（食品科学专业论文）香辛料植物挥发油有效成分测定及其抗菌活性研究.pdf

中目农业大学硕士学位论文 摘要 摘要 本文用水蒸气蒸馏法对“种香辛料植物进行挥发油提取，采用琼脂稀释法进行抗菌活性筛 选，并筛选出肉桂、牛至、百里香、丁香四种抗菌效果好的挥发油并用g c 法测定其有效成分， 并对其单独和复配后抗菌活性进行了研究。本文还确立了刃天青结合微量肉汤稀释法对挥发油测 定最小抑菌浓度( m l c ) 的方法。 结果表明1 4 种香辛科植物中肉桂、牛至、百里香、丁香这四种挥发油抗菌效果好、抗菌谱 宽。对这四种挥发油进行气相测定，丁香油主要成分为丁香酚( 7 6 1 ) ；肉桂油主要成分为肉桂 醛( 8 6 8 ) 牛至油和百里香油均含有百里香酚和香芹酚，牛至油主要成分为百里香酚( 3 7 1 ) ， 香芹酚( 1 5 7 洽。量居第二位。百里香油主要成分也是百里香酚( 3 0 7 ) ，其中还含有少量的香 芹酚( 3 6 ) 。 本文还对抑菌试验方法进行了研究，确立了刃天青结合微量肉汤稀释法对挥发油测定最小抑 菌浓度( m i c ) 的方法，此法便捷准确。采用刃天青结合微量肉汤稀释法抗菌试验结果表明，丁 香酚，肉桂醛、香芹酚、百里香酚对五株食源性病原菌的抗菌活性强，是相应挥发油中主要抗菌 物质，最小抑菌浓度( m i c ) 为5 0 - 1 6 0 0m g 似丁香、肉桂、牛至、百里香挥发油抗菌活性次之， m i c 为2 眦3 2 0 0m g l 。 采用棋盘法进行复配抗菌研究。结果表明：丁香酚、肉桂醛、香芹酚和百里香酚两两复配后 大多表现为相加或无关作用( 7 3 3 ) ，呈协同作用的仅占1 3 3 ，联合抗菌效果不好。因此单 纯通过这些物质间的两两复配不能实现大幅度降低自然抗菌成分添加量的目的。 关键词：精油a b o s ) 。水蒸气蒸馏，抗菌活性，最小抑菌浓度( m i c ) ，联合抗菌试验 中国农业大学硕士学位论文摘要 a b s t r a c t t h i sp a p e rf o c u s e so nt h es t u d yo fa n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo fs p i c e p l a n te s s e n t i a lo i l s ( e o s ) e x t r a c t e df r o md i s t i l l a t i o n , t h et e s to fa n t i m i c r o b i a la c t i v i t yw a sc a r r i e do u tb ya g a rd i l u t i o n , t h er e s u l t s d e m o n s t r a t e dt h a tf o u r t e e ns p i c e p l a n te o sh a v e $ o l n l ：a n t i m i e r o b i a lc a p a c i t y , e s p e c i a l l yf o u rs p i c ep l a n t l i o s , n a m e l yd o v e c i n l l a l l l l o n ，o r e g a n o ，t h y m e h a v et h eb e s te f f e c tw i 血t h ef e a t u r eo fa n t i m i c r o b i a l w i d er a n g ea sw e l l s t r o n ga n t i m i c r o b i a la b i l i t y t h r o u g ht h ew a yo fg ct e s tt h em a j o rc o m p o n e n to f f o u re s s e n t i a lo i l s w ea l s or e s e a t e dt h ec o m b i n a t i o nb e t w e e ne u g e n o l ，c i n n a m a l d e l a y d e , c a z v a c r o l ， t l a y m o l ，s o d i u mb e n z o a t e ，p o t a s s i u ms o r b a t e i nt h i sp a p e rw ea d o p t e dr e s a z u r i l lc o m b i n e dw i t h m i c r o d i l u t i o nb r o t hm e t h o dt ot e s te o s c t h er e s u l t ss h o w st h a tf o u r t e e ns p i c ep l a n te o sh a v es o ma n t i m i e r o b i a lc a p a c i t y , e s p e e i a u yf o u r s p i p l a n te o s , n a m e l yc l o v e , c l i m b , i l i o n , o r e g a n o ，t h y m e ，h a v et h eb e s te f f e c tw i t ht h ef e a t u r eo f a n t i m i e r o b i a lw i d er a n g ea sw e l la ss t r o n ga n t i m i e r o b i a la b i l i t y t h r o u g ht h ew a yo fg ct e s t , m a j o r c o m p o n e n to fc l o v ei se u g e n o l , a c c o u n t i n gf o r7 6 1 m a i o rc o m p o n e n to fc i n n a m o ne s s e n t i a lo i li s e i m l m a l d e h y d e ，a e c o l m t n gf o r8 6 8 ，b o t ho r e g a n oa n dt h y m ee s s e n t i a lo i l sc o n t a i ne a r v a e m l , m a j o r c o m p o n e n to fo r e g a n oe s s e n t i a lo ni s , m a k i n g 叩3 7 1 ，c a r v a e r o la c c o u n t i n gf o r1 5 7 t a k e st h e s e c o n d p l a c e , 3 0 7 o f t h y m ee s s e n t i a l o i l s i s t l a y m o l w i t has m a l la m o u n t o f c a n , a e r o l , m a k i n g u p 3 6 t h er e s a z r i nc o m b i n e dw i t hm i e r o d i l u t i o nb r o t hm e t h o dh a st h ea d v a n t a g eo f c o n v e n i e n t , a n dt h e r e s u l to ft h et e s ti sa l s of a i r l ya c c u r a t e w i t ht l a em e t h o do fm i c r o d i l u t i o nb r o t hm c t h o a , t h er e s u l to ft e s t s h o w e dt h a te u g e n o l , c i n n a m a l d e h y d e ，e a r v a e r o l , t h y m o lh a v et h es t r o n ga n t i m i e r o b i a la b i l i t ya g a i n s t f l y ef o o d b o m ep a t h o g e n s ，t h e ya t h em a j o ra n t i m i e r o b i a ls u b s t a n c eo fe o s , m i ci s5 0 1 6 0 0m l a n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e so f c l o v e 。c j l l o a l n o l l ，o r e g a n o ，t h y m ef o l l o wi t , m c 缸2 0 0 - 3 2 0 0m g l a n t i m i c r o b i a lt e s ta d o p t i n gt h ee l a e c k e r b o a r dm e t h o dv e r i f i e dt h a ts i m p l yc o m b i n a t i o nb e t w e e n e u g e n o l ，e i l m a m a l d e l a y d e ，e a r v a e r o l ，t l a y m o lc o u l dn o ta c h i e r et h eg o a lo fs u b s t a n t i a l l yr e d u c i n gt h e a m o u n to fn a t u r a la n t i m i c r o b i a lc o m p o n e n ta n dc h e m i c a lp r e s e r v a t i v e s k e yw o r d s ：e s s e n t i a lo i l s s ) ，s t e a md i s t i l l a t i o n , a n t i m i c r o b i a la c t i v i t y , m i c , a n t i m i e r o b i a lt e s ti n c o m b i n a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 杏象 时间：洲年f 月日 ， 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：毒录如 翩鹳2 私豫 ，h 而l 一一- 时间：p 年，月幻日 时间：2 口自年，月习日 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 1 1 概述 第一章绪论 长期以来，病原微生物一直严重影响着人类的身体健康和生活质量。每年，全世界农副产品、 水产品、果蔬等约有1 0 - 2 0 的食物损失于各种腐败变质，这些腐败的原因包括微生物、物理、 化学、酶等因素。其中，由微生物作用而导致食品质量下降或失去食用价值的腐烂变质的现象最 为严重，造成的经济损失十分巨大。发生腐败变质的食品不仅丧失了营养价值，严重的还会造成 食物中毒。 2 0 世纪年代以来，由于疯牛病及口蹄疫疾病的出现、禽流感的爆发，以及食品中病源微 生物的污染、食品原料的化学污染、基因工程技术的应用，同时，随着科学技术水平不断提高， 临床毒理、毒性及风险评估研究的不断强化，食品安全问题越来越突出，受到全世界的共同关注， 成为一个重要的公共健康问题。食品安全问题主要集中在以下几个方面：微生物性危害、化学性 危害、食品掺假以及基因工程食品的安全性问题。这些食品安全性问题通常表现为食源性疾患， 其中由病源微生物造成的食物中毒、肠道传染病、人畜共患传染病等时有发生。 因此，人们一直在努力寻求理想的抗菌防腐剂。在食品工业中，为了减少或消除食源病原体， 确保食品的质量，延长食品货架期，人们采用各种手段，使食品中微生物丧失活性或延缓、阻止 其生长，添加防腐剂是现代食品工业中不可缺少的方法。食品防腐剂一般可分为合成防腐剂和天 然防腐剂目前常用的是合成防腐剂，主要有山梨酸、苯甲酸、丙酸、对羟基苯甲酸等及其它们 的盐与酯。经长期的研究发现，一些合成防腐剂对人体细胞有不同程度的损害作用，甚至还有诱 癌性、致畸性和易引起食物中毒等问题，因此要对其进行限量使用【”。随着绿色食品、绿色消费 的出现，消费者希望，尽量减少合成食品防腐剂的使用，降低其对人们健康的危害。 在食品加工过程中，由于减少了合成食品防腐剂的加入量，为了确保食品的安全，这就需要 添加低毒的天然防腐剂。天然防腐剂具有毒性小、安全性好、抗菌性强、作用范围广等优点，因 此，近年来，天然防腐剂的研究和开发利用成了食品科学研究和应用的一个熟点。天然抗菌物质 主要来源于植物、动物、微生物及矿物。其中植物源抗菌物质最丰富，它也一直是人们研究的热 点之一 在众多具有抗菌作用的植物中，香辛料植物的抗菌性很早就得到了人们的认识。我国劳动人 民早已认识到香辛植物的防腐功能。明代著名医学家李时珍在其巨著本草纲目中对香辛料植 物用于食物防腐，对人体无毒副作用有过相关记载。在生产实践中，人们将紫苏叶洗净晾干后， 放入装有酱油的容器中，可增加酱油的醇香味，同时能起到很好的防腐效果。闽西农民腌菜时， 使用当地一种香味草来进行食物的防腐，沿海渔民也用其保鲜腌咸鱼。美国人h o f f i m a n 将芥菜籽 添加于苹果汁中，可防腐保存四个月。香港白瑞贤用植物配伍的防腐剂，用于一种药水的防腐， 在气温高达3 0 的炎夏，放了半个月。却无变质，确有防腐效果。并将放有二个多月的含植物防 腐剂的杀虫水，拿去香港标准及检定中心o i a j ( s 喇行测试( 化验期间气温达3 0 1 2 以上) 证明 药水无毒副作用闭 1 中国农业大学硕卜学位论文 第一章绪论 香辛植物的防腐抑菌效果激起了人们对其中抗菌活性成分的研究，其中许多文献中指出，其 主要的抗菌成分是香辛料植物挥发油，因此，本课题针对香辛料植物挥发油的抗菌活性展开了研 究 1 2 香辛料植物挥发油( e o s ) 的开发利用现状 我国幅员辽阔，地处热带、亚热带及温带，自然条件优越，适合许多香辛植物的生长，据不 完全统计，我国共有挥发油植物八百多种，包括菊科植物、芸香科植物、伞形科植物、姜科植物、 唇形科植物、樟科植物、木兰科植物、桃金娘科植物、马兜铃科植物、马鞭草科植物、禾本科植 物等。 1 2 1 香辛植物挥发油的定义 据美国香辛料协会( a m e r i c a ns p i c e a s s o c i a t i o n ) 定义，凡是主要用来做食品调味用的植物， 均可称为食用香辛植物。食用香辛植物中的挥发油又称精油( f s n t i a lo t i s ) ，以下简称e o s ，是 香辛植物中具有挥发性和芳香气味、一般可随水蒸气蒸馏出来的非水溶性油状液体的总称。挥发 油( e o s ) 又称精油或者轻油。是一种芳香油性液体，从植物原料( 花，芽，种子，叶子，嫩枝， 树皮，草药，树木，水果和根) 中获得，且受植物品种，地理位置、栽培环境、采集时问的影响 i 2 2e 0 s 的性质、特点及化学组成 精油大多为无色或微显淡黄色的透明液体，具有特殊的气味，有辛辣灼烧的感觉，呈中性或 酸性反应，其比重一般在0 8 5 1 0 6 5 之间，比旋度在十9 7 0 1 1 7 0 范围内，折光率在1 4 3 1 6 1 之间，沸点在7 0 3 0 0 c 之间。在常温下常为液体，有的在冷却时其主要成分可能结晶析出，习 称“脑”，如薄荷脑、樟脑等。e o s 不溶于水而易溶于各种有机溶剂，当与空气及光线经常接触 会逐渐氧化变质，使e o s 的比重增加，颜色变深，失去原有香味，并能形成树脂样物质。因此， 制各e o s 方法的选择是很重要的。产品也要装入棕色瓶内密塞并低温保存。 e o s 有效成分含量高，杂质少，稳定性好，能克服芳香植物原料普通提取液及其粉末产品易 污染的缺点，又便于贮运和使用，其安全性也已经被人们多年来的经验所证实。 e o s 的化学组成极为复杂，大多由几十种甚至几百种化合物组成，大体上可分为萜类化合物、 芳香族化合物、脂肪族化合物、含氮含硫类化合物四大类p j 。 1 萜类化合物萜类化合物是绝大多数e o s 的主要组成化合物，这类物质具有特定的化学 结构，最小的单萜具有1 0 个碳原子骨架，倍半萜的碳原子数为1 5 ，二萜、三萜的碳原子数分别 为2 0 、3 0 。其中单萜类是e o s 中的特征香气成分，如月桂烯、柠檬烯、a 、b 一蒎烯、柠檬醛、 香草醛、薄荷酵、香叶醇等。 萜烯及其含氧衍生物的存在是植物的茎、叶、花、果等发香的主要原因，而且萜类含氧衍生 物的存在又往往是e o s 具有某些生物活性的物质基础。 2 芳香族化合物在e o s 中芳香族化合物的含量也相当高，仅次于萜类化合物，这类化合 2 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 物的特点是带有芳香环基团。常见的有肉桂醛、丁香酚、百里香酚等 3 脂肪族化合物除了萜类化合物和芳香族化合物外，脂肪族化合物在e o s 中含量也不少， 按其具有的功能团可分为醇、醛、酮、酸、酯等，但这类化合物一般不作为香料使用。 4 含氮含硫类化合物该类化合物的分子中含有氮、硫元素，如橙花中的邻氨基苯甲酸酯 ( m a ) 、姜油中的甲硫醚、大蒜油中的烯丙基硫醚等。 1 2 3e o s 的提取、分离与测定 早在三四千年前就有人开始利用蒸馏方法提取e o s ，到十六世纪，蒸馏技术己趋于完善。目 前，e o s 的提取方法主要有：水蒸气蒸馏法、溶剂浸提法、压榨法、吸附法、冷冻法、超临界流体 萃取法等。在实际研究中，要根据原材料的特点、所需e o s 的质量及经济上的合理性等因素而选 择合适的提取方法。目前最为常用的还是水蒸气蒸馏法 可用于e o s 分离提纯的方法主要有：冷冻处理、化学分离法、分馏法、层析法和分子蒸馏法 等。其中，化学分离法和层析法的应用相对比较普遍，而分子蒸馏法( m o l e c u l a rd i s t i l l a t i o n ) 是一 种新型的液液分离技术，它特别适合对高沸点、热敏性物质进行有效无损分离，尤其是那些香 味、有效成分的活性等对温度极为敏感的天然产物的分离。 目前，植物e o s 的化学组成的定性与定量测定研究中最适合的方法是采用气相色谱，质谱一计 算机联用技术 1 2 4e o s 的应用 1 香精香料方面人类使用e o s 作为香料的历史源远流长。早在公元前1 3 5 0 年，古埃及人 沫浴时就使用香膏油；到公元1 0 世纪，阿拉伯人开始采用蒸馏法从玫瑰中提取玫瑰油，并制成 玫瑰水；公元1 3 7 0 年匈牙利第一个将植物e o s 溶于乙醇制成了香水；1 4 2 0 年，由于蒸馏工艺的 改进，植物e o s 的提取发展迅速，出现了大批液体香料，包括肉桂油、丁香油、迷迭香油、薰衣 草油等。 我国香料植物资源十分丰富，其e o s 可应用到食品调味剂或矫味剂，应用的特点是添加量少 但用途广其作为香精香料已成为日用食品、烟酒、牙膏、肥皂、化妆品、化学工业等的重要原 料；在这些产品中，香精油的含量仅在0 2 2 ，只需添加少量的香精油就能生产出大量的 加香产品，如1 】【g 香精油能用于生产6 7 k g 牙膏、1 0 0 k g 香皂、2 0 0 k g 糖果、5 0 0 k g 洗衣粉、1 5 0 0 瓶汽水、2 0 0 0 0 包香烟 3 1 。 2 医药方面在距今五千多年前的黄帝神农时代，人们采集树皮草根来驱疫避秽，这是利 用植物挥发的香气来杀虫治病。对植物e o s 的提取和应用早在本草纲目中就有所记载，其具 有的生物活性有：祛痰、止咳、平喘、驱风、健胃、消炎、杀菌防腐、解热、镇痛等作用 目前，在临床已有多种e o s 被用来治疗各种疾病，如用柴胡挥发油制备的注射液可用于退热； 丁香油用于局部麻醉止痛；土荆芥油用于驱虫；薄荷油用于清凉、祛风、消炎、局麻等从e o s 中提取出来的天然化合物也有多种用于临床。如丁香酚，百里香酚、薄荷脑、樟脑、胡椒酮、牛 儿酮癸酞乙醛等 3 - 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 3 国内外e 0 s 抗菌活性研究现状 1 3 1 抗菌作用的研究 e o s 由于其独特化学组成、化学结构和生物学活性，近年来在抗菌研究方面备受关注。经研 究，许多e o s 有明显的抗菌活性，近几年来，国内外出现了大量有关e o s 抗菌作用的报导。 1 抗真菌作用 1 9 5 2 年开始就有了有关e o s 抗菌作用的报道。日本有学者研究了丁香挥发油对五种皮肤真 菌( 星毛状毛发白癣菌、趾间自癣菌、猩红色白癣菌、石膏样黄癣菌及舒氏黄癣菌) 的抗菌作用 进行了研究，其最小抑制浓度在1 1 6 0 0 0 - 1 4 0 0 0 之间 4 1 。 2 0 0 1 年，吴传茂等人研究发现：丁香油对黑曲霉、青霉等食品常见污染菌有较强的广谱抑菌 作用，并且在1 0 0 c 时表现出很好的热稳定性嘲。 我国广东省香辛料研究所研究了广藿香精油对植物病原真菌的抑菌活性，其抑菌浓度在0 0 3 o 2 7 ( m v ) ，其对檀香多毛孢、番茄早疫病菌、核盘菌，在浓度为0 1 时，即可达到 完全抑制。 2 0 0 4 年，谭龙飞对市售五香粉和咖喱粉的挥发油进行提取，并测定了这两种e o s 抗真菌活 性结果表明它们对霉菌具有很强的抑制作用，其中五香粉挥发油的抑菌能力较强，而且不需添 加到食品中去，只在表面就能起到较好的防霉作用，具有使食品防腐保鲜的实际应用潜力州。 国外有学者同时对多种香辛料e o s 的抗真菌性进行了研究。美国学者m a m z z e n a 和h c n 磷取 了1 种香辛料植物e o s 进行了抗真菌性研究，研究表明这1 0 0 种香辛料植物e ( ) s 中有8 4 种挥发油 对1 0 g 供试真菌表现出了抗性，并8 0 具有杀真菌作用。还研究了九十二种e o s 的抗真菌活性， 其中抗供试真菌种类最多和抗真菌活性较强的前五种e o s 依次是牛至油、百里香油、胡妥油、黄 樟油、肉桂油 7 , 9 1 2 抗细菌作用 二十世纪9 眸代以来，很多学者都投入到f o s 在食品腐败菌及食源性致病菌方面的研究。2 0 0 2 年，美国学者选用四种食源性致病菌( 空肠弧菌，大肠杆菌，李斯特菌，沙门氏菌) ，对9 6 种挥 发油和2 3 种挥发油成分进行了抗菌活性的研究。其中肉桂油、丁香油、月桂油、牛至油、百里香 油及多香果油除对空肠弧菌表现出的抗苗效果一般外，对其它三种食源性致病菌均表现出了很好 的抗菌活性，其半数杀菌浓度( b a 5 0 ) 为4 5 1 4 0m g l 9 1 1 9 9 8 年，余伯良等比较了几种e o s 的抗菌性，抗菌性由强到弱依次为丁香油，大蒜油，辣 椒油，花椒油，生姜油，黑胡椒油。同时他们还比较了e o s 与香辛料粉末的抗菌效力，结果e o s 远大于粉末【1 0 1 国外大量研究表明e o s 的抗菌作用与细菌细胞膜结构有关 1 t , ”1 3 1 其中多数研究结果认为e o s 对革兰氏阳性菌的作用强于革兰氏阴性菌，其中假单胞菌尤其是绿脓杆菌对e o s 极不敏感 1 4 1 。革 兰氏阴性菌具有一层细胞壁外膜，它能阻止一些疏水成分在它表面肽聚糖中扩散，使其表现为对 抗菌物质不敏感。 4 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 然而，嗜水气单包菌翻h y d r o p h i l a ) 是阴性菌，但对e o s 的耐受性就很差i 卅。也有研究将薄 荷油加入希腊开胃食品中，其对阴性菌沙门氏苗( s e n t e r i t 妇) 的抑制强于对阳性菌 ( l m o n o c y t o g e n e s ) i “。还有一些研究表明e o s 对革兰氏阴性菌的抑制时间比革兰氏阳性菌的长， 该抑菌试验在开始的2 4 h 里，e o s 对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用，但到4 8 d , 时后， 革兰氏阳性菌开始生长，但阴性菌仍被抑制u “。 有人选用了5 0 种商业中常用的e o & 对2 5 种常见菌作了抗菌试验，研究发现革兰氏阴性菌和革 兰氏阳性菌对e o s 的耐受程度无太大差异i l 川。2 0 0 0 年有人采用相同的试验方法和试验菌，对另外 几种e o s 做了抗菌试验，其中四种e o s 对革兰氏阳性菌与阴性菌的作用程度相当，两种e o s 对革兰 氏阴性菌有很强的抑菌作用【1 9 1 以上这些试验结果充分表明，e o s 的抗菌活性与其自身的化学组成成分有关，每种化学成分 都具有自身特定的抗菌活性，不同香辛料的e ( ) s 其化学成分不同，就是同种香辛料，其挥发油的 化学组成受其品种、产地、生长的地理气候环境和收获季节的影响也有所不同，因此，在这些抗 菌资料中，e o s 会表现出对革兰氏阳性菌和阴性菌不同程度的抗菌作用。 基于以上抗菌防腐作用方面的研究，使e o s 在食品工业中得到了重视，其所具有的抗病原真 菌、污染霉菌和抗细菌活性将有助于人们找到更加理想的天然食品抗菌剂。 1 3 2 抗菌试验方法 抗菌试验( b a e t e r i o s t a t i c t e s t ) 用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长的效力。目前，没有标准 的试验方法来评价与食品微生物相关的防腐剂的抗菌活性，一些研究者将用于测定抗生素的抗菌 敏感性的试验方法( n c c l s ) 2 0 i 进行修改后测定e ( ) s 抗菌活性 目前，用于测定食品防腐剂抗菌活性试验方法大体上分为扩散法和稀释法，扩散法又分为滤 纸片法和牛津杯法，其中滤纸片法较为常用，但其生成的抑菌圈亦呈椭圆状，对其直径的测量偏 差大，结果重复性差1 2 l l ；稀释法又分为琼脂稀释法和肉汤稀释法，其中琼脂稀释法可同时测定多 种菌株，常用于抗菌物质的筛选试验；肉汤稀释法又分为常量稀释法和微量稀释法，其用于判断 结果的方法有分光光度计法、菌落计数法、电导率法、肉眼观测及利用颜色指示剂显色法。其中 分光光度计法操作简便，但它反映的是总菌液浓度，而不能反映其活菌浓度；菌落计数法劳动强 度大；电导率法须做标准曲线，且反应试剂盒一次性使用，价格较贵，现在已经很少使用；肉眼 观测法只能用于常量法测定，微量法时结果不易观测。利用颜色指示剂法结合9 6 孔细胞培养板的 微量稀释法在近几年开始得到应用，其中常用的颜色指示剂有刃天青和氯化三苯基四氮唑等 2 3 】。 最小抑菌浓度( m i c ：m i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ) 是指能抑制细菌生长的最低浓度，常 被用来比较不同e o s 的抗菌性能，是判断e o s 抗菌活性的最重要测定指标之一。 在建立具体抗菌试验方法时，还会涉及其它的因素，如使用的乳化剂、培养基的种类，测试 菌的浓度，接种的体积，培养的时间和温度等 2 4 1 1 3 3 抗菌机理 按照防腐剂抗微生物的主要作用性质，其抗菌作用包括抑菌作用和杀菌作用。抑菌作用是指 - 5 - 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 抑制或防止微生物生长繁殖，如将其转种在适宜的培养基中，该菌还能继续生长繁殖；杀菌作用 是指杀灭微生物。杀菌或抑菌并没有绝对界限，许多抗菌药物在低浓度时只有抑菌作用，浓度增 大或作用时间加长时，可呈现杀菌作用。而且，由于微生物性质的不同，同一防腐剂对这种微生 物有杀菌作用，而对另一种微生物则表现为抑菌作用。 一般研究认为，食品防腐剂对微生物的抑制作用是通过影响细胞亚结构而实现的，这些亚结 构包括细胞壁、细胞膜，与代谢有关的酶、蛋白质合成系统及遗传物质。由于每个亚结构对菌体 而言都是必需的，因此食品防腐剂主要作用于其中的一个亚结构便能达到杀菌或抑菌的目的 2 - 5 。 目前，对e o s 的抗菌作用机理并没有系统的研究，只是参照食品防腐剂作用机理的基础上， 有了初步的探索。对相关资料进行总结，将食品防腐剂的作用机理归纳为以下三个方面： 1 作用于细胞壁和细胞膜系统生物膜系统是微生物进行能量转化、物质代谢等生命活动 的主要场所。细菌的细胞膜结构是由两层磷脂分子组成，在磷脂双分子层中，其亲水端朝向膜内 外两表面层，疏水端均朝向膜中央。e o s 的一个非常重要的性质就是它的活性成分具有较强的表 面活性和脂溶性，能迅速穿入细胞膜，使其物理结构发生变形，引起膜的扩张和不稳定，增加膜 的流动性和被动透过性。有人对加入e o s 后细胞内外的钾离子浓度进行了测定，结果是胞内钾离 子浓度降低，胞外成比例增加的总数保持不变，这充分表明了该细胞膜的选择透过性受到破坏吲。 当细胞膜被破坏后，细胞中的离子和其它内溶物会渗出，当渗出的物质和数量不足以危及细胞生 命时，细胞还可勉强保持活性，但超过一定量时，将导致细胞死亡1 2 7 , 2 s l 。 2 作用于呼吸氧化过程可通过抑制微生物的呼吸作用，导致能量物质t a p 和还原物质 n a d h 亏 缺，所有合成代谢受阻，活性的动态膜结构不能维持，代谢方向趋于水解，最后产生细 胞自溶。有人对枯草芽孢杆菌在加入e o s 后的代谢过程进行了研究，通过对胞内和胞外册的测 定，结果是胞内a t p 大幅降低，胞外舢哺所增加，但是胞内外舡p 总值下降了，由此表明，枯草 芽孢杆菌在e o s 作用下，其细胞膜通透性增加的同时，细胞内线粒体的呼吸氧化过程受阻，使合 成a t p 速率降低，减少了细胞的能量供应，影响了细胞的正常生长。大量的实验表明，e o s 的抗 菌谱与抗菌效力与其作用的呼吸途径有关。 3 作用于酶或功能蛋白细胞膜的磷脂双分子层中还结合或镶嵌一些蛋白质，即膜蛋白， 这些膜蛋白包括了一些酶类，这些酶类依附于细胞膜上，细胞结构的完整性直接影响着它们的生 理功能活性。当e o s 成分进入磷脂双分子层内，可改变膜的形状，并与膜蛋白上的疏水部分发生 作用，使蛋白质变性或凝结，破坏其生理功能。在e o s 作用下，细胞膜系统受损，胞内溶解酶溶 出并被激活，可导致细胞自溶i 冽。 以上这些作用并不是完全独立进行的，它们中的一些作用结果可能是其它一些作用的前提。 1 3 4 抗菌有效成分 e o s 成分的化学结构对其抗菌方式及抗菌话性有很大影响，而e o s 的化学组成又极为复杂， 大多由几十种甚至几百种化合物组成，这就不能将其抑菌作用归为某一种物质的作用，它可能是 各物质作用于细胞中的多个作用位点。 目前研究表明，e o s 中的酚类、醛类、醇类、酮类、醚类及烃类物质对食源性病原菌具有较 强的抑制作用。1 9 8 7 匀z ，p a u l i 等报道丁香酚、肉桂醛、香芹酚、丁香酚、百里香酚等香辛料植物 6 中国农业大学硕士学位论文 第章绪论 e o s 组成成分对一些引起食物污染的霉菌具有较好的抗性p 0 1 通过比较，香芹酚的抗菌活性明显 强于薄荷醇，这与香芹酚中含有苯环直接相关；在酚类物质中，其抗菌活性还受氢氧根在苯环上 所处位置的影响【”。对不含苯环的e o s 成分而言，烷基的结构也影响其活性，如烯烃 烷烃。所 有这些物质通常被认为是打乱了原生质膜的结构、破坏了质子运动电子流、传递运动，造成细胞 内溶物的凝结，从而表现出较强的抗菌作用 1 丁香酚丁香酚是丁香油的主要成分，它可降解细胞壁，凝结蛋白质，抑制淀粉酶和蛋 白酶的产生及活性p 1 矧。有学者研究了丁香挥发油对五种皮肤真菌有抗菌作用，而且证明了丁香 挥发油的抗真菌主要有效成分为丁香酚。 2 香芹酚香芹酚是牛至和百里香油的主要成分之一，能增强细胞膜的透过性，释放脂多 糖和a r p 。香芹酚可与枯草芽孢杆菌细胞膜相互作用，使细胞膜的流动性增大、被动透过性增强 以香芹酚为主要成分的牛至油可引起金黄色葡萄球菌( s t a p h a u r e u s ) 和绿脓杆菌( 卫a e r u g i n o s a ) 细胞中磷酸盐离子泄漏d 3 1 ，还会引起枯草芽孢杆菌细胞中钾离子泄漏、a t p 减少、细胞生长受到 抑制。 3 百里香酚 百里香酚是牛至和百里香油的另一种主要成分，其结构与香芹酚非常相似， 在苯环的不同位置上有好多羟基。有研究表明，百里香酚分子在低p h 时不电离，具有强疏水性， 依靠氢结合限制膜蛋白，对膜通透特性的破坏力加大瞄】。 4 肉桂醛 肉桂醛是肉桂油的主要成分，其对大肠杆菌0 1 5 7 有明显的抑制作用，但它不能 分解大肠杆菌外膜，也不能减少细胞内a t p 的产生有人对它抗菌的作用机理进行了研究，肉桂 醛中的羰基可凝结蛋白，破坏三羧酸循环例。 5 香芹酮 有试验表明香芹酮( 2 - 甲基- 5 - ( 1 m e t h y l e t h e n y l 心环己烯- 1 酮) 可消除细胞膜内 外的p h 梯度和膜电压，扰乱细胞能量代谢状态，使大肠杆菌、唾液链球菌、乳杆菌的生长受到 抑制叨，另一项研究发现，香芹酮对大肠杆菌和沙门氏菌的细胞外膜没有作用，也不影响胞内 a t p 的合成州。 1 3 5 抗菌物质问相互作用的研究 药物联合抗菌作用大致分为4 种类型：协同作用，相加作用，无关作用和拮抗作用。 e o s 的抗菌活性与组成成分、各成分间的比例关系及化学结构相关。有研究表明：e o s 的抗 菌活性高于其几种主要成分按比例混合的抗菌活性。这也就是说，e o s 中的微量成分物质对其活 性是十分关键的，它起到了协同增效作用闭 香芹酚和百里香酚结构十分相似，它们在抗菌试验中，表现出相加作用 3 3 1 对异丙基苯甲烷( p - c y m e n e ) 是香芹酚的生物前体，单独使用时抗菌作用很弱，但它比香芹酚 更容易透过细胞膜进入细胞，这两种物质联合使用时可促进香芹酚对细胞膜的破坏，使抗菌性更 好，表现为协同作用吲。 肉挂醛和丁香酚有协同作用，单独使用浓度分别为2 5 0 u g n a 和5 0 0 u g n d 的肉桂醛和丁香酚时， 不能对葡萄球菌、微球菌、芽孢杆菌、肠杆菌的生长起到抑制作用；而在同样浓度下混合后可 - 7 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 在3 0 天内抑制这四株菌生长这也可以解释斯里兰卡肉桂抗菌效果好的原因，因为它同时含有肉 桂醛和丁香酚，这两种成分起到协同增效作用。肉桂醛与香兰素也有协同增效作用，两者混合使 用时其用量大为减少，这就避免了单独使用时由于量大引起的食品褐变和对食品风味的损害嘲 1 3 6e o s 在食品体系中抗菌试验 二十世纪9 0 年代以前，虽然市场上出现了含e o s 的食品防腐剂，但是将e o s 与食品体系相结 合的抗菌活性研究的报道很少。近十多年来，陆续出现了大量相关的文献报道，人们做了很多关 于e o s 在食品体系中的抗苗作用试验，这些食品体系涵盖了肉、鱼，奶、蔬菜、粮食、水果以及 食品模型等方面。 其中e o r 瘫e 肉制品中表现出很好的抑菌效果，有研究表明，丁香油和百里香油在浓度为5 - 2 0 m g l 时可使肉制品中常见腐败菌的数量大量减少，具有很好抑菌效果 4 e l 。还有人研究认为芫荽叶 精油在火腿中对乳杆菌有很好的抗菌活性，研究中还发现当肉制品中脂肪含量高时，e o 的抑菌作 用降低州。 在鱼制品中，有人对比了0 5 眺牛至精油在鲳鱼和大马哈鱼两种鱼肉片中的抗菌作用，结 果表明在鳕鱼中对磷发光杆菌的抑菌效果更好，这是由于两种鱼肉含脂肪量不同，大马哈鱼脂肪 含量较高，这一结论同肉制品中结果相一致 4 1 1 。 在蔬菜制品中，0 1 1 0p 垤e o s 水溶液清洗蔬菜，可有效抑制蔬菜中有害腐败菌的生长1 4 2 。 香芹酚和肉桂醛在浓度为0 1 5 地时浸泡猕猴桃可有效减少自带菌数1 4 3 。用肉桂醛和百里香酚熏 蒸紫花苜蓿，可有效抑制其中沙门氏菌的生长 4 4 1 。薄荷油在水果沙拉中，浓度为5 - 2 0 地时可抑 制沙门氏菌生长i l q 。 在粮食制品中，李春红等测定了肉桂醛对分离出的六株霉菌的抗菌活性，将含有肉桂醛的滤 纸放在接菌月饼上，包装储藏，常温下，加天后霉变，对照组2 天后霉变嗍。 e o s 在食品体系中要取得与体外相同的抑菌效果需要更高的浓度，在半脱脂奶中e o s 浓度大 约为体外的两倍，猪肉肠中为1 0 倍，汤中为5 0 倍，软酪中为2 5 1 0 0 倍m 哪。 以上可以看出，食品的种类及其化学组成对e o s 的抗菌能力有很大影响，食品原料中的脂肪、 蛋白质、水分含量和一些添加剂都会影响e o s 的抗菌能力。其中。脂肪和蛋白质在达到一定含量 后可保护细菌，使其减少所受e o s 的作用。有人做了薄荷油在几种沙拉中的抗菌试验，结果是薄 荷油在高脂肪含量沙拉中抗菌性弱1 1 6 j 。还有人做了百里香油和丁香油在不同脂肪含量的热狗中对 李斯特的抗菌试验，结果表明：随着脂肪含量的增加，抗菌效果变差，当达到1 后，继续升高 脂肪浓度，李斯特菌减少不再显著。蛋白质含量也是一个影响因素，它可以与e o s 中的酚类物质 发生反应，如在蛋白质含量较高的低脂干酪中，丁香油对沙门氏菌的抑制作用明显降低了刚；对 牛奶的研究中也发现，e o s 的抗菌活性受蛋白质含量的影响，蛋白含量越高，抗菌活性越差唧l 。 高的水分含量和盐含量可增j 髓o s 的抑菌作用，而碳水化合物就不能保护细菌，从而对e o s 的抑 菌作用没有明显影响p 捌。 食品的物理结构也会限制e o s 的抗菌作用，如食品中胶体空间结构可限制e o s 的扩散，有人 作了牛至油鼠伤寒沙门氏菌在肉汤和肉冻中抑菌作用的对比试验，结果表明肉冻中的抑菌效果明 显下降 5 4 1 在对液体食品的研究表明，其乳化程度影响着其中细菌的生长形式，当乳滴很大时， 8 中国农业大学硕t 学位论文 第一章绪论 细菌呈膜式生长；乳滴很小时呈单细胞分散状生长；只有当乳滴中等大小时，细菌以小菌落形式 生长。而细菌的生长形式也影响着它对e o s 的敏感程度，当细菌以菌落形式生长时，内部细胞在 外部细胞的保护下，减少了与加入液体食品中e o s 的接触机会，这些细菌将会继续存活，e o s 的 抑菌活性就会降低。 虽然这些研究表明食品的组成成分确实对微生物对e o s 的抵抗能力有所影响，也对其抗菌作 用有所解释，但是对其作用机理并没有系统的研究。 1 3 7e 0 s 结合食品保藏方法抗菌作用研究 目前用于食品保藏的方法有食品腌渍和烟熏保藏、冷冻保藏、化学保藏、罐藏、干藏、辐射 保藏等。而将e o s 的抗菌作用与这些食品保藏方法间相结合的研究刚刚起步。 我国用食盐腌制食品的历史悠久，食盐的主要成分是n a a ，加入食品后可渗入食品组织内， 降低水分活度，提高渗透压，有选择地控制腐败菌活动，保持食用品质。当在n a c i 腌渍的食品 中加入e o s ，可大大提高抗菌作用。经研究，n a c i 与薄荷油或丁香油中的丁香酚联合使用时有协 同抗菌作用。经分析认为：丁香酚增加了细胞的渗透性，使n a c i 更易进入细胞，从而抑制胞内 酶的活性 5 3 1 。相反，还有人发现香芹酚和对异丙基苯甲烷函- c y , n e n e ) 在大米中有协同抗苗作用， 但当加入n a c i 后，其作用降低了；酱汁与香芹酚也有协同作用，加入n a c i 后协同作用消失p ，； 还有研究发现，4 的n a c i 对肉桂醛的抗菌( 阳、阴) 活性没有提高 5 6 1 。 食品冷冻保藏也是常见的食品保藏方法，它是利用低温来控制腐败微生物的生长繁殖和酶 活。有人结合了低温处理，研究了e o s 的抗菌作用，在低温时( 8 ) 加入e o s 成分香芹酚处理后 再将温度回升( 3 5 ) ，与3 5 时直接加入相比较，对处于对数生长期的李斯特菌 ( 工m o n o c y t o g e n e s ) 的作用效果明显增强。作者对其作用机理提出假设：在低温时，细胞膜为了 保持一定的功能性，具有很高的不饱和度和很好的流动性，它使香芹酚更易于溶解于磷脂的双分 子层中，增强其抗菌作用1 5 7 1 。 食品化学保藏是通过加入食品化学添加剂来提高食品的耐藏性，随着食品工业的发展，食品 添加剂被大量使用，研究抗菌剂与这些添加剂之间的关系也很重要。乳酸链球菌肽( n i s i n ) 是目 前被允许使用的防腐剂之一，将n i s i n ( o 1 5u g m 1 ) 和香芹酚( 4 5u g m 1 ) 同时使用比单独使用时 的抗菌作用强。这是由于n i s i n 可影响细胞膜上气孔的数量、大小和开关的时问，香芹酚会使这种 作用增强。也有人认为是香芹酚增加了细胞膜的退化，减少了胞0 j a t v 的生成p 。 食品包装方法对e o s 抗菌效果也有影响，如目前经常采用的气调包装和真空包装都可使e o s 的抗菌作用增效。其中真空包装中，采用低渗透性膜为包装材料时比高渗透膜的抑菌效果更好； 气调包装中，氧的去除可防止e o s 的氧化，同时利用无氧呼吸生存的细菌对e o s 更为敏感，表现 出的抗菌效果更好1 5 ，j 。 1 4e 0 s 用于食品的安全性 欧洲委员会( e u r o p e a nc o m m i s s i o n ) 允许将一些目前被认为对消费者的健康无危害的e o s 成 分( 如香芹酚、香芹酮、肉桂醛、对异丙基甲苯、丁香酚、柠檬烯、薄荷醇、百里香酚等) 用作 9 中国农业大学硕七学位论文 第一章绪论 食品调味料。这