为核糖2 位羟基是d n a 和k n a 在遗传学上的 本质差别，由此可见糖类在遗传学上扮演着核心、关键角色。根据糖类在生 命过程中所扮演的重要角色，我们推测糖类应该有自己的遗传密码 2 4 , 2 6 】。 1 ) 遗传学上的再认识和糖类遗传密码1 2 7 1人体内蛋白质处于不断降 解和合成的动态平衡。成人每天约有1 2 的总体蛋白质被降解。不同蛋白 质的寿命差异很大，短则数秒钟，长则数周。人血浆蛋白质的t 1 ，2 ( 蛋白质降低 其原浓度一半所需时间) 约为1 0 天，肝中大部分蛋白质的t i 尼为i 8 天，结缔 组织中蛋白质的t l ，2 可达1 8 0 天以上【46 1 。关键调节酶的t 1 ，2 都很短。生物多糖 的代谢周期尚无人报道。可见没有哪个生物分子是终生不变的，因此，我们 认为遗传问题，不仅是先天的代、系遗传，也包括全部生命过程中的正常代 谢和准确表达。生命信息的准确传递是维持正常生命过程的基础，而三维结 构的准确遗传、正常代谢和准确表达则是信息准确传递的物质结构基础。那 么作为天才绝妙信息箱的糖类，其物质结构基础是如何由双亲传给子代的? 在 后天的细胞新陈代谢中这种结构基础又是如何正常代谢和准确表达的? 我们把 这个问题的答案称为糖类遗传密码( 也可以简称为糖码) 【4 ”，也就是说，与蛋白 质遗传密码类似，生物体内也可能存在糖类遗传密码。虽然，当代大多数科 学家都认为是糖基化酶编码了糖类，但是也有一些人注意到了糖类本身的编 码功能、对基因的反调控作用、糖类维结构的多样性和三维结构的有限性 等等。遗传和变异是生命过程不可缺少的两个重要方面，二者都有两重性。 遗传保持了种、属的相对稳定性，但是不能产生新种，难以适应变化大的环 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 ! 二复釜董塑鱼堕垄塑堡旦兰塑壁堕些堂坌堑 兰! 戛基竺要 境( 包括巨大的气候变化、外来细菌、病毒感染和化学物质损伤) ，不变异就会 退化或在环境大变化中消亡。变异既可以发展优势、产生新种、适应不断变 化的环境，也可能畸变到病态( 例如癌症和病毒感染都是变异中坏的、消极方 面1 使个体消亡。由于糖类所具有的结构多样性和易于异构化，保守性不及核 酸和蛋白质，变异性可能会超过核酸、蛋白质。 2 ) 关于糖类遗传密码是什么的推测地球生命初始形成过程是：先有 低等植物一高等植物( 糖类为主体) ，然后才有低等动物一高等动物( 蛋白质为 主体1 ，因此，糖类也是任何生命体都不可缺少的核心物质之一，糖类与蛋白 质一样可能也有自己的遗传密码，虽然二者可能有一定内在联系，但是也必 定存在明显差别。糖类遗传密码可能与糖类本身有密切关系( 包括糖甙、糖菅 衍生物) 。在地球生命形成历史上，也许先有糖类遗传，然后才有蛋白质遗传。 由于生物多糖研究t e 蛋白质研究方法困难，促成了人们认识顺序的颠倒。在 遗传学上，目前仍然存在着先有鸡还是先有蛋的争论，即究竟是先有r n a 还 是先有d n a ? 从生命起源角度考虑，糖类( 碳水化合物) 是自然界最容易生成的 有机分子，c 0 2 + h 2 0 在大海的盐场催化下，阳光为能源，可以形成甲醛，这 是第一个最简单的有机分子( c h 2 0 是最小的碳水化合物) 。从第一个简单的有 机分子到复杂、高级的生命有机分子，必然存在一条通路。虽然关于生命起 源的偶然学说是最省力气的解释，但是，偶然中存在着必然，这条通路有待 人们去发现。 3 )糖类遗传密码与i i 型糖尿病( 非胰岛素依赖型) i i 型糖尿病的病 因目前还不清楚，我们从糖类遗传学角度分析认为，i i 型糖尿病的主要病因 2 8 , 2 9 1 可能是糖类遗传密码出了毛病，如果从糖类遗传密码假说角度【3 2 】研究i i 型糖尿病，有可能获得新结构类型的治疗药物。i i 型糖尿病的病因学研究可能 有利于糖类遗传密码的破译，这就是解铃还需系铃人。对出毛病的糖类遗传 密码进行部分修复或弥补其不足，需要对血糖具有双向调节功能的药物，而 不是现在临床上所采用的单纯降低血糖药物。膳食不平衡、某些营养不良、 某些营养过剩，时间长了会损伤调控糖类吸收和代谢的遗传系统，可能是发 生i i 型糖尿病的根本原因。 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 ! = 墨茎蕉盟垒盛垄整要皇塞整丝墼些兰坌堑 笙! ! 夏墨! ! 里 4 、糖类遗传密码与其它疾病的关系许多疾病的发生和治疗都与糖 类密切相关，例如，细菌和病毒的抗原部分早已为人们所认识，疫苗的应用 实际上是糖类的贡献。从糖码假说角度分析，癌症和病毒都可能是由于糖码 畸变造成的恶果( 包括自身变异和外来物质诱导发生的异变) 。艾滋病毒潜入人 体细胞后，不能被防御体系识别，我们认为原因在其耱类部分，现在的许多 研究方法都是基于蛋白质或核酸的结构方面，忽视了糖类的作用，所得到的 某些抗h i vi 抑s u n t 3 4 j 治标不治本，这可能是忽略糖类作用的结果。几千年 来，中医药所积累的丰富经验告诉我们，中医对糖类药物是非常重视的，扶 正固本的药物被列为上品，例如，人参、黄芪、灵芝、茯苓、地黄、拘杞子 等等，其中的活性成分大多数是皂甙、多糖或寡糖类【5 。，其实皂甙也是糖类衍 生物。我国药学家徐叔云教授【6 】认为：“只有皂甙具有双向调节作用”。我们认 为某些寡糖、杂糖( 除了葡萄糖以外的单糖) 分子和皂甙都可能具有双向调节作 用。如果把现代科学理论、方法与丰富的中医药理论、实践密切结合，可能 会取得令人瞩目的新进展。 5 )将会发现更多的糖类受体和糖类酶一一最近南韩科学家 ( m a n j u n g h a n 课题组) 发现，合成的糖类聚合物单体具有催化r n a 和d n a 的 水解作用 1 7 1 。h a i l 采用了糖的马来酸酐衍生物聚合法，其中的四个聚合物含有 呋喃核糖，一个聚合物含毗喃糖。它们的平均分子量84 0 0 1 70 0 0 。三个聚 合物中的呋喃核糖环存在顺式构型的邻位二醇羟基，既能催化对硝基苯基磷 酸乙酯的水解，也能催化含有3 0 个碱基的单股d n a 水解。d n a 难于水解是 众所周知的，一般情况下只有核酸水解酶才能水解它。该发现的新颖性得到 国际同行的高度重视和评价。英国生物化学家m j g a i t 评价说：很显然，糖 类聚合物有效地水解磷酸二酯键是史无前例的发现。虽然国际同行们高度评 价了h a r t 课题组的新发现，但是都没有涉及到是否存在天然的含有糖类的受 体或含有糖类的酶。我们认为，糖类聚合物单体能够水解r n a 和d n a 的发 现，是对糖码存在可能性的间接支持，它对生命科学理论的影响将远远超过 它本身的实用价值。 目前人们已经认识到寡糖的编码能力和对受体分子的表达5 ”，下一步将 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 ! 二堑茎董塑宣盛丝塑里鱼墨塑壁塑些堂坌堑 蔓! ! 戛苎竺要 要了解哪一种作用力决定了糖与受体之间的相互作用。我们预测，由糖类组 成的受体和酶，决定遗传和变异的糖类结构等等将会被逐步发现。糖类同蛋 白质、核酸一样都是生命过程的核心物质，涉及到许多生命过程的主体方面， 因此糖代谢失调( 例如糖尿病) 必然会引起全身性的各种其它类疾病郾】。糖类遗 传密码的探索研究有利于促进生物化学中最后一个重大研究前沿的深化和发 展，它涉及到生命起源、糖类在生命过程中的本质及其核心作用。 3 糖蛋白的基因工程及药物的设计研制 目前已有不少糖蛋白类药物可用基因工程方法进行生产，使用不同的表达 系统所得产物的肽链结构相同，但是糖链存在与否以及糖链结构却有很大的 差异。在一些细菌中所得的重组产物不含糖链【3 4 】，这样的表达产物也许仍有 一定的生物活性，然而它们在机体内的寿命和去向以及抗原性可能都和天然 的分子不同。酵母体系表达的产物可以是糖蛋白，但其糖链结构基本上都是 高甘露糖型田】，和哺乳动物细胞中表达产物的糖链结构可能不同口3 1 。即使是 使用了哺乳动物细胞株，表达产物的糖链结构也可因细胞株来源不同而异【2 4 1 。 由于不少容易生长的细胞株不是正常细胞，因此，它们的糖链合成体系的糖 基转移酶的情况也不同于正常细胞的酶系口扪。因而，不同表达体系中得到的 重组产物的糖链结构测定，以及不同体系中的糖基转移酶系的研究，在国外 受到相当的重视【2 7 】。 如前所述，糖类和蛋白质、糖类和糖类的相互作用参与了许多生理和病 理过程。有糖类参与的诸多细胞间的粘着和分子与受体间的作用都可以设法 利用相应的糖类分子加以阻断，使一些生理和病理过程不能发生【2 8 0 9 1 。选择素 的内源性配基的研究和合成就是例子d 1 捌。有关方面的研究已成为当前抗炎症 药物研制的一条新途径。希望能找到一些在低浓度时就有强烈抑制能力的糖 类物质，它们就有可能成为药物。 流感病毒在感染过程中，表面的凝集素和唾液酸酶都起了相当重要的作 用，这两种蛋白质及其与底物复合物的晶体结构都已阐明【3 引。结果表明，在 唾液酸酶的底物结合部位存在着两个酸性残基。为此，在其底物的c 4 上引进 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 ! = 堑茎塑盟鱼盛墨蕉堑皂塞整壁盟丝堂坌堑蔓! ! 夏苎塑墨 一个碱性的取代基团，氨基和胍基，就可增强底物和酶的结合能力。同时， 将底物分子的c 2 处改变成为一个双键，这样构建了一个酶的强烈抑制剂，其 抑制常数达0 1 n m 的水平。这一抑制剂和唾液酸酶复合物的晶体结构研究 3 6 , 3 7 l 也证明了，这样的设计是完全合理的。这个抑制剂的合理设计为抗流感药物 和类似药物的设计提供了新的思路。 例如e p o ，它是由肾脏产生、刺激骨髓红细胞成熟和增殖的激素，在h e p o 中糖链的含量约占4 0 ，具有高度不均一性。因e p o 对某些贫血，特别对再 生障碍性贫血具有其他药物无法取代的显著疗效，而天然e p o 的来源又十分 有限，故目前都用基因工程法来生产e p o 。实验证明”1 经过衣霉素处理或转 染缺失糖基化位点h e p o 基因的b h k 细胞不能分泌e p o 。而有些糖基化位点 突变后，虽然能分泌，但是e p o 的活性大大降低了。而唾液酸化不完全或去 除n e u a c 的h e p o 因很快被肝脏的去唾液酸蛋白受体摄取，故在体内根本没 有活性。如将末端g a l 氧化虽可使血中清除速度恢复正常，但是h e p o 的体内 活力消失殆尽。可见，糖类绝对是药物设计研究中不可或缺的部分。 糖类药物的设计和研制有力地促进了糖类合成的研究，除了常规的有机 合成外，一些实验室试图利用糖苷水解酶的逆反应来合成糖苷d 引，取得了一 定的进展。寡糖的固相合成法【3 9 1 的提出，是糖类合成的又一突破。然而糖类 的合成远比肽类合成要难得多。 第四节糖类结构分析的策略和方法 1 糖类分析的一般方法 1 ) 酸水解【4 0 】：水解可以把大分子裂解成较小片段，是色谱技术用来确定 多糖、寡糖中各种单糖组分构成的前提。控制酸的浓度、温度、时间可以达 到多糖、寡糖的部分水解和完全水解。一般来说，五环糖甙键远较六环糖甙 键易于水解，a 一糖甙键较1 3 一糖甙键易于水解，多聚六环戊糖远较多聚六环 己糖易于水解，糖醛酸和氨基取代基将增加水解难度。 多糖、寡糖在无机酸条件下能完全水解，定量地转变为相应的单糖。部分 复且大学撰写科学报告和学位论文专用纸 ! 二堡墨蕉鲤鱼堕墨壁里皂墨蕉壁盟些堂坌堑苎! ! 夏苎塑里 水解可以用无机酸，如盐酸、硫酸，也可以用三氟乙酸、醋酸等。盐酸用于 糖蛋白和含氨基脱氧糖的水解；硫酸用于中性糖的水解，三氟乙酸用于植物 细胞壁多糖、糖蛋白及糖胺聚糖的水解。甲酸、乙酸也用于特定多糖的水解。 2 ) 甲基化反应】：糖分子中的游离羟基通过甲基化反应完全被甲基取代 得到甲基化多糖，经过水解得到甲基单糖。气相色谱所能提供的多糖的大部 分结构信息都是从对多糖的甲基化水解产物的分离、鉴定来完成的。目前有 两种经典的甲基化方法，一是使用硫酸二甲酯和氢氧化钠，二是使用氧化银 和碘甲烷。对于上述两种方法，近年来有若干改进，效果更好。一种改进是 溶解多糖于n ，n - 二甲基甲酰胺中，再用碘甲烷和氧化钡或硫酸二甲酯和氧 化钡处理。目前最广泛采用的是h a k o m o r i 法【4 3 】，即用二甲亚砜和氢氧化钠制 备二甲基亚磺酰阴离子，用碘甲烷作甲基化试剂生成甲醚。此法快捷、可靠， 对寡糖和多糖都十分有效，一般只需要反应次即可达到完全甲基化。 2 蛋白寡糖链的分析 糖蛋白是指以共价键与糖连接的蛋白质，它广泛存在于动物、植物、微 生物和病毒中。糖蛋白寡糖链的许多生理功能是在糖链的参与下完成的，在 有的情况下，糖链的作用甚至更直接更突出。为了搞清糖链结构和功能的关 系，一个很自然而迫切需要解决的问题就是糖链结构的分析。 按照糖链与肽链的连接方式，可以将寡糖链分为两类，一类是n 连接的 糖链；一类是o 连接的糖链。 n 一连接的糖链：与天冬酰胺连接的寡糖链。通常包含一个五糖核心区， m 觚1 6 m 趾d1 3 m 卸b1 。4 g 1 淞b1 + 4 g 1 b 1 + a 5 n f i g u r e1 三甘露糖五糖核心 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 ! 二堑茎蕉塑盒盛壁塑堡鱼塞鳖壁竺些堂坌堑 箜! ! 墨茎塑要 称为三甘露糖五糖核心，至今对n 一糖链的结构已经比较透彻。根据该 五糖核心区连接的其他糖基的情况，n 糖链可分为三类【4 8 】：( 1 ) 寡糖链只含 有甘露糖和n 乙酰氨基葡萄糖，而且只有甘露糖连接在五糖核心区上，此类 糖链叫高甘露糖型：( 2 ) 寡糖链中除含有甘露糖和n 乙酰氨基葡萄糖，还有 半乳糖、岩藻糖和唾液酸。它们的基本结构是五糖核t l , 区加上一些数目可变 的n 乙酰氨基葡萄糖和半乳糖所构成的外链，而半乳糖可以连接着唾液酸， 此类n 一糖链叫复杂型。根据两个a 甘露糖上取代的n 一乙酰氨基葡萄糖的数 目，又将其分为二天线型、三天线型和四天线型等。( 3 ) 寡糖链中既有高甘 露糖链，又有n 乙酰氨基葡萄糖连接在五糖核心区，此类n 糖链叫做杂合型。 o 一连接的糖链：与n 连接的糖链k 侣l t , ，对。一连接糖链的研究缺乏系统 性，同时。一连接糖链存在着多种形式，已发现的有g a l n a c s e r t h r ， g l e n a c - s e r t h r ，g a l s e r ，x y l s e r ，a r a - s e r t h r ，m a n s e r t h r 以及g a l h y l ， a r a - h y p 和f u e - s e r 等。这些糖链结构的共同点是有一种或少数几种单糖与某 些含羟基氨基酸连接，不存在共同的核心结构区脚l 。 由于糖蛋白上寡糖链的含量特别少，所以不能用常规的检测方法来进行， 必须为其建立专用的分析体系。 1 ) 糖链的释放、分离和纯化 对糖蛋白寡糖链进行化学分析，首先须通过蛋白酶对糖蛋白进行充分酶 解，所选择的酶可以是专一性很强的，也可以是无专一性而酶解能力很强的， 也可以依次使用几种蛋白酶。分离得到比较小的糖蛋白片段或糖肽，接着就 是从其上切下糖链。有酶法和化学法。酶法：e l 前对n 一连接的糖肽，有多 种酶，常用的有p n g 酶f ；而对0 一连接的糖肽，只有一种酶，为内切d 一1 4 - 乙酰氨基半乳糖酶( 即o - 聚糖酶) 。化学法：释放n 一连接糖链最有效的方法 是肼解法，至今已有不少改进。o 连接糖链的释放，通常是在0 0 5 1 摩尔 升的氢氧化钠溶液中，通过b 消除反应完成，温度4 4 5 0 c 。反应时间从几 小时到几天不等，为防止碱性条件下糖链从还原端依次降解，需加入1 摩尔 升硼氢化钠溶液，将其还原成相对稳定的糖醇。然后还要完成糖链的分离纯 化。将糖链与蛋白质部分分离，一般采用层析法。由于s e p h a d e x 是一种葡聚 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 ! = 墼墨董盟鱼堕丝蕉墨自塞塑箜盟些堂坌堑 苎! ! 戛基塑里 糖凝胶，有可能对样品造成污染，近来用聚丙烯酰氨凝胶( 例如b i o - g e l p 4 ) 较多【4 ”，然后再经d e a e s e p h a d e xa 5 0 或d o w e x1 层析柱分离酸性和中性糖 链1 4 2 1 。 2 ) 糖链结构的仪器分析 高效液相色谱法分析糖类化合物一般在常温下进行，经色谱组分离的组 分可以收集，进一步与质谱、红外光谱、核磁共振等仪器联用进行分析鉴定 4 5 ，4 6 1 。糖类化合物的传统检测方法采用柱后衍生和可见光检测器检测，近年来 常用灵敏度较低的示差折光检测器测定，样品无需衍生化。为了提高分析灵 敏度，可采用衍生化的方法将样品组分制备成具有紫外吸收或能发出荧光的 衍生物，用紫外检测器、二极管阵列检测器或荧光检测器，虽然样品制备操 作复杂，但分析灵敏度可大大提高。另有报道使用价格低廉的硅胶柱和十八 烷基键合固定相分离糖，效果较好，前者流动相须加氨类调节剂，后者用水 作流动相。 衍生物的制备 4 3 , 4 4 1 ：糖的紫外、荧光标记衍生物：h p l c 测定糖类化合物 时，糖本身在紫外区无吸收，多采用示差折光检测器检测，但示差折光检测 器检测灵敏度低且不能用于梯度洗脱。通过衍生使糖类化合物变成具有紫外 吸收和荧光物质，是提高糖类h p l c 检测灵敏度的主要手段。 常用的糖类紫外衍生化试剂【5 0 1 有：2 ，4 一二硝基苯，对甲氧氨基苯胺，6 一氨基喹啉等；常用的糖类荧光衍生化试剂有：8 一氨基萘一l ，3 ，6 一三磺 酸，7 一氨基一1 ，3 一萘磺酸等。 毛细管电泳( c e ) 【4 7 】：毛细管电泳是对传统电泳技术的一场革命，它作 为一个快速、高效、高灵敏度和高分辨率的分离和分析手段，在生命科学领 域中备受科学家的青睐。寡糖组成分析：通过酶解或化学方法水解从糖蛋白 上释放出来的糖分子，使成单糖，经c e 分离分析，使用已知的单糖作内标， 即可测定寡糖的单糖组成及各组分的含量。虽然m s 和n m r 的在线检测及各 种方法交替使用可以给出寡糖结构，但这不仅昂贵，而且所需样品量大，非 常不方便。而仅从c e 的出峰时间就能辨别出寡糖结构，使c e 发展成为对经 常出现的寡糖进行分析的常规方法。目前利用已知结构的寡糖所作的c e 维 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 ! = 复茎塑箜鱼堕垦蕉垄皂墨蕉壁塑些堂坌堑 蔓! ! 夏基塑戛 寡糖数据库，能仅根据寡糖的c e 迁移时间就确定寡糖的结构，c e 二维数据 库【4 8 1 则是使用了两种不同的c e 分离分析方法的迁移时间对寡糖进行结构确 定。由于c e 重现性好，对数据库中出现的寡糖有应用价值。 3 ) 糖链结构的酶学分析 糖苷酶是研究糖链结构的一种及其出色的工具，由于它的作用特点和底 物专一性，它能够通过顺序降解，阐明糖链的一级结构；确定每个组成单糖 的异头构型；从糖复合物上切得完整的糖链。 外切糖苷酶是切下非还原端的一个单糖，对于n 糖链中常见的糖基，几 乎都有相应的外切糖苷酶可供选择应用，但在研究时，必须充分了解该糖苷 酶对底物专一性的要求，特别是对糖苷配基一侧的专一性要求，即使是同一 种糖苷酶，来源不同，它们对底物糖苷键的取代位置也有不同的专一性要求。 应用于糖链结构研究的内切糖苷酶【4 9 1 没有外切糖苷酶那样种类多和成 熟，按其作用可分为两类，一类是酶切单糖一氨基酸或单糖一肽连接键，释 放出完整糖链。另一类是酶切糖一糖之间的连接键，释放出部分糖链片段。 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 4 一氨基糖的合成及糖蛋白寡糖链的化学分析 第1 7 页共4 3 页 第二章4 脱氧4 氨基d 葡萄糖的合成 第一节引言( i n t r o d u c t i o n ) 3 一氨基糖和6 一氨基糖的合成已有报道 2 5 3 6 】。而4 一氨基糖的合成一直 末见文献报道，可能是由于空间位置的关系，c 4 和c 1 容易产生分子内脱水。 本研究室设计了两种方法避免这种情况的产生，一是将c l 位甲基化保护，二 是将c 4 位乙酰化保护，本文主要完成了后一种方法，以d 一半乳糖为原料， 使c 1 位和c 6 位脱水环化，c 2 位以苄基取代，并利用空间位阻，在c 4 位成 功地导入了叠氮基团，并将其还原成为氨基。合成路线如下： 。娶氧。嚆拶舳氅意甄。 o ho a c 、o a c 一。踺喀一 忍掣嘴 ：* 斌。 一m 。蕊。 f i g u r e 2 4 - 氨基4 脱氧d 葡萄糖的合成路线 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 4 一氨基糖的合成及糖蛋白寡糖链的化学分析 第1 8 页共4 3 页 1 c 1 位以五氯酚基团取代 原料为d 半乳糖，j n , k 7 , 酸酐( 严格禁水) ，催化剂为高氯酸，将c 1 、 c 2 、c 3 、c 4 和c 6 位以乙酰基保护。须严格控制温度。 乙酰化后，以红磷为催化剂，在2 0 0 c 左右加入液溴和水。 c l 位溴化完成后，在丙酮溶液中，加入五氯酚钠盐回流。 2 c 1 ，c 6 位脱水环化 氢氧化钾溶液回流，得到产物，但无合适纯化的方法，所以必须将其乙 酰化。在毗啶溶液中，加入乙酸酐，以2 一甲基氨基吡啶为催化剂，c 2 、 c 3 和c 4 位再乙酰化，降低极性以便于上柱纯化。纯化所得物溶于甲醇， 加入甲醇钠。c 2 、c 3 和c 4 位脱乙酰基。 3 c 3 和c 4 位丙叉化 在无水丙酮溶液中，加入对甲苯磺酸，并不断用分子筛脱水。 4 c 2 位由苄基取代 在无水n ，n 二甲基甲酰胺溶液中，以氢化钠为催化剂，加入溴化苄。 须严格禁水。 5 c 3 和c 4 位脱丙叉基 用含2 0 z 氟乙酸的水饱和氯仿溶液常温搅拌 6 c 3 和c 4 位0 硫酸酯化 在无水乙酸乙酯和无水吡啶中，加入二氯亚砜。严格禁水。先得到亚硫 酸盐。把产物溶于乙腈和乙酸乙酯的水溶液中，加入高碘酸钠，以氯化铑 为催化剂，进一步氧化成硫酸盐。 7 c 4 位脱氧且以叠氮基取代 在无水n ，n 二甲基甲酰胺溶液中，加入叠氮钠，高温加热。得到中间 产物，溶于四氢呋喃溶液，加入水和浓硫酸水解。 8 c 4 位还原且乙酰基保护 在甲醇溶液中，加入氢氧化钯为催化剂，通入氢气，吸附完全后，加入 反应物。叠氮基还原完成后，加盐酸和乙酸酐，保护c 4 位氨基。 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 ! 二墨苎董塑鱼堕墨塑曼自塞塑壁些些堂坌堑 墨! ! 夏苎塑夏 9 c 2 位脱苄基 ， 在盐酸和甲醇溶液中，以氢氧化钯为催化剂。 1 0 c 1 、c 6 位开环，并将c l 、c 2 、c 3 和c 6 位乙酰化保护 在浓硫酸中，加入乙酸酐。 1 1 c 1 、c 2 、c 3 和c 6 位脱乙酰基，得到目标产物 在甲醇溶液中，加入甲醇钠。 第二节结果与讨论( r e s u l ta n dd i s c u s s i o n ) a ，在整个合成反应中，凡是涉及互壁焦反应，保证反应体系无水很重要。 b 在! 僮遗塑垡盟，得率不高，主要原因是1 ) 溴化物不够稳定，容易 降解；2 ) 溴化后加水的时间间隔对反应有影响，几次实验，结果都有些不同， 产生的副产物量也不相同；3 ) 这步反应产生的副产物量比较多；4 ) 萃取中 大量产热，容易破坏产物。这步反应中的温度控制是非常关键的，在加反应 物液溴和水的时候，大量产热，一定要作好降温，但是温度低于1 0 0 c 后，又 不利于反应进行。萃取中也会大量产热，所以一定要把反应液先溶于氯仿， 再在冰浴中慢慢加水，混匀时也要慢些，避免大量产热。 。瓯。 。 f i g u r e 3c 2 位加溴 c 进行! 鱼塑g 焦脱壅巫丝时，上一步反应剩余的五氯酚钠盐不易除 去，而其在碱性溶液中又极其易溶解，影响反应p h ，有必要的话，要加大氢 氧化钾溶液的用量，以促进环化。而且这步反应时间很关键，必须不断作t l c 检测看结果，及时中止反应，否则在强碱条件下，产物将被破坏。 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 4 一氨基糖的合成及糖蛋白寡糖链的化学分析 第2 0 页共4 3 页 1 ”厂” g 二 ! 兰! o 谢 兰竺l 斗厶土：7 7 0 8 0 0 c 回滩t f i g u r e 4 c 1 和c 6 位脱水环化 d 垡塑垒焦加匾墨基这步反应是可逆的，所以时间较长，要不断过滤 除去已饱和吸水的分子筛，并加入新鲜的分子筛以达到提高得率的目的。 f i g u r e 5c 3 和c 4 位丙叉化 e 在9 2 焦里! 茔基的时候，本实验作了两种方法的对照，一种是以传统 的氧化银为催化剂，另一种是以氢化钠为催化剂。前一种方法反应时间长， 得率较低，而且反应产生的溴化银属于胶钵，存后续的提纯操作( 萃取) 中 加大了难度、延长了时间；而后一种方法反应时间短，得率高，后续提纯操 作( 萃取) 简便迅速，唯一要严格要求的是确保反应时系统绝对无水。建议 使用后者。 f i g u r e 6 c 2 位苄基取代 f 在兰塑4 垡题西黑基这步反应中，作了两种方法的比较一是用8 0 的醋酸水溶液回流；二是用含2 0 三氟乙酸的水饱和氯仿溶液常温反应。 复旦大学撰写科学报告和学位论文专用纸 ! 二墨茎蕉盟鱼堕垦塑星垒塞蕉壁塑些兰坌堑 蔓! ! 夏苎竺墨 结果是，前者有不少副产物生成，而且后续处理( 减压浓缩) 所需温度较高； 而后者副产物少，后续处理( 先萃取，后减压浓缩) 简便易行，温度也无需 很高。建议采用后者。 詈慧。永饱和氯仿潜壤 f i g u r e 7 c 3 和c 4 去丙叉化 g 三塑垒焦煎酸焦，加二氯亚砜时要严格禁水，而且完成亚硫酸化后 要尽快进行下一步反应，因为亚硫酸物极不稳定。而进行高碘酸钠氧化时对 实验容器的洁净度有极高的要求，否则反应极有可能完全不进行，而且反应 时间要严格控制，不然会产生相当量的副产物。 ( 0 - - 氯亚飘、毗啶、 乙醴乙醇 - - - - - - - - - - - - - - - - 0 ) 高确酸钠、氯化键、 己腈、乙酸乙醇，水 f